【硕士论文】APR834H1N1NA基因包装信号对H5N1流.pdf

摘 要 摘 要 摘 要 历史上，全球范围内的流感病毒广泛流行，造成上千万人的死亡和巨大的 经济损失，严重威胁人类的公共安全和社会经济。自 1997 年首例 H5N1 亚型高 致病性禽流感病毒突破种间屏障感染人并致死事件以来，该病毒一直在整个东 南亚地区肆虐，预示有可能出现流感大流行病毒株。疫苗免疫接种是流感防治 的最有效的手段。 在全病毒灭活疫苗株的制备中， NIBRG-14 是世界卫生组织(WHO)推荐使用 的 一 株H5N1流 感 疫 苗 株 ， 其 表 面 抗 原 基 因 来 自 A/Vietnam/1194/2004(H5N1)(VN1194)，但研究表明实验室研究表明 NIBRG-14 的抗原性、免疫原性和鸡胚生长特性均可满足其作为疫苗株的要求，但该疫苗 株在鸡胚中生长不佳， HA 抗原产量通常较低。本研究以 VN1194 毒株的 NA 基因为研究对象，以提高疫苗株产量为目的，证明了包装信号的恢复能够有助 于提高病毒产量。 我们研究发现，在 PR8 背景下，VN1194NA 基因被包装入重组病毒中的效 率仅为正常包装量的 38%-68%， 因此推测有一部分重组病毒为不含有 NA vRNA 的缺陷型病毒粒子.我们在VN1194 NA基因完整 CDS 的5和3两端嵌合 PR8 NA 基因包装信号序列(vRNA 3末端 41bp，5末端 67bp)，通过反向遗传操作成功拯 救了不同HA和NA组合的4株重组病毒， 分别命名为PR8HA-PR8(21/39)VNNA、 PR8HA-VNNA、VNHA-PR8(21/39)VNNA、VNHA- VNNA。 从包装效率分析，RNA 凝胶电泳直观的表明，相较疫苗株，恢复了包装信 号的病毒 NA 基因包装效率有了很大提高。通过荧光定量 PCR，更加精确的从 分子水平证明了包装信号的添加能使 NA 的包装效率从 38%-68%增加到 101%103%，重组病毒中 NA vRNA 的包装效率得到完全恢复。我们以相同 EID50 接种鸡胚，每 12h 取样在 MDCK 进行滴度测定，绘制生长曲线，我们发 现恢复包装信号的病毒在鸡胚的生长滴度提高了 10 倍。从 HA 抗原产量分析， 以相同 EID50 接种鸡胚，通过纯化病毒的 SDS-PAGE，用 BandScan5.0 分析 HA 的含量，结果表明恢复包装信号的病毒其 HA 抗原含量提高了约 2.7 倍。 总之，本文就 PR8 NA 基因包装信号序列对异源 NA 基因的包装效率、重组 毒株的生长特性以及 HA 抗原含量的影响进行了探讨， 为提高 H5N1 流感疫苗株 I 摘 要 II 的产量提供了解决方案，为疫苗的研制提供了新的思路。 关键词：关键词：H5N1 流感流感 疫苗疫苗 包装信号包装信号 病毒生长病毒生长 Abstract Abstract Worldwide pandemic influenza has caused millions and millions death and huge economic loss in human history, which threaten public sanitary and social economy. Since the first report about high pathogenic H5N1 influenza virus transmitted from avian to human and resulted in fatality, the H5N1 has been ravaging all over the south east Asia region. It was indicated that there might be a potential outbreak of flu. The most feasible approach to prevent influenza virus would require safe and effective vaccine against H5N1. NIBRG-14 was one of the H5N1 candidate vaccine viruses recommend by WHO (World Health Organization) to prepare whole virus vaccine, developed with the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes deriving from A/Vietnam/1194/2004(H5N1, VN1194). The antigenicity and immunogenicity of the virus is capable to meet the requirements for vaccine production. However, NIBRG-14 had been reported to yield low titer in embrynated eggs and insufficient amounts of HA antigen. Our study found that the NA vRNA of VN1194 was poorly packaged (38%-68%) into the recombinant viruses with a backbone of PR8 genes, causing the formation of defective virions without the NA vRNA in viral genome. Using recombinant DNA techniques, we constructed a chimeric NA gene with the coding region of VN1194 NA flanked by the packaging signal sequence (vRNA 3end 41bp, 5end 67bp) of PR8 NA. We have rescued four strains of reassortant viruses in different combination which named PR8HA-PR8(21/39)VNNA、PR8HA-VNNA、VNHA- VNNA 、 VNHA-PR8(21/39)VNNA respectively. The Polyacrylamide gel electrophoresis of RNAs showed that the packaging of NA vRNA was enhanced greatly in the recombinant viruses compared with the former candidate vaccine virus. Besides, the more precise Q-PCR results indicated the packaging signal increased the package efficiency of NA gene from 38%-68% to 101%103%. The packaging of NA vRNA was completely restored in the recombinant viruses with the chimeric NA gene. Moreover, we inoculated the four viruses into embroynated eggs with equal EID50 and assayed virus titer in MDCK cell per 12h. From the growth curve we found the recombinant viruses contained the chimeric NA gene replicated better in chicken embroynated eggs than recombinant viruses with wild type NA gene of VN1194, as indicated by a 10-fold increase in virus III Abstract titer. In the end, we analyzed the HA antigen content through SDS-PAGE with the purified virus and the results showed 2.7-fold increase compared with the former virus. In conclusion, the studies explored what special role PR8NA gene packaging signal played on packaging efficiency、 growth characteristics and HA antigen content. These findings suggested a novel strategy to improve the yield of NIBRG-14 in vaccine manufacture. Key words：H5N1 influenza，vaccine，packaging signal，virus growth IV 目录 目 录 目 录 第一章 引言.1 第二章 绪论（禽流感疫苗的研究背景与进展）.2 1.1 流感病毒概述 2 1.2 流感病毒基因组结构与功能2 1.3 流感病毒编码蛋白的结构与功能3 1.3.1 血凝素（Hemagglutinin，HA） 3 1.3.2 神经氨酸酶（neuraminidase，NA） 3 1.3.3 基质蛋白（Matrix proteins, M）4 1.3.4 核蛋白（Nucleoprotein, NP）4 1.3.5 聚合酶（Polymerase）5 1.3.6 非结构蛋白（Nonstructural proteins, NS）5 1.4 流感病毒的复制 6 1.4.1 吸附6 1.4.2 膜融合和脱壳 6 1.4.3 病毒RNA的复制和转录 6 1.4.4 病毒的装配与释放6 1.4.5 流感病毒包装信号7 1.5 流感的发生与危害 7 1.5.1 流感病毒流行历史7 1.5.2 禽流感的发生与危害8 1.5.3 流感病毒的遗传变异9 1.6 流感疫苗10 1.6.1 流感疫苗现状 10 1.7 流感疫苗株10 1.8 反向遗传学11 1.8.1 反向遗传学概述11 1.8.2 流感病毒拯救系统11 1.8.3 流感病毒载体 13 1.9 病毒包装机制 14 第二章 实验材料与方法 .16 3.1 实验材料16 3.1.1 质粒和载体 16 3.1.2 细胞16 3.1.3 流感病毒16 3.1.4 鸡胚16 3.1.5 试剂17 3.1.6 仪器17 V 目录 3.1.7 分析软件18 3.2 实验方法18 3.2.1 重组质粒pPOLPR8 (21)VNNA(39)的构建 18 3.2.1.1 PCR扩增18 3.2.1.2 凝胶回收 19 3.2.1.3 酶切反应 20 3.2.1.4 连接20 3.2.1.5 转化20 3.2.1.6 质粒鉴定 20 3.2.2 病毒拯救20 3.2.2.1 质粒中提 20 3.2.2.2 细胞共培养 21 3.2.2.3 293T+MDCK细胞铺板（六孔板）21 3.2.2.4 12 质粒共转染（35mm皿）21 3.2.3 血凝实验22 3.2.4 病毒鉴定22 3.2.4.1 RNA提取22 3.2.4.2 RT-PCR23 3.2.4.2 T-A克隆24 3.2.5 病毒胚胎半数感染量（EID50）测定24 3.2.6 病毒浓缩纯化 25 3.2.6.1 病毒接种 25 3.2.6.2 病毒浓缩和纯化25 3.2.7 病毒基因组RNA电泳 25 3.2.7.1 3凝胶配制25 3.2.7.2 样品处理 25 3.2.7.3 电泳25 3.2.7.4 染色26 3.2.8 定量PCR测定病毒基因组中NA包装效率 26 3.2.8.1 病毒接种 26 3.2.8.2 病毒RNA提取26 3.2.8.3 反转26 3.2.8.4 荧光定量PCR27 3.2.9 病毒生长曲线 28 3.2.9.1 病毒接种 28 3.2.9.2 感染MDCK细胞28 3.2.9.3 抗体显色 29 3.2.10 PAGE电泳29 3.2.10.1 凝胶配制 29 3.2.10.2 样品处理 30 3.2.10.3 染色和脱色30 第四章 实验结果 .31 4.1 重组质粒pPOLIPR8 (21)VNNA(39)的构建31 VI 目录 4.2 病毒的拯救及鉴定 31 4.3 病毒基因组RNA凝胶电泳32 4.4 荧光定量PCR32 4.4.1 引物效率测定 32 4.5 病毒基因组包装效率34 4.6 病毒血凝价结果 34 4.7 病毒滴定结果 34 4.8 病毒在鸡胚中复制生长曲线的测定35 4.9 噬斑形成36 4.10 HA蛋白含量的测定36 第五章 实验讨论 .38 4.1 实验讨论38 4.2 实验结论39 参考文献.41 附 录.49 致谢.62 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果.63 VII 第一章 引言 第一章 引言 第一章 引言 自 1997 年首次报道 H5N1 亚型禽流感病毒突破种间屏障感染人并致死事件 以来， 该病毒对人类的威胁一直没有解除。 疫苗免疫接种是流感防治的主要手段， 为避免流感大流行的暴发，世界各国都在加大力度进行 H5N1 流感疫苗的研制。 在全病毒灭活疫苗株的制备中， 世界卫生组织(WHO)推荐使用反向遗传操作技术 进行 H5N1 流感疫苗株的拯救，即选择能够在鸡胚中高效生长的 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)(PR8)作为 6 个内部基因的供体，选择具有代表性的 H5N1 流行 株作为 HA 和 NA 表面抗原基因的供体，并敲除 HA 基因 HA1、HA2 裂解位点 处多个连续碱性氨基酸，去除 H5HA 基因的毒力决定位点，以保证疫苗株的安 全性。NIBRG-14，是英国国家生物制品检定所(NIBSC)用该方法制备的一株 H5N1 流感疫苗株，其表面抗原基因来自 A/Vietnam/1194/2004(H5N1)(VN1194)。 实验室研究表明 NIBRG-14 的抗原性、 免疫原性和鸡胚生长特性均可满足其作为 疫苗株的要求，但是在实际生产中该疫苗株的 HA 抗原产量通常较低。当面临流 感大流行疫情时，为保证公共卫生安全，疫苗生产商需要尽最大可能生产最大份 额的疫苗，因此疫苗候选株的产量和抗原含量对于疫苗生产是至关重要的。导致 NIBRG-14产量不高的原因何在？如何提高该疫苗株的产量？这些问题的回答将 对 H5N1 疫苗株的制备和生产具有重大的推动作用。 流感病毒基因组内含有 8 条分节段的 vRNA 片段， vRNA 在核内转录和复制 后， 与 3 个聚合酶蛋白(PB2,PB1,PA)和核蛋白(NP)组成核糖核蛋白复合体(RNP)， 在出核转运蛋白(NEP)的作用下进入胞浆，8 条 vRNA 片段被等摩尔地包装入病 毒粒子中，产生有感染性的子代病毒粒子。关于流感病毒的包装机制有“随机性 包装”和“选择性包装”两种观点，目前有越来越多的研究表明流感病毒基因组 的包装机制为“选择性包装” ，每条基因片段 5和 3末端非编码区和编码区内部 分碱基具有包装信号（packaging signal）的作用。包装信号区域碱基的突变或缺 失会导致基因片段包装入病毒粒子中的效率大大下降， 进而会影响子代病毒的产 生。本研究以 VN1194 毒株的 NA 基因为研究对象，就 PR8 NA 基因包装信号序 列对异源NA基因的包装、 重组毒株的生长以及HA抗原含量的影响进行了探讨， 为提高 H5N1 流感疫苗株的产量提供了解决方案。 1 第二章 绪论 第二章 绪论（禽流感疫苗的研究背景与进展） 第二章 绪论（禽流感疫苗的研究背景与进展） 1.1 流感病毒概述 流感病毒(Influenza virus)属正粘病毒科(Orthomyxoviridae),系负链RNA病毒. 流感病毒由内部的基因组核心和外部的蛋白壳组成，基因组分为 8 个节段，一共 编码 10 个蛋白 HA(hemagglutinin)、NA(neuraminidase)、M1(matrix protein 1)、 M2(matrix protein 2)、 NP(nucleoprotein)、 PB1(polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) 、PA (polymerase acid)、NEP/NS2(nuclear export protein/nonstructural protein 2) (Compans RW,1974)。核心由核糖核酸及核蛋白组成,根据核蛋白与基 质蛋白的抗原性不同可分为 A、B、C 三型。A 型流感病毒最常见，造成的危害 最大，因此是研究的主要对象。根据 influenza A 表面抗原 HA 和 NA 血清型的 不同，又分为 16 个 HA 和 9 个 NA 亚型( Fouchier RA,2005; Webster RG,1992)。 1980 年世界卫生组织（WHO）颁布了流感病毒统一命名法则：型别/宿主/ 分离地点/毒株序号（采样时标本号）/分离年代（HANA 亚型） 。比如 1997 年在 香港分离的第 220 株 H5N1 病毒可命名为：influenza A /chicken/Hong Kong/220/97(H5N1)virus。 典型的流感病毒在电镜下呈球形，直径为 80120nm,平均为 100nm。流感 病毒的包膜来自宿主，由类脂和胆固醇构成，以脂质双层的形式存在。包膜的表 面有许多由 HA、NA 和 M2 组成的放射性突起，M1 蛋白紧贴包膜内层，病毒颗 粒核心由 RNP 复合体(ribonucleoprotein)、聚合酶、以及 NP 组成。病毒粒子的化 学组成为：RNA 1,碳水化合物 58，脂质 20，蛋白质 70( Ada GL,1954; Compans RW,1974; Frommhagen LH,1959)。 1.2 流感病毒基因组结构与功能 Influenza A 基因组包括 8 个不连续的病毒 RNA（virus RNA, vRNA)节段， 根据片段的大小分别以片段 1、2、8 来命名。RNA1 片段编码 PB2 蛋白， RNA2 编码 PB1，RNA3 编码 PA，RNA4 编码 HA，RNA5 编码 NP，RNA6 编码 NA，RNA7 编码 M1 和 M2，RNA8 编码非结构蛋白 NS1 和 NS2（Lamb RA,1983,1989） 。 所有 A 型流感病毒 RNA 片段 5端和 3末端序列高度保守。所有 RNA 片段 的 5端最初 13 个核苷酸序列均为 5-AGUAGAAACAAGG-3，3末端的 12 个核 2 第二章 绪论 苷酸序列均为 5-UCGUUUUCGUCC-3； 末端具有互补性， 可以形成锅柄状结构， 这种结构是病毒 RNA 多聚酶结合 RNA 所必须的(Desselberger U,1980)。在每一 片段靠近 5端 1521 核苷酸处有一保守区，其序列为 PolyU。这一保守区在病 毒 mRNA 合成时是产生 PolyA 的信号。 1.3 流感病毒编码蛋白的结构与功能 1.3.1 血凝素（Hemagglutinin，HA） HA 糖蛋白是构成包膜纤突的主要成分之一，大小约 75KD，是病毒主要的 表面抗原蛋白。HA 在病毒吸附及膜融合过程中起关键作用。新合成未裂解的 HA 称为 HA0，经宿主体内的酶裂解后形成 HA1（328 个氨基酸）和 HA2（221 个氨基酸）2 个亚单位，两者之间的剪切位点为精氨酸。裂解位点的碱性氨基酸 也是病毒毒力的分子基础。 HA 的结合受体是位于宿主细胞膜糖蛋白或糖脂链末端的唾液酸。流感病毒 感染宿主细胞，与细胞表面的特异受体相互作用，通过胞饮作用进入细胞浆，与 酸性溶酶体融合，在 PH 降低（PH5）的时候，HA 的构象发生剧烈变化，介 导膜融合，释放内容物到胞浆( Graves PN,1983; Skehel JJ,1982)。 细胞受体和 HA 受体结合位点的结构， 是决定流感病毒宿主特异性的主要因 素。宿主不同的流感病毒具有唾液酸糖苷键识别特异性。人流感病毒 H3 亚型只 结合于唾液酸寡糖末端的 SA2,6Gal，而禽流感病毒 H3 亚型的 HA 结合于寡糖 末端 SA2,3Gal (78)。这与人呼吸系统上皮细胞主要是 2,6 糖苷键，而禽消化道 上皮细胞主要是 2,3 糖苷键相一致。需要注意的是这种特异性并不是绝对的， 人和禽的细胞通常包括两种糖苷键， 并且流感病毒在某一宿主传代的过程中会发 生突变从而改变受体结合特异性。 HA 在病毒表面以三聚体形式存在，具有亚型和株的特异性，因能凝集红细 胞而得名。HA 在体内能诱导产生保护性的中和抗体，抑制病毒结合靶细胞表面 受体，从而阻断流感病毒感染。流感病毒在自然界进化过程中与细胞受体的亲和 力不断发生着改变。HA 的变异能力很强，是病毒发生抗原漂变的主要原因，也 是流感疫苗设计的主要靶抗原。(John JJ，2002；Skehel JJ,2002)。 1.3.2 神经氨酸酶（neuraminidase，NA） NA 是流感病毒另一个主要表面抗原， 属于 II 型整合膜蛋白。 根据 NA 的序 列比对， 可将9个A型流感病毒的NA亚型分为2个组(N1, N4, N5, N8 和N2, N3, 3 第二章 绪论 N6, N7, N9) ( Fouchier RA,2005)。 A 型流感病毒 NA 是同源四聚体， 由头和茎组成， 具有高度保守的胞质尾区， 它的疏水跨膜区，能够为头茎区提供锚定位点。每一个单体都由 6 个相同拓扑结 构的sheet 以螺旋的方式组成。 George Hirst 第一次发现 NA