硕士论文-家蚕Nd裸蛹发生机制的初步研究.doc

摘要 摘要摘要 家蚕裸蛹是自然突变产生的，裸蛹(Nd)基因与丝素重链基因(Fib-H)同位于第 25 染色体上，二者紧密连锁。早期的研究结果认为 Nd 裸蛹的形成主要是发生在转录水 平，但其分子机制尚不清楚。对 Nd 基因进行定位，在此基础上对其进行克隆，研究 裸蛹发生的分子机制，不仅可以为开发利用家蚕生物资源，构建新型的家蚕生物反应 器打下基础，而且对揭示蚕丝蛋白表达分泌的分子机制提供重要的理论依据。 本论文首先利用家蚕雌性不交换的特点，以家蚕正常茧品种 P50 和裸蛹品种 Nd 为亲本获得 P50(P50Nd)和(P50Nd)P50 回交群体（分别记为 BC1M 和 BC1F）， 再用已经构建的家蚕 SSR 分子标记连锁图谱对 Nd 基因进行定位，共筛选出 7 个与 Nd 基因连锁的 SSR 标记。利用另一个群体 BC1M 构建了 Nd 基因的遗传连锁图，连 锁图的遗传距离为 96.8cM，Nd 基因位于 60.8cM。同时得到了 2 个与 Nd 紧密连锁的 SSR 标记，S2511 及 S2513，与 Nd 基因的距离分别为 0.1cM 和 1.1cM。在 KaikoBlast 数据库中搜寻基因组序列信息，经过软件分析这些序列信息可知，Nd 基因与丝素重 链 Fib-H 基因共同位于 Bm_scaf32 中，其中 S2513 与 Fib-H 基因 3端的距离大约为 159 kb，引物 S2511 和 S2513 之间的距离大约为 900 kb，这段距离对于 Nd 基因的定 位克隆来说还是太大，这些数据为以后 Nd 基因的精细定位及克隆奠定了基础。 其次，采用 Real-time RT-PCR 方法，对 3 种丝素基因在 5 龄第 5 天正常家蚕 54A 和 Nd 品种家蚕的后部丝腺中的表达量进行了定量分析。结果表明，与 54A 相比 较，在 Nd 裸蛹的后部丝腺中，fib-H 基因在 mRNA 的表达量被极大地下调，约为正 常蚕的 1/70 左右，而 fib-L 基因和 P25 基因的表达量分别是正常蚕的 1/10 和 1/6 左右。 为了进一步探明原因，我们对 3 种已知的调控蚕丝基因的反式因子的表达水平进行了 定量分析。结果表明，在 5 龄第 5 天的 Nd 裸蛹后部丝腺中，POU-M1 转录因子的表 达水平远远低于正常家蚕中的表达水平，约为正常蚕 54A 的 1/280，而 SGF-1 和 FMBP-1 的表达水平分别约为正常蚕的 1/2.48 和 1/8.44。因此，Nd 家蚕中丝素基因不 能正常表达可能与反式激活因子 POU-M1 的表达量不足有关。 关键词：家蚕；裸蛹基因Nd；SSR定位；实时定量PCR；发生机制 江苏科技大学理学硕士学位论文 Abstract Abstract Naked pupa (Nd) of the silkworm Bombyx mori is originated from a natural mutation. The naked Nd gene and the fibroin heavy (H)-chain gene (Fib-H) had been found to be located at the 25th chromosome and closely linked. The early research results showed that the reason of naked pupa may be caused mainly at transcriptional level，but the molecular mechanism is still unclear. Mapping of Nd gene and studying on the occurring mechanism of Nd，not only good for the exploitation and utilization of silkworm resources and build a new type of silkworm bioreactor, but also can reveal the mechanism of silk protein expressed and secreted. These results can provide an important theoretical basis for silkworm silk too. Owing to a lack of crossing over in females, P50, a silkworm strain that spins normal cocoons, and Nd, a strain with naked pupae, were used as parents to obtain backcross populations P50(P50Nd) and (P50Nd)P50, designated as BC1M and BC1F respectively. Subsequently, mapping of Nd gene was conducted using the constructed simple sequence repeat (SSR) molecular marker linkage maps, and 7 SSR markers were found to be linked with Nd gene. By utilizing another BC1M population, we constructed a genetic linkage map for the Nd gene. The genetic distance of this map is of 96.8 cM with the Nd gene located at 60.8 cM. Meanwhile, 2 closely linked SSR markers, namely S2513 and S2511 which is 0.1 cM and 1.1 cM away from the Nd gene respectively were obtained. We analyzed the genome sequences from Kaikoblast database using the software. From the result we found that the Nd gene and fib-H gene are both in the Bm_scaf32，and the distance between Nd gene and the 3 of fib-H gene is about 159Kb; the distance between S2511 and S2513 is approximately 900Kb，but the distance is too long to clone Nd gene. Secondly, we analyzed the expression of three fibroin genes at the fifth day of fifth instar of 54A and Nd using quantitative real-time PCR method. From the results we found that the expression of fib-H in posterior silk gland of Nd silkworm at transcriptional level was greatly down regulated, it is about the 1/70 level of normal silkworm, while the expression of fib-L gene and P25 gene is 1/10 and 1/6 of that of normal silkworm. In order to verify the reason of it, we analyzed the expression of 3 silk gene controlling transcriptional factors using quantitative real-time PCR method. From the result we found that the expression level of POU-M1 in posterior silk gland of Nd silkworm is lower than in the normal silkworms. But the expression level of the other two factors SGF-1 and FMBP-1 is 1/2.48 and 1/8.44 of 江苏科技大学理学硕士学位论文 normal silkworms. Thus, the fibroin genes abnormally expression is related to the deficient expression of POU-M1. Keywords: Bombyx mori; naked pupa gene (Nd); SSR map; real-time PCR; occurring mechanism 目录 目录 摘要摘要.I ABSTRACT. 第第 1 章章 绪绪 论论.1 1.1 家蚕蚕丝蛋白及相关基因.1 1.1.1 家蚕蚕丝蛋白.1 1.1.2 家蚕蚕丝蛋白基因.1 1.2 家蚕裸蛹突变体.3 1.3 家蚕的基因定位.3 1.3.1 遗传标记及形态学标记定位.4 1.3.2 分子标记定位.4 1.4 SSR 标记定位家蚕基因相关研究.7 1.5 家蚕裸蛹突变体的应用.7 1.6 本文的主要内容.8 第第 2 章章 家蚕家蚕 ND 裸蛹基因的裸蛹基因的 SSR 定位定位.11 2.1 引言.11 2.2 材料与方法.12 2.2.1 实验材料.12 2.2.2 试验方法.15 2.3 结果与分析.18 2.3.1 回交后代的表现型.18 2.3.2 与 Nd 基因连锁的多态性 SSR 标记的筛选及连锁验证.18 2.3.3 BC1M 群体的基因型分析.19 2.3.4 Nd 基因连锁图.19 2.3.5 KaikoBlast 序列分析.20 2.4 讨 论.21 2.5 本章小结.22 第第 3 章章 家蚕丝素基因和三种反式因子在家蚕丝素基因和三种反式因子在 ND 裸蛹后部丝腺中表达的定量分析裸蛹后部丝腺中表达的定量分析.23 3.1 引言.23 3.2 材料与方法.24 3.2.1 实验材料.24 3.2.2 实验方法.26 3.3 结果与分析.28 3.3.1 家蚕组织总 RNA 的提取 .28 3.3.2 Real-Time PCR 中扩增曲线和熔解曲线结果.28 3.3.3 三种丝素基因在 Nd 裸蛹后部丝腺种相对表达量.29 3.3.4 三种丝素基因在 54A 和 Nd 裸蛹后部丝腺种相对表达量的差异.30 3.3.5 三种反式因子编码基因在 54A 后部丝腺中的表达.30 3.3.6 三种反式因子编码基因在 Nd 裸蛹后部丝腺中的表达.31 江苏科技大学理学硕士学位论文 3.3.7 三种反式因子编码基因在 54A 和 Nd 裸蛹后部丝腺中相对表达量的差异.31 3.4 讨论.32 3.5 本章小结.32 结结 论论.35 参考文献参考文献.37 攻读学位期间发表的学术论文攻读学位期间发表的学术论文.43 致谢致谢.44 CATALOGUE Catalogue ABSTRACT (CHINESE).I ABSTRACT (ENGLISH). CHAPTER 1 INTRODUCTION .1 1.1 Silk Fibroin of Bombyx mori and Related Genes.1 1.1.1 Silk Fibroin of Bombyx mori.1 1.1.2 Silk Fibroin Genes of Bombyx mori.1 1.2 Nd Gene and Naked Pupa Mutant of Bombyx mori.3 1.3 Gene Location of silkworm.3 1.3.1 Genetic Markers and Linkage Analysis Using Morphological Markers.4 1.3.2 Molecular Markers Location.4 1.4 Study on the silkworm Related Genes Using SSR Markers .7 1.5 The Application of Naked Pupa Mutant .7 1.6 Main Content.8 CHAPTER 2 MAPPING OF NAKED PUPA GENE USING SSR MARKERS.11 2.1 Introduction.11 2.2 Materials and methods .12 2.2.1 Materials.12 2.2.2 Methods.15 2.3 Results and Analysis.18 2.3.1 Phenotype of Back Cross.18 2.3.2 Polymorphic SSR Markers Linked with Nd Gene and Assuring Linkage Group Nd Gene Using BC1F.18 2.3.3 Genotype of BC1M.19 2.3.4 Mapping of Nd Gene Using BC1M.19 2.3.5 Sequence Analysis of KaikoBlast.20 2.4 Discuss .21 2.5 Summary of Chapter 2 .22 CHAPTER 3 QUANTITIVE ANALYSIS OF THE EXPRESSION OF SILK FIBROIN GENES AND THREE TRANSCRIPTION FACTOR GENES IN PSG OF ND BOMBYX MORI.23 3.1 Introduction.23 3.2 Materials and Methods.24 3.2.1 Materials.24 3.2.2 Methods.26 3.3 Results and Analysis.28 3.3.1 Isolation of total RNA of Bombyx mori.28 3.3.2 Results of amplification curve and melting curve in the Real-time PCR .28 3.3.3 Expression of three three fibrion genes in PSG of Nd.29 3.3.4 The relative expression comparison among three firoin genes in PSG of Nd and 54A.30 3.3.5 Expression of three transcription factor genes in PSG of 54A .30 江苏科技大学理学硕士学位论文 3.3.6 Expression of three transcription factor genes in PSG of Nd.31 3.3.7 The relative expression comparison among three transcription factor genes in PSG of Nd and 54A.31 3.4 Discussion.32 3.5 Summary of Chapter 3 .32 CONCLUSION.35 REFERENCES.37 PAPER DURING MASTERS DEGREE STUDY.43 ACKNOWLEDGEMENT.44 注释表 注释表 英文缩写 英文名称 中文名称 A3 actin 3 肌动蛋白3 AFLP amplification fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性 APS ammonium peroxydisulfate 过硫酸铵 ASG anterior silk gland 前部丝腺 Fib-H fibroin heavy chain 丝素重链蛋白 Fib-L fibroin light chain 丝素轻链蛋白 GAPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 甘油醛三磷酸脱氢酶基因 kD kilo Dalton 千道尔顿 min minute 分钟 Nd naked pupa 裸蛹 MSG middle silk gland 中部丝腺 OD optical density 吸光值 PSG posterior silk gland 后部丝腺 RAPD random amplified polymorphic DNA 随机扩增的DNA多态性 RFLP restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性 rpm revolutions per minute 转/分 SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 SSR simple sequence repeat 简单重复序列 TEMED NNNN-tetramethylethyl 四甲基乙二胺 江苏科技大学理学硕士学位论文 第 1 章 绪 论 1 第第 1 章章 绪绪 论论 1.1 家蚕蚕丝蛋白及相关基因家蚕蚕丝蛋白及相关基因 1.1.1 家蚕蚕丝蛋白家蚕蚕丝蛋白 家蚕（Bombyx mori）是一种具有强大泌丝能力的昆虫。其分泌的蚕丝蛋白主要 是由丝素蛋白和丝胶蛋白组成。丝素蛋白又包括丝素重链（fib-H）、丝素轻链（fib- L）和 Fhx/P25(fibrohexamerin)P25 三种蛋白。丝胶蛋白是一类富含丝氨酸的蛋白，包 裹在丝素的表面，约占茧层质量的 25%，对丝素起到保护和胶粘作用。蚕丝的两种蛋 白主要是由丝腺分泌的，从形态和功能上分为前部、中部和后部丝腺，其中前部丝腺 没有合成和分泌的作用，是丝物质流经的导管；中部丝腺是整个丝腺中最粗大的部分， 其合成分泌的丝胶蛋白占蚕丝蛋白总量的 20-25；后部丝腺是合成分泌丝素蛋白 的场所，丝素蛋白占蚕丝总量的 75-801.1。 丝素蛋白的三种成分fib-H（350 kD）、fib-L（26 kD）和P25的摩尔比为 6：6：1。丝素重链与丝素轻链之间由二硫键连接，形成H-L复合体，该二硫键是由 重链羧基端的第20个半胱氨酸（Cys-c20）与轻链羧基端第172个半胱氨酸（Cys- c172）形成，重链羧基端的其他两个半胱氨酸（Cys-c1和Cys-c4）形成分子内二硫键 1.2,1.3形成复合体H-L；P25蛋白与H-L复合体以二硫键与丝蛋白H链连接，以非共价 键与L链结合,对丝物质的结构稳定性起到关键作用。P25蛋白是一种糖蛋白，其N端 的寡糖链主要是维持H-L复合体结构的完整性。P25蛋白与H-L复合体的结合对丝素蛋 白在内质网中的转运和高效分泌分泌起重要的作用1.4,1.5,1.6。通过对不同裸蛹突变 品种Nd(2)、Nd-s和Nd-sD的研究表明，由H-L复合体的形成对及其与P25亚基的结合对 丝素蛋白的高效分泌非常重要，任何一个亚基缺损都会造成蚕丝分泌量的显著降低 1.4,1.7,1.8。 1.1.2 家蚕蚕丝蛋白基因家蚕蚕丝蛋白基因 家蚕茧丝中的丝素蛋白和丝胶蛋白，包括重链(heavy chain)、轻链(1ight chain)和 P25 蛋白和丝胶蛋白，由家蚕基因组中的丝素基因在后部丝腺细胞中特异性地合成， 丝素基因主要在 PSG 中表达，家蚕丝素基因在蚕食桑期表达，而在眠中处于关闭状 态，此前转录的 mRNA 也被降解，直至五龄丝素基因的表达达到峰值。丝胶基因- 1（Ser-1），是许多丝胶基因中的一个，Ser-1 基因是丝胶蛋白的主要表达基因，主要 在的 MSG 后部区域表达；在 3 龄期与 4 龄期转录作用很微弱，四眠中没有表达，5 江苏科技大学理学硕士学位论文 2 龄期又重新开始表达,并在 5 龄后期转录活性达到一个高水平。家蚕丝素基因和丝胶 基因在表达过程中呈现出来的这种组织细胞特异性和发育阶段特异性，使其成为研究 真核生物基因表达与调控的理想模型1.9,1.10。 重链基因(fib-H)位于第25染色体上，在基因组中以单拷贝形式存在，整个基因长 约17kb，外显子（大小分别为67bp，15750bp）和一个内含子（大小为971bp）。其编 码区中心高度重复、富含GC（约45%），两侧是非重复的5和3端。基因5末端区（- 119-7）是AT富含区（约75%），-30-24区含有5-TATAAAA-3序列，为基本启动 子；CAAT boxes位于-93-85间，上游区（-234-66）和下游区（+156+454）有类似 增强子的作用，可以增强转录1.11,1.12,1.13,1.14。 轻链基因（fib-L）位于第14染色体上，全长为14,626 bp，成熟mRNA长约1.2 kb，含有7个外显子，第1外显子内前部4lbp的区域为非编码区。第1内含子长达8145 bp，占整个基因长度的60.5，其内部有较多的重复序列存在1.15。丝素轻链基因与 重链基因的5侧翼序列具有很强的同源性。此外，两个基因的上游区还存在着大量完 全相同的810 bp的短片段，这些片段中约1/5含有TAAT或TAAA