ELISA法测定牛奶中黄曲霉毒素M1不确定度评定.pdf

第 6 卷 第 4 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 6 No. 4 2015 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr. , 2015 *通讯作者: 翟晓瑞, 硕士, 主要研究方向为食品安全检测。E-mail: liyan1983.love *Corresponding author: ZHAI Xiao-Rui, Master, Mengniu Dairy (Taiyuan) Co., Ltd., Tanghuai South Road, Xiaodian Distict, Taiyuan 030032, China. E-mail: liyan1983.love ELISA法测定牛奶中黄曲霉毒素M1不确定度评定 翟晓瑞*, 卫方方, 李 燕, 张云鲜 (蒙牛乳业(太原)有限公司, 太原 030032) 摘摘 要要: 目的目的 本实验对酶联免疫法检测牛奶中黄曲霉毒素 M1含量的测定结果进行不确定度的评定, 确保检 测结果的准确性及可靠性。 方法方法 实验分析了酶联免疫法测定牛奶中黄曲霉毒素 M1的不确定度的分量及其来 源, 并通过计算各分量的不确定度得出检测结果的合成标准不确定度。 结果结果 酶联免疫法测定牛奶中黄曲霉毒 素 M1的浓度为 45.741 pg/mL, 扩展不确定度为 11.704 pg/mL, 置信水平 P=95%, k=2。结论结论 不确定度的主要 来源为测量的重复性、试剂盒的灵敏度、标准曲线拟合, 而酶标仪测定 OD 值、ELISA 法操作过程中导致的不 确定度可以忽略不计。选用酶联免疫法检测黄曲霉毒素 M1时增加平行样的测定、注意试剂盒的灵敏度、保持 标准曲线的稳定性对于提高酶联免疫法检测的准确性和可靠性具有较强的实用价值。 关键词关键词: 乳及乳制品; 不确定度; 黄曲霉毒素 M1; 酶联免疫法 Uncertainty evaluation for determination of Aflatoxin M1 in milk by enzyme-linked immunoassay ZHAI Xiao-Rui*, WEI Fang-Fang, LI Yan, ZHANG Yun-Xian (Mengniu Dairy (Taiyuan) Co., Ltd., Taiyuan 030032, China) ABSTRACT: Objective The uncertainty of the detection results of Aflatoxin M1 in milk by enzyme-linked immunoassay was evaluated, which ensured the test results accurate and reliable. Methods The uncertainty component and the source for determination of Aflatoxin M1 in milk by enzyme-linked immunoassay (ELISA) was analyzed. According to the calculation of each component of uncertainty, combined standard uncertainty of detection results was calculated. Results It showed that the content of Aflatoxin M1 in milk by ELISA was 45.741 pg/mL and the expanded uncertainty was 11.704 pg/mL(P=95%, k=2). Conclusion Main source of uncertainty included repeatability, the sensitivity and standard curve fitting. The uncertainty of determination of OD by Microplate Reader and the operation process of ELISA method could be negligible. Increasing the parallel determination, noting the sensitivity kit and maintaining the stability of the standard curve for testing Alfatoxin M1 in milk by ELISA showed a strong practical value which could improve the accuracy and reliability. KEY WORDS: milk and dairy products; uncertainty; aflatoxin M1; enzyme-linked immunoassay 1 引 言 黄曲霉毒素 M1(aflatoxin M1, 缩写 AFM1)分子式 为 C17H12O7, 分子量为 328, 熔点 299 , 长方形片 状无色结晶, 不溶于石油醚、正己烷、乙醚等非极性 溶剂, 溶于多种有机溶剂, 如乙腈、氯仿、甲醇和水 等。该物质理化性质稳定, 巴氏消毒法无法破坏其结 构, 365 nm 紫外光照射下会产生蓝紫色荧光。 1518 食品安全质量检测学报 第 6 卷 AFM1具有强的致癌性和致基因突变性, 毒素仅 次于黄曲霉毒素 B1, 急性毒性和黄曲霉毒素 B1类似, 世界卫生组织(WHO)已经将其列为 IIB 类致癌物1,2。 当 AFM1进入人体后, 对肝脏、肾脏、血液和鸡肉等 有不同程度的破坏, 值得注意的是 AFM1对肝脏和肾 脏的危害是最大的, AFM1和乙肝病毒共同作用于肝 脏时其风险会成倍增加, 导致肝癌的发生3, 4。近年 来, 世界各国纷纷制定了乳和乳制品中 AFM1的限量 标准, 其中, 在欧盟 AFM1的限制标准, 牛奶和奶粉 中的黄曲霉毒素 M1含量被限制在 0.05 g/kg。在中 国, AFM1的最高值为 0.5 g/kg。 本研究选用酶联免疫法(ELISA)测定牛奶中黄曲 霉毒素 M1的含量, 采用 JJF 1059-1999测定不确定 评定与表示对其结果进行不确定的分析5-8。目 的在于分析不确定度的来源并对其量化, 有助于 检测人员关注检测关键环节, 提高检测结果的准确 性9, 10。 2 材料与方法 2.1 仪器和材料 高速冷冻离心机(Neofuge 15R, 上海力申科学仪 器有限公司), 酶标仪(Multiskan MK3, 赛默飞世尔 上 海 仪 器 有 限 公 司 ), 10100 L 单 道 移 液 器 (Dragon-Lab), 20200 L多 道 移 液 器 ( 德 国 Transferpette), 黄曲霉毒素 M1试剂盒(96 孔/盒, 荷兰 EuroProxima)。 2.2 方 法 2.2.1 检测原理 AFM1 EIA 微孔板含 12 个板条, 每个板条有 8 孔, 孔底包被与特异性抗体(鼠抗 AFM1)。在第一次 孵育过程中, AMF1标品或样品加入到预包被的微孔 中, 存在于标品中或样品中游离的 AFM1被特异性抗 体牢固的结合在板条上。洗板后, 加入 AFM1酶结合 物, 酶结合物和剩余的特异性抗体结合, 第二次孵育 后, 洗板除去未结合的酶标记物。加入底物后, 酶结 合物将色原底物转化成蓝色的产物, 加入终止液终 止反应, 颜色由蓝色变成黄色, 在 450 nm 下测定吸 光度值, 样品中 AFM1的浓度与吸光度值呈反比。 2.2.2 样品处理 牛奶经混匀后, (28) , 3000 g 离心10 min, 取 上清液进行检测, 具体测定步骤如下: (1) 滴加100 L 各标准品/样品于各板孔中, 封 板, 摇板1 min, 室温避光孵育1 h。 (2) 洗板, 将微孔板中的液体甩去, 并在拍板纸 上拍干, 重复洗涤34次。 (3) 滴加100 L 酶结合物于各板孔, 封板, 摇板 1 min, 室温避光孵育30 min。 (4) 洗板, 将微孔板中的液体甩去, 并在拍板纸 上拍干, 重复洗涤34次。 (5) 滴加100 L底物溶液于各板孔, 室温避光温 育30 min。 (6) 滴加100 L 终止液于各板孔, 立即读取450 nm 吸光度值。 3 结果与分析 3.1 测量样品的重复性引入的不确定度 对同一样品按上述方法重复测定5次11,12, 测定 结果见下表。 表 1 样品重复测定结果(n=5) Table 1 Results of samples repeated determination(n=5) 编号 单次测 得结果 (pg/mL) 测得结果 平均值 (pg/mL) 标准偏 差 (pg/mL) 标准 不确 定度 相对标 准不确 定度 U1 1 53.28 50.70 2.33 1.040.0205 2 48.16 3 52.69 4 50.80 5 48.56 3.2 实验过程引入的不确定度 3.2.1 环境引起的标准不确定度 温度为20 时水的膨胀系数为2.1104 /, 实 验室温度在(203) 的范围内波动, 按照均匀分 布13,14, 加样100 L 时由温度效应引起溶剂体积变 化 的 标 准 不 确 定 度 为 4 3( ) 100 3 2.1 10 / U T 2 3.637 10 L。 3.2.2 移液器容量误差引入的标准不确定度 10100 L单道移液器加100 L的标准品或样品, 100 L 酶结合物, 100 L 显色剂, 100 L 终止液, 查 JJG 646-2006移液器检定规程15可调移液器在100 第 4 期 翟晓瑞, 等: ELISA 法测定牛奶中黄曲霉毒素 M1不确定度评定 1519 L 检定点的容量允许误差为2.0%, 按均匀分布计 算1, 标准不确定度为 2 3( )0.02/1.155 10 U R L。 3.2.3 移液器加样产生的不确定度 U(T)和 U(R)相互独立, 故由移液器容量误 差和温度效应引入的标准不确定度为 ( ) U P 222 22 2 ( ) ( )(3.637 10)(1.155 10)U TU R 2 3.816 10 L。 本次实验过程中共有4步加样过程, 都为100 L, 且相互独立, 故加样过程中引入的标准不确定度为 222 2 ( )4 ( )4 (3.816 10 )7.632 10 U PUT L。 移液器加样过程中引入的相对标准不确定为 24 2 ()/ 4007.632 10/ 4001.908 10 UU P。 3.3 酶标仪测定 OD 值引入的相对标准不确定度 酶标仪计量检定证书上标明的吸光度示值误差 为0.008A, 按矩形分布考虑16, 其相对标准不确定 度为 3 3 0.008/ 34.619 10 U L。 3.4 试剂盒引入的不确定度 本实验所用试剂盒的灵敏度为6 pg/mL, 按均匀 分布考虑17, 其标准不确定度为( )6/(23)U S 1.732 pg/mL。 相对标准不确定度为 4 ( )/141.732/14UU S 0.124。 3.5 标准曲线拟合的不确定度 ELISA 法测定牛奶中 AFM1含量的测定结果见 表 2。用 Y 轴上的标准品最大吸光值与对数 X 轴上 的 AMF1的当量浓度(pg/mL)构建曲线。待测样品浓 度可以从曲线上得出, 再乘以其相应的稀释倍数即 为样品中 AMF1的含量, 该实验中标品和样品都为平 行样。 从表 2 的数据分析得出, 线性回归方程 Y= 1.26120.1889X, 其中a=1.2612, b=0.1889, R2=0.9897。将待测样品的平均吸光度值百分比带入 线性回归方程得出待测样品中 AFM1浓度的对数值 为 3.823, 浓度为 45.741 pg/mL。 回归直线的标准偏差为 1 2 () ( )=0.018 2 n ii i YabX S Y n 表 2 酶联免疫法测定牛奶中 AFM1结果 Table 2 The results of determination of AFM1 in milk by ELISA 编号 浓度 (pg/mL) 吸光 度值 B/B0(%) 浓度对数值 Xi 标品 1 0 1.481 100 标品 2 6.25 1.311 88.5 1.833 标品 3 12.5 1.201 81.1 2.526 标品 4 25 1.006 67.9 3.219 标品 5 50 0.768 51.9 3.912 标品 6 100 0.539 36.4 4.605 标品 7 200 0.399 26.9 5.298 待测样品 0.798 53.9 标准曲线拟合引入的标准不确定度为 0 i 2 2 1 ()( )11 U(C)=0.0733 () n i XXS Y bpn XX 式中: P: 样品溶液的测定次数, p=2 n: 标品溶液的测定总次数, n=12 a: 校准曲线的截距, a=1.2612 b: 校准曲线的斜率, b=-0.1889 X0: 由校准曲线方程求得的样品溶液中 AFM1 的浓度的对数值 Xi: 标准溶液中 AFM1的浓度对数值 Yi: 单次标准溶液吸光度百分比 S(Y): 校准曲线的标准差 X: 标准溶液中 AFM1浓度对数值的平均值 | 0.0733| 0 ()e1.076 U C pg/mL 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度 50 ()/45.7411.076/45.7410.0235UU C。 4 合成标准不确定度 将实验所得结果合并, 合成标准不确定度为 22222 45.74112345UUUUUU 5.852pg/mL。 5 扩展不确定度 扩展不确定由合成标准不确定度乘以包含因子, 取置信水平 95%, 包含因子为 2, 可得扩展不确定度 25.852 211.704UU pg/mL。 1520 食品安全质量检测学报 第 6 卷 6 测量不确定度的报告 样品中 AFM1的测定结果表示为 X=(45.741 11.704) pg/mL, 置信水平 P=95%。 7 结论 本实验检测样品中 AFM1的结果为(45.741 11.704) pg/mL, k=2。 从实验数据分析可知不确定度主 要来源于测量的重复性、试剂盒的灵敏度、标准曲线 拟合、酶标仪测定 OD 值、ELISA 法操作过程。其中 导致不确定度主要来源是: 测量的重复性、试剂盒的 灵敏度、 标准曲线拟合, 而酶标仪测定 OD 值、 ELISA 法操作过程中导致的不确定度可以忽略不计。 结论表 明, 在实际的检测工作中, 增加平行样的测定、注意 试剂盒的灵敏度、保持标准曲线的稳定性对于提高 ELISA 检测的准确性和可靠性具有重要的指导意义。 参考文献 1 Rastogi S, Dwivedi PD, Khanna SK. et al. 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