甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系雌性不孕的细胞学研究-硕士论文

分类号： 1830 092 密级： 华中农业大学硕士学位论文 甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系雌性不孕的细胞学研究 C y t o l o g i c a li n v e s t i g a t i o no nt h ef e m a l es t e r i l i t yo fad o m i n a n t -l 1h g e n l cm a l e - s t e r i l e1 1 n ei nl S r a s s i c an a p u s 研究生：韩雪 指导教师：杨光圣教授 专业：作物遗传育种研究方向：油菜细胞学 获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学植物科学技术学院 二0 0 年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 岔 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研魁签名：嘞当 帆加年r 月髟日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的金 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术税密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用予本授权书 靴敝储獭：职别唯钮协坳 签名日期：油和年 月站日 签名日期： 州口年堂月动日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 L f 蓝型油菜 l 性细胞核雄性小育系雌性小孕的细胞学研究 目录 摘要I A B S T R A C T I I I 1 文献综述1 1 1 油菜雄性不育的研究与利用l 1 2 植物雌配子体发育研究进展2 1 2 1 植物花发育的调控机理2 1 2 1 1 花发育的经典A B C 模型3 1 2 1 2 花发育的A B C D 模型4 1 2 1 3 花发育的A B C D E 模型4 1 2 1 4 花发育的四因子模型5 1 3 植物雌配子体的重要作用及雌性不孕的特征5 1 3 1 雌配子体的重要作用5 1 3 2 雌性不孕的特征6 1 4 雌蕊发育的调控因素7 1 5 常用的观察植物胚囊的试验方法8 1 5 1 切片法8 1 5 2 整体透明法9 1 5 3 酶解法9 1 5 4 共聚焦激光扫描显微镜观察法9 1 6 本研究的目的与意义1 0 2 甘蓝型油菜细胞核雄性不育系雌性不孕材料的柱头扫描电镜观察1 l 2 1 甘蓝型油菜显性核不育系雌性不孕材料的获得和鉴定1 1 2 1 1F M l 9 5 A B 的来源和保持1 l 2 1 2 雌性不孕程度的度量ll 2 1 3F M l 9 5 A 中雌性不孕的鉴定和遗传1 2 2 2 甘蓝型油菜雌性不孕材料的标记鉴定和保持1 3 2 2 1 雌性不孕材料的繁殖1 3 2 2 2 杂合型可育株和纯合型不育株的标记辅助选育1 3 2 2 3 杂合型可育株和纯合型不育株的标记辅助选育结果1 4 华中农业人学2 0 1 0 届硕 ：学位论文 2 3 柱头扫描电镜观察1 4 2 3 1 材料及方法1 4 2 3 2 结果与分析1 5 2 4 讨论1 6 3 甘蓝型油菜细胞核雄性不育系雌性不孕材料的花粉管延伸观察18 3 1 材料及方法1 8 3 2 结果与分析l8 3 3 讨论2 l 4F M l 9 5 A B 胚珠发育过程对比2 3 4 1 材料及方法2 3 4 2 结果与分析2 4 4 2 1 甘蓝型油菜F M l 9 5 B 1 和F M l 9 5 B 2 胚珠发育过程2 4 4 2 2F M l 9 5 A 和F M l 9 5 B 胚珠发育过程对照2 8 4 2 3F M l 9 5 A 中F G 5 期胚珠中胚囊的五种主要异常表型3 0 4 2 4 讨论3 3 5F M l 9 5 B 花药与胚珠发育时期对照及F M l 9 5 A 花药发育过程3 6 5 1 材料及方法3 6 5 2 结果与分析3 6 5 2 1 甘蓝型油菜F M l 9 5 B 花药与胚囊发育时期对照3 6 5 2 2F M l 9 5 A 花药发育过程4 0 5 3 讨论4 2 6F M l 9 5 A B 花药减数分裂观察4 4 6 1 材料及方法4 4 6 2 结果与分析4 4 6 3 讨论4 5 参考文献4 8 致谢5 3 计蓝型油菜显性细胞核雄性f i 育系雌性不孕的细胞学研究 捅要 雌雄配子体的J 下常发育、结合和完成双授精过程是被子植物世代交替过程中的 标志事件。在雄配子体发育的过程中，如果出现外在或者内在条件的变化使发育过 程中断，将造成雄性不育。同样情况发生在雌配子发育过程中办将导致雌性不孕。 雌配子体的正常发育对种子的形成尤为重要，一旦发生雌性不孕将不能通过类似雄 性不育利用外来正常花粉进行弥补。因此，在生产中必须避免雌性不孕的发生，否 则将严重影响作物的产量。在对甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育的转育过程中，发 现不育株中雌性结实率都存在不同程度的下降，其中F M l 9 5 A B 1 和F M l 9 5 A B 2 表 现严重雌性不孕。通过对以上材料的柱头形态观察、花粉管萌发实验、石蜡切片观 察花药与胚囊结构、压片法观察花药减数分裂过程等手段，对F M l 9 5 A B 不育株雌 性不孕产生的原因进行了较深入的研究，获得的结果如下： 1 结实率调查表明，在不同遗传背景不育系的不育株中，雌性不孕程度有所差 异，可育株结实完全正常。原始不育系R s l 0 4 6 A B 中不育株的每角果平均种子为5 5 粒，而F M l 9 5 A B 中的绝大多数角果不能结实，极少数只有1 2 粒，二者结实率差 异极显著。而杂合型不育系不育株中每角果粒数显著高于纯合型不育系。 2 雌性不孕不受环境条件影响，雌性不孕只发生在雄性不育株上，表明雌性不 孕极可能是显性核不育基因在雌性和雄性发育途径中的不同表现，或者控制雄性不 育和雌性不孕性状的基因紧密连锁。纯合型不育系和杂合型不育系之间雌性不孕程 度存在差异暗示着该性状与基因的剂量效应有关。 3 扫描电镜观察发现F M l 9 5 A B 可育株和不育株的柱头形态无明显差异。采用 J 下常可育花粉人工授粉四小时后，花粉在可育株和不育株的柱头上均可萌发，说明 不育株雌蕊的柱头不是导致雌性不孕的原因。在F M l 9 5 A B 不育株和可育株的花柱 和子房中，花粉管起初都能正常延伸。但在花粉管进入胚珠的前期，可育株和不育 株中存在明显差异：可育株中花粉管形态正常，通过激光激发是不规则的线状，上 面有箭头状的亮点，花粉管能大量的延伸至胚珠，多条花粉管包裹胚珠；而在不育 株中，花粉管形态异常，花粉管卷曲严重，虽能延伸至胚珠附近，但是花粉管不能 包裹胚珠。 4 对比观察F M l 9 5 A B 中不育株和可育株的胚囊发育过程发现在不育株中，不 孕胚囊存在几种类型，比例各不相同。 5 对F M l 9 5 A B 不育株花药和胚囊的对比观察显示，花药败育发生在花粉母细 华中农业人学2 0 1 0 属硕I ：学位论文 的减数分裂时期，没有观察到四分体的形成，而在同时期的雌蕊胚珠中未发现功 大孢子的形成，且在随后的胚珠发育中，未发现正常的单核胚囊，从而推测不育 的胚珠中减数分裂异常。对花药减数分裂进行观察发现，败育发生在减数分裂的 期。综合上述观察结果表明：不育株内花药和胚珠的败育时期相同，均发生在减 分裂阶段。但在胚珠中，少数胚囊可以逃逸。 根据上述实验结果，推测F M l 9 5 A B 不育株中胚珠减数分裂异常足导致雌性不 产生的根本原因。胚珠发育异常一方面不能形成正常功能的胚囊( 及雌配子体) ， 一方面不能在双受精过程中引导花粉管的正常延伸和进入珠孔，从而导致雌性不 。由于花药和胚珠中雌雄配子体发育异常的相似性，推测雌性不孕和雄性不育均 显性核不育基因M s 造成的结果，暗示着m s 在雌性配子体减数分裂过程中均发挥 重要作用 键词：甘蓝型油菜；雌性不孕；细胞学观察；雄性不育；减数分裂 I I t r 蓝型油菜疆性细胞核雄性不育系雌件1 i 孕的细胞学研究 A B S T R A C T M a l e f e m a l eg a m e t o p h y t ed e v e l o p m e n t ，f u s i o na n dd o u b l ef e r t i l i z a t i o na r ei m p o r t a n t m a r k so fm e t a g e n e s i si nf l o w e r i n gp l a n t s I fs o m eu n u s u a lh a p p e ni ni n t e r n a la n de x t e r n a l c o n d i t i o nd u r i n gt h ec o n t i n u o u sd e v e l o p m e n tp r o c e s so fm a l e g a m e t o p h y t e ，m a l e g a m e t o p h y t ew o u l db es t e r i l e ，a n da l lt h es a m ei nt h ef e m a l eg a m e t o p h y t e T h ef e m a l e g a m e t o p h y t ei s a ne s s e n t i a ls t r u c t u r ef o rs e e d sf o r m a t i o ni nf l o w e r i n gp l a n t s F e m a l e s t e r i l i t yc a n tb em a d eu pb yh e a l t h yp o l l e n s ，S On e e dt oa v o i di na g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o n I nt h es t u d yo fs t e r i l i t yi nd o m i n a n tg e n i em a l e s t e r i l eB r a s s i c an a p u s , w ef o u n dd i f f e r e n t d e g r e e so fp h e n o m e n o no ff e m a l es t e r i l i t ye x p r e s s e di nm a l e - s t e r i l el i n eR s 10 4 6 A Ba n d d e r i v a t i v em a l e s t e r i l el i n e sF M19 5 A B - 1a n dF M19 5 A B 一2 T oo v e r c o m et h i sn e g a t i v e t r a i t ，s t u d yt h ec a u s e so ff e m a l es t e r i l i t yo fm a l e - s t e r i l el i n e ，t h em a i nr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 D i f f e r e n tl e v e l so ff e m a l es t e r i l i t yi nn u m b e r so fm a l e s t e r i l el i n e s ，t h ea v e r a g e s e e dn u m b e r si s 5 5p e rp o di no r i g i n a lm a l e s t e r i l el i n eR s l 0 4 6 A ，t h el e a s ti s1 - 2 ，t h e s e e dr a t e so fb o t hm a l e - s t e r i l el i n e sh a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s T h en u m b e ro fs e e dp e r p o do fh e t e r o z y g o u sm a l e - s t e r i l el i n e si ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nh o m o z y g o u s 2 F e m a l e s t e r i l eo c c u r so n l yi ns t e r i l ep l a n t so fd o m i n a n tg e n i em a l e s t e r i l el i n e s ，i t i s n ti m p a c t e db ye n v i r o n m e n t a l ，t h i sp h e n o m e n o ns h o w sf e m a l e s t e r i l ea n d m a l es t e r i l e a r el i n k e dc l o s e l y , i t Sl i k et h a tt h ed o m i n a n tm a l eg e n ee x p r e s s e st w od i f f e r e n te f f e c t si n d e v e l o p m e n to ff e m a l ea n d m a l e O c c u r r e n c eo ff e m a l e - s t e r i l em a yb ea s s o c i a t e dw i t ht h e d o s a g ee f f e c to fs t e r i l i t yg e n e s 3 S t i g m a so f B r a s s i c an a p u sR s10 4 6 A Ba n dF M19 5 A Bh a v en oo b v i o u sd i f f e r e n c e s P o l l e ng r a i n sa r eg e r m i n a t i n gs o o na f t e rt h e yl o c a t e si nt h es t i g m a ，p o l l e ng r a i n si nt h e s t i g m a s o fB r a s s i c a n a p u sR s 10 4 6 Ba r e g e r m i n a t i n gn o r m a l l y 4 ha f t e ra r t i f i c i a l p o l l i n a t i o n ，i ti n d i c a t e dt h a ta b n o r m a l ep i s t i ls t i g m a si sn o tt h ec a u s eo ff e m a l e s t e r i l e P o l l e nt u b e se l o n g a t ei ns t y l a ra n dg a t h e rn e a r b yt h eo v u l e ss u c c e s s f u l l yi nF M19 5 A B ， t h e r ei s s i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e f o r ep o l l e nt u b e se n t e rt h eo v u l ei nF M l9 5 A B ：t h e m o r p h o l o g yo fp o l l e nt u b e si sn o r m a li n f e r t i l ep l a n t s ，i t Sj u s tl i k ei r r e g u l a rl i n e sw i t h a r r o w s h a p e db r i g h ts p o t ，l o t so fp o l l e nt u b e sg a t h e rn e a r b yt h eo v u l e s ，a n de n w r a p o v u l e s ；b u ti ns t e r i l ep l a n t s ，t h em o r p h o l o g yo fp o l l e nt u b e si sa b n o r m a l ，c o i l e ds e r i o u s ， p o l l e nt u b e sg a t h e rn e a r b yt h eo v u l e ss u c c e s s f u l l y , b u tn o te n w r a p 4 A n a l y z ef e m a l eg a m e t o p h y t ed e v e l o p m e n to fF M 19 5 A Bb e f o r ef e r t i l i z a t i o n ，w e I I I L 华中农业人学2 0 1 0 届坝l j 学位论文 f o u n df i v em a j o rt y p e so fa b n o r m a l i t i e sw i t hd i f f e r e n tp r o p o r t i o ni nt h em a t u r ee m b r y o s a ci nF M l 9 5 A 5 C o m p a r i n gt h ed e v e l o p m e n ts t a g eo fe m b r ) r os a cw i t ht h ea n t h e r , w ef o u n dt h e m e i o s i so ft h em i c r o s p o r o c y t ei sa b n o r m a l ，n o rf o r mt e t r a d I nt h es a m ep e r i o do ft h e p i s t i l ，t h e r e i sn of o r m a t i o no ft h ef u n c t i o n a lm e g a s p o r e ，a n di ns u b s e q u e n to v u l e d e v e l o p m e n t ，t h e r ei sn om o n o n u c l e a re m b r y o ，t h u ss p e c u l a t et h a tm e i o s i si sa b n o r m a li n o v u l e so fs t e r i l ep l a n t s I na n t h e r , e x c e p t i o no c c u r si nt h ep e r i o do fm e i o t i ci n t e r p h a s e T h ea b o v eo b s e r v a t i o ns h o w e d ：a b o r t i o no fa n t h e r sa n do v u l e sh a p p e n e di nt h es a m e p e r i o d ，b o mi nm e i o s i s ，b u ti no v u l e s ，af e w s a cd e v e l o p e dn o r m a l l y B a s e do nt h ea b o v er e s u l t s ，w es p e c u l a t et h a tt h em e i o t i ca b n o r m a l i t i e sl e a d st o f e m a l e - s t e r i l e A b n o r m a lo v u l ed e v e l o p m e n tc o u l dn o tf o r mt h en o r m a lf u n c t i o n a ls a c ，o n t h eo t h e rh a n dc o u l dn o tg u i d et h ep o l l e nt u b ee x t e n s i o na n de n t e ri n t ot h eo v u l e A st h e s i m i l a r i t yo ft h ea b n o r m a ld e v e l o p m e n ti na n t h e r sa n do v u l e s ，s u g g e s t i n gd o m i n a n tm a l e s t e r i l eg e n eM sc a u s e st h em a l ea n df e m a l es t e r i l i t y , i ti m p l i e dm sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l e i nm e i o s i so ft h ef e m a l eg a m e t o p h y t e K e yw o r d s ：B r a s s i c an a p u s ；F e m a l eg a m e t o p h y t es t e r i l i t y ；M o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s M a l es t e r i l i t y ；M e i o s i s I V 廿蕊型油菜礁f l a i l 胞核雄性4 i 育系雌性小孕的细胞学研究 1 文献综述 油菜是重要的油料作物之一，在我国的栽培历史悠久。根据植物学和生物学特 征，把我国栽培生产的油菜品种大致归纳为三种类型：白菜型油菜( B r a s s i c ac a m p s t r i s L ，2 n = 2 0 ) ，芥菜型油菜( B j u c e aL ，2 n = 3 6 ) 和甘蓝型油菜( B n a p u sL ，2 n = 3 8 ) 。其 中，白菜型油菜和甘蓝型油菜在我国种植广泛( 刘后利，1 9 6 4 ) 。选育优质高产、成 熟期适当、易于收获、抗性多样化和适应性强的优良新品种是当前我国油菜育种的 总体目标。针对以上育种目标，存在很多育种方法，其中利用杂种优势选育优质杂 交种应用广泛。杂种优势一般是指杂种在生长势、生活力、抗逆性、繁殖力、适应 性、产量、品质等方面优于其亲本的现象。杂种优势是生物界的普遍现象，几乎所 有的生物都存在杂种优势。近年来，很多作物都利用杂种优势得到大量优质品种， 如2 0 世纪2 0 年代中后期，玉米杂交种就在美国迅速推广。当然不同作物利用杂种 优势时有所偏重，如粮食作物利用籽粒产量为主，蔬菜作物利用营养体的产量优势 为主。另外，很多林木、观赏植物等也已经利用或即将利用杂种优势进行繁种。油 菜育种中利用杂种优势有以下优点：杂种优势强，增产效果好；杂种制种技术简单 易掌握，制种产量高；油菜繁种系数高等。油菜利用杂种优势的途径很多，其中利 用雄性不育性育种，以其方便省时省工省力等众多优势，成为比较理想的利用杂种 优势的育种途径。 1 1 油菜雄性不育的研究与禾I J 用 雄性不育是因为雄性器官发育异常，失去生殖功能，从而导致不育的特征。雄 性不育现象广泛存在于植物界中，水稻、小麦、玉米、棉花、油菜等各种主要农作 物中都发现了雄性不育现象，为杂交育种和杂种优势的利用提供了重要工具。由于 雄性不育现象在育种中的重要作用，近年来对该现象的表现类型及产生机理有较为 深入的研究。 根据雄性不育的发生机理的不同，可将其分为细胞质雄性不育( C M S ) 、细胞核 雄性不育( G M S ) 、核质互作雄性不育、基因型环境互作雄性不育等。细胞核雄性 不育普遍存在与植物界中，已经在很多植物及多个种属杂种中发现了核不育现象 ( K a u l t ，1 9 8 2 ) 。在油菜中，细胞核雄性不育大多是由于自然突变、杂交、诱变和 转基因等因素造成的( 傅廷栋，2 0 0 0 ) 。1 9 4 0 年，盛永俊太郎发现油菜细胞核不育 材料 N o r t i n 3 号，1 9 4 9 年又发现了欧洲油菜核不育。根据不育基因与相对应的可育 华中农业大学2 0 1 0 届硕I j 学位论文 基因的显隐性关系，细胞核雄性不育可分为显性细胞核雄性不育和隐性细胞核雄性 不育。在众多已知的细胞核雄性不育材料中，显性细胞核雄性不育仅占1 2 左右， 隐性细胞核雄性不育居多。 显性细胞核雄性不育可分为以下两种：两对显性基因控制的细胞核雄性不育和 一对复等位基因控制的显性细胞核雄性不育。两对显性基因控制的细胞核雄性不育 受两对独立显性基因M s 和彤互作控制，M s 为不育基因，尽厂为上位抑制基因，尽厂口丁抑 S l i M s 的表达从而恢复育性。不育基因型有胁尬卿胁聊J 卿种，可育基因型有 M s 尽产，耽s 聊翊阳嬲聊s 咖，等7 种。不育株与可育株成对测交后代育性1 ：1 分离，从 而选择得到纯合两型系( M s M s r f r f x M s M s R f r f ) 及杂合两型系( M s m s r f r f m s m s r f r f ) 。 一对复等位基因控制的显性细胞核雄性不育中，恢复系和不育系可育株的抑制基因 ( R 厂) 均与不育基因( 胁) 等位。由此得知：M s 为显性雄性不育基因，R f 为M s 的等 位显性抑制位点，m s 为正常可育位点，并且具有R f M s m s 的显性遗传效应。 隐性细胞核雄性不育受一对、两对或多对基因控制，在我国杂交育种工作中， 常用的隐性核不育的遗传模式有两种：一种为由两对重叠隐性基因控制的细胞核雄 性不育，以及由两对隐性基因和一对隐性上位基因控制的细胞核雄性不育。重叠隐 性基因控制的细胞核雄性不育是由一对等位基因m s l 和m s 2 控制，当基因型为隐性 纯合时表现为不育。m s l 和m s 2 对应的显性基因为M s l 和M s 2 ，当它们其中之一或同 时存在时育性恢复。这种类型的细胞核雄性不育表现稳定彻底，且不受环境影响。 应用于三系配套育种时，容易找到恢复系，但是由于没有完全的保持系，所以只能 利用两型系。两对隐性基因和一对隐性上位基因控制的细胞核雄性不育称为互作型 隐性细胞核雄性不育。1 9 9 8 年，陈凤祥等研究发现9 0 1 2 A 的不育性由两对隐性基因 m s 3 和m s 4 以及一对上位基因矿控制。当基因型为m s 3m s 3m s 4m s a R f R f 和m s 3m s 3m s 4 m s 4 R f r f 时，表现为不育，三对基因纯合隐性时可作临保系，与纯合不育系杂交产生 全不育群体，三系配套育种中不用拔除可育株。 1 2 植物雌配子体发育研究进展 1 2 1 植物花发育的调控机理 被子植物进入生殖生长阶段后，茎顶端的分生组织分化形成花原基或花序原基， 进而形成花或花序，所以，花是一种特化的节问很短的变态枝。花的正常发育是植 物繁衍的基础，一般来讲，一朵完整的花由花托、花萼、花被、雄蕊和心皮五部分 组成。在形态学中，将植物花主要的四种器官( 花萼、花被、雄蕊群和心皮) 所在 2 什蓝型油菜硅性细胞核雄性1 i 育系雌性小孕的细胞学研究 的区域称为轮，由外往罩分别是第l 轮为花萼，第2 轮为花被，第3 轮为雄蕊，第 4 轮为心皮。起初人们对花发育的研究仅仅局限在形态学的进化和生理生化方面， 随着现代遗传学和分子技术的发展并逐渐运用到花器官的研究中，使得花发育的研 究已经达到分子水平。 1 2 1 1 花发育的经典A B C 模型 二十世纪七八十年代以来，科学家对模式植物的研究更加深入，如拟南芥、金 鱼草、矮牵牛、烟草等，其中也包括模式植物花发育的过程。1 9 9 0 年Y a n o f s k y 从拟 南芥中克隆到同源异型基因A G A M O U S ，于是同源异型基因影响及调节花发育成为 研究的热点。1 9 9 1 年，C o e n 和M e y e r o w i t z 通过对拟南芥和金鱼草的研究，提出了 花发育同源异型基因作用的经典A B C 模型。A 功能基因单独控制花萼的发育；A 和 B 功能基因联合控制花被的发育；B 和C 功能基因联合控制雄蕊的发育；C 功能基 因单独控制心皮的发育。A 和C 功能基因相互抑制。在拟南芥中，A P l 和A P 2 为A 功能基因，A P 3 和为B 功能基因，A G 为C 功能基因( T h e i s s e n 等，2 0 0 5 ) 。1 9 9 5 年Y a n o f s k y 提出，若拟南芥中分属基因中的A B C 三类的5 个基因中的任何一个缺 失或突变，都会造成花器官的异常发育，下面逐个分析5 个基因的主要功能、突变 体表型( Y a n o f s k y 等，1 9 9 5 ) ：( 1 ) A P l 基因决定萼片、花瓣原基的发生及花分生组 织的形成；若A P l 基因发生强烈突变，萼片不发育或形成叶状体，花瓣缺失。若 A P l 基因发生较弱突变，萼片发育较正常，花瓣向叶片、雄蕊和心皮方向发展。( 2 ) A P 2 基因与A P l 共同决定萼片和花瓣原基的发生，若A P 2 发生突变，1 4 轮花器官 依次为心皮、雄蕊、雄蕊、心皮。( 3 ) A P 3 基因与共同控制花被、雄蕊的发育， 当P ，基因发生突变时，2 、3 轮花器官变成萼片和心皮，若A P 3 基因强突变，那么 第3 轮花器官会合并发育成一个中央雌蕊。P I 基因的作用与A P 3 完全相同。( 4 ) A G 基因控制雄蕊和心皮的发育，当A G 基因发生强突变，雄蕊发育为花被，而心皮被 重复排列的萼片、花瓣、雄蕊所取代。A G 基因对花芽发育的确定性方面起关键作用， 该基因发生强烈突变时，花发育就丧失了确定性。 除了从基因突变体的表型上可以分析A B C 模型中各基因的功能，随着研究的深 入，科学家通过特异性基因进行转基因来验证这些基因的功能，如通过转基因技术 组成性表达B 功能基因，从转基因植物的表型直观的了解A P 3 和在花被和雄蕊 的发育过程中起调控作用，同时也证明了基因的功能。从而，更加保证了研究的科 学性和准确性。经典A B C 花发育模型是适用于高等真双子叶植物野生型和各种同源 华中农业大学2 0 1 0 届硕l ：学位论文 异型突变体的，但足随着更多与A 、B 、C 基因具有功能相关性的同源异型基因的克 隆，1 9 9 9 年，K r a m e r 提出了A B C 模型在整个被子植物的花器官发育中不是极端保 守的观点( K r a m e r 等，1 9 9 9 ) 。 1 2 1 2花发育的A B C D 模型 在花器官的组成部分心皮中内生胚珠，它是被子植物进行双受精的场所，是形 成种子的物质基础。九十年代，发现了一些胚珠发育异常的突变体，如s i n l 突变体 由于珠被较短，丧失功能，从而影响了雌配子的发育。另外o v m 2 突变体无雌配子 体的形成，o v m 3 突变体无雌配子的形成，另外B E L l 和A P 2 突变体导致胚珠发育异 常，甚至败孕。对于以上基因如何调控组织发育，一直没有明确的解释，直到1 9 9 5 年R e i s e r 提出B E L l 编码一种转录因子的说法，认为该转录因子可促进珠被由合点 端萌生( R e i s e r 等，1 9 9 5 ) ，而b e l l 突变体的内珠被缺失，外珠被表现异常，胚珠 发育晚期外珠被细胞有时发育成心皮状结构。同年，A n g e n e n t 等从矮牵牛中分离到 F 即7 和F B P l l 基因，进一步的原位杂交实验显示，2 个基因在胚珠原基分化之初 在雌蕊中心表达，随着胚珠的发育，杂交信号仅能在胚珠的内部检测到。用反义技 术抑制2 个基因的表达，导致胚珠发生同源异型突变，被花柱类组织取代。用F 卯1 1 做转基因，后代的花萼内侧和花瓣外侧形成了类似胚珠的结构。根据以上实验确认 2 个基因都是决定胚珠中央分生组织发育的特征基因。于是，C o l o m b o 等提出将这 类基因定义为D 组基因的设想，将A B C 模型延伸为A B C D 模型。 将F 即J 做转基因，所得到的植株的花上出现异位的胚珠，且该基因的正常表 达受到影响，形成胚珠的位置被类似心皮的组织取代，所以人们预测D 类基因与C 类基因存在部分的功能重叠( C o l o m b o 等，1 9 9 5 ，1 9 9 7 ；S c h n e i t z 等，1 9 9 9 ) 。S T K 是与F B P l l 同源的D 功能基因，同属于M A D S - b o x 基因家族，且与A G 基因有较近 的亲缘关系和类似的表达模式( T h e i s s e n 等，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ；P i n y o p i c h 等，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 3 花发育的A B C D E 模型 A B C D 模型补充了经典A B C 模型，近乎完美的解释了花器官发育的过程与机理， 通过调控各基因的表达，人为的操作每轮花器官的发育状态成为可能，但是却无法 使叶片转化为花( M i z u k a m i 等，1 9 9 2 ；K r i z e k 等，1 9 9 6 ) 。因此推断，A 、B 、C 、 D 四类基因不能控制植物营养器官向生殖器官转化。为完成这一转化过程，需要其 它基因的参与。1 9 9 7 年，在花分生组织中，F a n 等利用酵母双杂交实验发现A G 家族 4 t r 蓝型油菜! l J l 惟细胞核雄性丌i 育系雌性f i 孕的细胞学研究 基因，即A G L 2 ，A G L 4 和A G L 9 。并通过研究发现，该类基因在B 和C 类基因表达 之前便开始表达。2 0 0 0 年，P e l a z 等发现，A G L 2 ，A G L 4 和A G L 9 基因与花器官特异 性决定有关，3 个基因中的任何一个或两个发生突变时，对花器官的特异性均无明 显影响，只有当3 个基因同时发生突变，所有花器官都发育成花萼。将这类基因重 新命名为S E P I 、S E P 2 、S E P 3 ( F a n 等，1 9 9 7 ) ，并定义为E 基因。E 类基因的发现 对A B C 及A B C D 模型都是极大的补充。 1 2 1 4 花发育的四因子模型 随着花发育模型的不断探索深入发现，各种模型中的各类基因并不能简单的、 直线性、对称性的控制花器官的发育。通过研究表明，A 、B 、C 和S E P 蛋白可能以 复合体形式激活下游基因的表达。通过对基因表达蛋白相互作用的研究，推测复合 体可能以四聚体的形式存在，其在花器官发育中的决定作用如下图所示： 垮片花瓣雄蕊 心旋 鹤岛岛图 熬2 施戮铭鬟褥鹣箍壤榷臻搿。缓缵蟹镌耢霭均渤瑷分缓勃缓羧趱鳓鬟钴镓凌餮。g ；瓣翳镦秘。獭 四聚体模型解释了花器官形成过程中以蛋白复合体的决定作用，虽然丰富了以 上各类模型，但是并不完善，C A L 、A P l 和S E P 3 同样也是决定花萼发育的蛋白复合 体成员之一，在缺失A P l 和S E P 时，C A L 可以维持花瓣的发育，剔除C A L 后，花 器官只剩下雄蕊和心皮状结构( C a s t i l l e j o 等，2 0 0 5 ) 。由此可见，四聚体模型也并 非是花器官发育的理想模型，仍然存在很多问题需要结识。 1 3 植物雌配子体的重要作用及雌性不孕的特征 1 3 1 雌配子体的重要作用 在被子植物有性繁殖的几个重要环节中，雌配子体都发挥关键作用：( 1 ) 花粉管 在花柱上萌发和延伸，雌配子体的内部结构指引花粉管到达胚珠内部( J o h n s o n 等， 2 0 0 2 ；H i g a s h i y a m a 等，2 0 0 3 ) ；( 2 ) 受精过程中，雌配子体中的细胞骨架，协助指 引精细胞分别到达卵细胞和中央细胞( L o r d 等，2 0 0 2 ) ；( 3 ) 受精后，雌配子体中的 表达基因控制种子的开始形成( C h a u d h u r y 等，2 0 0 1 ) ，以及胚和胚乳的发育 f # 中农业人学2 0 l O 届 0 i ! I ：学位论义 ( C h a u d h u r y 等，2 0 0 1 ) 。通过对拟南芥、玉米等作物的研究，发现了雌配子发育各 时期都存在突变体，通过对这些突变体的分析，雌配子体的发育过程、遗传控制机 制的奥秘正慢慢被解开( R a m i n 等，2 0 0 4 ) 。种子植物的生活周期中，经过孢子体向 配子体转变形成了雄配子体和雌配子体，随后卵细胞和精子融合形成受精卵进而发 育成种子，再一次进入孢子体世代，周而复始循环往复( G i f f o r d 等，1 9 8 9 ) ，从而 保证了植物世代稳定遗传。 1 3 2 雌性不孕的特征 雌性不孕广泛存在于种子植物中，如水稻、玉米、油菜、大豆、小麦等。在粮 食和经济作物中，雌性不孕导致产量降低，影响经济效益；在其他作物中，雌性不 孕的存在也会影响种族的繁衍。雌性不孕是指由于雌性器官的异常，导致受精作用 不能正常进行，从而不能形成有功能的种子的现象。植物中雌性器官的发育包括胚 珠的发育和胚囊的形成，胚珠发育的异常( 如珠被的异常发育) 和胚囊的异常( 如 卵细胞败育) 都会最终导致雌性不孕。二十世纪八十年代以来，植物雌性不孕现象 成为科学家们关注的热点。在拟南芥、水稻、烟草、番茄、大豆等多种植物中发现 了雌性不孕的突变体，同时除了自然中天然存在的突变体以外，科学家们为了研究 雌性不孕的起因，通过各种人工手段创造出形态各异的人工突变体。 雌性不孕的成因可以分为以下两种：1 、柱头发育异常影响花粉正常萌发及延伸 从而引起雌性不孕；2 、雌配子体本身发育异常影响受精从而导致雌性不孕。下面对 这两种因素分别举例说明： 1 9 9 4 年，M H S G o l d m a n 等在烟草中发现雌性不孕突变体，该突变体的柱头发育 异常，花粉虽然可以在柱头上萌发，但是不能在花柱中