萝卜甘蓝双二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究-硕士论文

分类号： 华中农业大学硕士学位论文 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育性的遗传 及细胞学研究 T h e h e r e d i t ya n dc y t o l o g i c a ls t u d yo nm a l es t e r i l i t yi n a m p h i d i p l o i db e t w e e nR a p h a n u ss t a t i v u s a n dB r a s s i c aa l b o g l a b r a 研究生：樊志明 指导教师：吴江生教授 。刘克德教授J U l p 丁人扶 专业：作物遗传育种 获得学位名称：农学硕士 研究方向：油菜遗传育种 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学植物科学技术学院。 二。一。年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密霉 如需保密，解密时间年月日 独创- 陛声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 鲷志6 飒 时间： 童历年莎月 肜日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者张蔹志氓导师始猱、磋 签名日期：知石年歹月o 日 签名日期二少厂D 年衫月6 日 注；请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 萝卜甘蓝双二倍体雄性f i 育性的遗传及细胞学研究 目录 摘要I A b s t r a c t I I 1 文献综述1 1 1 植物远缘杂交的研究现状1 1 1 1 萝b 属与芸薹属杂交研究现状2 1 1 2 萝b 芸薹远缘杂交的应用前景3 1 2 远缘杂交与雄性不育4 1 2 1 远缘杂交产生雄性不育的机理4 1 3 油菜雄性不育与杂种优势的利用4 1 3 1 细胞质雄性不育的研究5 1 3 2 细胞核雄性不育的研究7 1 4 油菜雄性不育的细胞学研究7 1 4 1 拟南芥花药发育的过程8 1 4 2 油菜雄性不育的败育时期及特点1 0 1 4 3 花药的绒毡层细胞异常与雄性不育1 2 1 5 油菜雄性不育的分类标准1 2 2 本研究的目的及意义1 5 3 材料与方法1 6 3 1 试验材料。l6 3 2 方法1 6 3 2 1 实验群体的构建1 6 3 2 2 萝b 甘蓝双二倍体的植株形态观察1 6 3 2 3 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育系的花器形态观察16 3 2 3 遗传分析16 3 2 4 花粉活力的测定1 6 3 2 5 花药石蜡切片材料的制备：1 7 4 结果与分析1 9 4 1 萝卜甘蓝双二倍体的植物学形态特征_ 。1 9 4 1 1 萝b 甘蓝双二倍体的叶片形态特征1 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 4 1 2 萝卜甘蓝双二倍体的花器形态特征1 9 4 1 3 萝卜甘蓝双二倍体的角果形态特征2 0 4 2 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育系的花蕾及花器形态特征2 1 4 2 1 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育系的花蕾特征2 1 4 2 2 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育系的花器形态特征。2 1 4 3 花粉活力。2 2 4 4 不育性的遗传2 3 4 5 花药发育的细胞学特征2 4 4 5 1 可育花药发育的细胞学特征2 4 4 5 2 不育系8 1 0 9 花药发育的细胞学特征2 5 5 讨论3 0 5 1 创建新型不育材料的意义。3 0 5 2 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育系8 1 0 9 不育类型的判定3 0 5 3 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育系8 1 0 9 败育时期及败育特点3 l 5 4 绒毡层在花粉败育中所起的作用31 参考文献3 3 致谓十。4 0 萝b 甘蓝双二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究 摘要 植物远缘杂交是作物育种、种质资源创新和新型不育材料创建的一条重要途径。 芸薹属植物是一个遗传类型极其丰富、用途广泛的物种。前人已经做了大量关于芸 薹属与萝b 属、白芥属、二行芥属及芸薹属内种间远缘杂交的研究工作，创造了一 大批油菜、蔬菜新品种和不育系。 在本研究中，以萝b 与甘蓝远缘杂交获得的萝b 甘蓝双二倍体及其不育系8 1 0 9 为实验材料，观察其植物学性状，研究不育系的遗传特性及花药发育，取得的主要 结果如下： 1 ) 萝卜甘蓝双二倍体在植物学形态上有别于母本萝卜和父本甘蓝，介于亲本之 间。萝b 甘蓝双二倍体基叶表现为裂叶、顶叶大而圆、叶片表面光滑、有少量腊粉； 花器官发育正常，花型偏向父本甘蓝，花瓣比亲本大，呈白色；角果形态呈两截， 上半部分外部形态与萝b 角果相似，木质化严重，不容易开裂，下半部分与甘蓝角 果相似，荚果皮较薄，容易开裂。 2 ) 不育系8 1 0 9 花器官发育不正常，表现为死蕾，雄蕊短缩，花药为乳白色， 且呈三角状，未见花粉存在。 3 ) 通过花粉活力检测和田间套袋自交检测，发现不育系8 1 0 9 败育彻底、稳定 遗传；通过测交实验，发现2 个恢复系8 0 2 4 和8 0 5 7 ，但没有找到保持系。 4 ) F 2 代可育株与不育株的分离比为3 ：1 ，B C l 代可育株与不育株的分离比为 1 ：1 ，符合一对隐性基因的分离比例，表明此不育性受一对隐性基因控制。 5 ) 石蜡切片观察结果表明，不育系8 1 0 9 花粉败育发生的关键时期在四分体至 单核期，此时绒毡层出现多层细胞及液泡化现象；随着时间的推移，不育花药绒毡 层液泡化现象逐渐加重，绒毡层细胞表现为扩大、不育小孢子没有花粉外壁，在小 孢子单核晚期，绒毡层与小孢子一起解体，直至形成空的花粉囊。 关键词；远缘杂交；双二倍体；雄性不育；花器形态；遗传分析；细胞学 华中农业大学2 0 1 0 届硕一卜研究生学位论文 A b s t r a c t D i s t a n th y b r i d i z a t i o ni sa l li m p o r t a n t s t r a t e g yf o rp l a n tb r e e d i n g ，g e r m p l a s m e n h a n c e m e n ta n dn o v e lm a l es t e r i l el i n e s c r e a t i n g B r a s s i c ai n c l u d ea b u n d a n ta n d e x t e n s i v e l yu s e dg e n e t i ca c c e s s i o n s G r e a te f f o r t so fi n t a r s p e c i e sc r o s si nB r a s s i c aa n d i n t e r s p e c i e sc r o s sb e t w e e nB r a s s i c aa n dR a p h a n u s ，S i n a p i e ，D i p l o t a x i sh a v eb e e nm a d e ， c r e a t i n gm a n yn e w v a r i e t i e so rm a l el i n e so fr a p e s e e da n dv e g e t a b l e s I nt h i ss t u d y , t h em o r p h o l o g i c a lf e a t u r e so fa m p h i d i p l o i db e t w e e nR a p h a n u ss a t i v u s a n dB r a s s i c aa l b o g l a b r aw a so b s e r v e d I na d d i t i o n ，t h eh e r e d i t ya n dc y t o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fm a l es t e r i l i t yl i n e810 9d e r i v e df r o mt h i sa m p h i d i p l o i d sw e r es t u d i e d T h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 11T h ea m p h i d i p l o i dw a sm o r p h o l o g i c a l l yd i f f e r e n tf r o mi t sp a r e n t s T h e r ew e r ec l e f t l e a v e sa tb a s e ，a n dt h ep a r i e t a ll e a v e sw e r el a r g ea n dr o u n dw i t has m a l la m o u n to f w a x p o w d e r , o fw h i c hs u r f a c eW a ss m o o t h ；T h ef l o r a lo r g a nd e v e l o p e dn o r m a l l y , s i m i l a rt o p a t e r n a lB r a s s i c aa l b o g l a b r a ，b u tw i t hw h i t ea n dl a r g e rp e t a l sc o m p a r e dt op a t e n t s ；T h e p o ds h o w e dd u m b b e l l l i k e ，t h ee x t e r n a lm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fw h i c h i nt o ph a l f w a ss i m i l a rt oR a p h a n u ss t a t i v u sp o dw i t hs e r i o u sl i g n i f i c a t i o na n dc r a c k i n gd i f f i c u l t l y O nt h ec o n t r a r y , t h es k i no fl o w e rp a r to fp o dW a st h i n n e ra n de a s yt oc r a c k ，t h a tw a s s i m i l a rt oB r a s s i c aa l b o g l a b r a 2 ) T h em a l es t e r i l i t yl i n e8 10 9s h o w e ds o m ea b n o r m a lp h e n o t y p e s ，s u c ha sd e a d b u d s ，s h o r ts t a m e n s ，w h i t ea n dt r i a n g u l a ra n t h e ra n dn o n p o l l e n 3 ) T h r o u g ht h ep o l l e nv i a b i l i t yt e s t ，s e l f - p o l l i n a t i o nt e s t ，a n do t h e rm e t h o d s ，w e f o u n dt h em a l es t e r i l i t yl i n e810 9i ss t e r i l ec o m p l e t e l y T h em a l es t e r i l i t yl i n e810 9h a d b e e nc r o s s e dw i t ho t h e rv a r i e t i e s ，a n dt w or e s t o r e rl i n e s8 0 2 4a n d8 0 5 7w e r ef o u n d 4 1T h eF 2p o p u l a t i o ns e g r e g a t e da ta3 ：1r a t i of o rf e r t i l i t y s t e r i l i t y , a n dt h eB C I p o p u l a t i o ns e g r e g a t e d a tal ：1r a t i of o rf e r t i l i t y s t e r i l i t y , f o l l o w i n gt h es e g r e g a t i o n p r o p o r t i o no fas i n g l er e c e s s i v eg e n e T h e s er e s u l t ss u g g e s t e d t h a tt h ef e r t i l i t yW a s c o n t r o l l e db yas i n g l er e c e s s i v eg e n e 5 ) T oo b s e r v et h ed e v e l o p m e n t a ld i f f e r e n c e sb e t w e e nm a l ef e r t i l ea n dm a l es t e r i l e a n t h e r s ，m i c r o s c o p i co b s e r v a t i o no na n t h e rd e v e l o p m e n t p r o c e s so ff e r t i l ea n dm a l e s t e r i l ea n t h e r sw a sp e r f o r m e dw i t hp a r a f f i ns e c t i o n s T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ek e ys t a g e o fm a l es t e r i l i t yW a sf r o mt e t r a dt om i c r o s p o r e s A tt h i ss t a g e ，m a n yl a y e r sc e l la p p e a ro n t a p e t u m W i t ht h ed e v e l o p m e n to fm i c r o s p o r e ，t h et a p e t u mo fm a l es t e r i l ea n t h e re n l a r g e d I I 萝卜甘蓝双_ 二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究 r a d i a lw i t han u m b e ro fl a r g e rv a c u o l e s ；t h es u r f a c eo fm a l es t e r i l em i c r o s p o r ew a s s m o o t hw i t h o u te x i n ef o r m a t i o n T i l lt h es t a g eo fl a t e r m i c r o s p o r e ，t a p e t u m a n d m i c r o s p o r e sw e r ed i s a g g r e g a t e dt ob ea ne m p t yp o l l e ns a c K e yw o r d s ：D i s t a n th y b r i d i z a t i o n ；A m p h i d i p l o i d ；M a l es t e r i l i t y ；M o r p h o l o g yo ff l o w e r ； G e n e t i ca n a l y s i s ；C y t o l o g y I I I 萝卜甘蓝双- 二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究 1 文献综述 远缘杂交是指不同种、属或亲缘关系更远的物种间的杂交。远缘杂交是培育新 品种的一个重要手段，它可以打破不同种、属之间的隔离，使不同的种属的基因之 间可以发生渐渗和交流，从而使两个或多个物种在长期的自然选择或人工选择中保 存下来的有益基因积累起来，从而形成新的物种。远缘杂交后代再经过染色体加倍， 可以形成生命力更强，对人类更有利的新物种。在植物中，远缘杂交是高等植物基 因组进化的和新物种形成的主要动力之一，同时远缘杂交也是创造雄性不育的重要 途径。远缘杂交作为一种可以使原本存在种属隔离的两种或更多种物种发生遗传物 质交换的方法，在丰富种质资源、培育新品种中得到了广泛的应用。 1 1 植物远缘杂交的研究现状 近几十年来，远缘杂交已经被广泛应用于水稻、小麦、玉米、棉花、油菜等农 作物中，并取得了重大成就( 张国庆等，2 0 0 1 ) 。在远缘杂交的利用中，最经典的的 例子是普通小麦( A A B B D D ) 与黑麦( R R ) 杂交，F l 经染色体加倍育成八倍体小黑 麦( A A B B D D R R ) ；硬粒小麦( A A B B ) 与黑麦( R R ) 杂交，F l 经染色体加倍而成 六倍体小黑麦( A A B B R R ) ，除此之外还有小麦与偃麦草合成的小偃麦；小麦与山羊 草合成的小山麦；小麦与簇毛麦合成的小簇麦等新物种( 郑殿升等，2 0 0 2 ) 。这些小 麦新物种在生产上具有很大的价值。从狭义上讲水稻的远缘杂交，指的是栽培稻与野 生稻之间的杂交( A 基因组与非A 基因组之间的杂交) ( 王爱云，2 0 0 5 ) 。野生稻是 一个丰富的优良基因宝库，据统计在2 1 个野生稻物种中已经鉴定出包括强节间伸长 能力、早熟、优质大粒、大花药、柱头外露、长柱头、高产量、高蛋白含量等2 0 多 个优良的性状。通过栽培种和野生种之间的远缘杂交，可以将这些有利基因转移到 水稻的栽培种中，另外还可以从野生种中获得如抗病性和对恶劣环境适应性等优良 性状。颜辉煌等( 1 9 9 7 ) 采用远缘杂交与胚挽救技术相结合的方法把紧穗野生稻( D e i c hi n ge r i ，C O ) 的褐飞虱抗性、小粒野生稻( O mi n ut a ，B B C C ) 的稻瘟病的抗性 和白叶枯病抗性等成功地转移到了栽培稻中，为栽培稻的高产做出了重大贡献。 自从K a j a n u s ( 1 9 1 7 ) 报道了甘蓝型油菜与芜菁的种间杂交结果以来，人们对新 的种质资源的需求不断增加。芸薹属的各个种之间和芸薹属作物与十字花科的白芥 ( S i n a p i e ) 、二行芥( D i p l o t a x i s ) 、萝b ( R a p h a n u s ) 、独行菜( L e p i d i u m ) 、芝麻菜 ( E r u t i c a ) 和海甘蓝( C r a m b e ) 等属间的远缘杂交已经相继开展开来并育成了一大 批蔬菜新品种和油菜新类型。世界各国通过远缘杂交育成的油菜新品种和新类型包 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 括具有丰产性状、优良品质性状( 如黄籽) 、特殊抗病基因和自交不亲和性等特征的 各种新品种类型。另外，还从黑芥花椰菜、芥菜型油菜甘蓝型油菜、墙生二行芥 白菜型油菜等杂交组合中产生了细胞质雄性不育系，并通过属间杂交把萝b 中的 细胞质雄性不育基因转移到了芸薹属的油菜和甘蓝中。孟金陵( 1 9 8 7 ，1 9 9 0 ) 从甘 蓝型油菜埃塞俄比亚芥后代中选育出了甘蓝型细胞质雄性不育系N E 3 9 3 ，其不育 株率1 0 0 。另外，通过种间远缘杂交也产生了新的油菜性状，例如种间杂交得到的 甘蓝型油菜的多室性状( 赵文路，2 0 0 7 ) 及甘蓝型油菜和芥菜型油菜的杂交后代F 3 群体中出现的无花瓣现象。目前甘蓝型无花瓣油菜的育种研究正在进行当中。 远缘杂交在创造新物种和研究基因组进化方面有很大的潜力。但远缘杂交也存 在许多困难。其中之一是杂种胚乳不能正常发育，杂种胚也会因饥饿而死亡。但是 近年来，在芸薹属、萝b 属等作物上，远缘杂交均有成功的报道，我国也有不少成 功的例子，如甘蓝型油菜与兰花籽、诸葛菜的种属间杂交，萝b 与甘蓝的属间杂交 等。芸薹属隶属于十字花科，包括很多油料、蔬菜和饲料作物，具有很大的经济价 值，并且芸薹属的近缘种种质资源非常丰富，这在芸薹属作物的遗传改良方面有巨 大潜力。因此，通过远缘杂交转移近缘种中的有益基因一直在芸苔属遗传改良中受 到广泛重视。其利用的主要途径有种质创新、基因组间关系及进化研究、异常染色 体行为研究和异染色体系的构建等方面。远缘杂交在芸薹属植物的遗传育种中具有 很广泛的应用。 1 1 1 萝I 、属与芸薹属杂交研究现状 远缘杂交是一种克服品种间杂交育种局限性的有效育种途径。远缘杂交在十字 花科作物改良中的应用已有多年历史，其中最典型的例子是萝b 甘蓝的研究。所谓 萝b 甘蓝是指萝b 与甘蓝杂交后经染色体加倍而形成的双二倍体，现在泛指萝b 属 与芸薹属的稳定属间杂种后代( 曾令和等，1 9 8 8 ) ，也有研究者称萝卜甘蓝的后代为 萝b 芸薹。萝b 是十字花科萝b 属植物，是芸薹属植物的近缘种。前人研究发现萝 b 中存在抗病、抗虫、耐寒、耐贫瘠等多种优良基因( 任成伟，1 9 9 2 ) 。因此，把萝 b 中的优良基因转移到芸薹属作物中，对芸薹属作物的遗传改良具有重要作用。目 前已有很多成功的例子将外源基因转移到各芸苔属植物中( P r a k a s he ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 萝b 一白菜异源四倍体及萝b 一甘蓝异源四倍体是人们研究较早的人工异源多倍 体，它们作为抗性育种资源和饲料作物具有重要利用价值。较早报道的萝卜一甘蓝异 源四倍体在低世代中普遍存在结实率较低的问题，使其应用受到限制，至今仍未在 2 萝卜甘蓝双二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究 生产上大规模应用。 对于萝卜甘蓝之间的杂交，国内外很多学者都进行过研究。关于萝卜甘蓝杂交 的研究，最早进行的报道是1 8 2 6 年S a g e r e t 的报道( O l e s s o n & E l l e r s t r o m ，1 9 8 0 ) 。时 隔百年，K a r p e c h e n k o ( 1 9 2 4 ) 以萝卜为母本，甘蓝为父本进行杂交获得F 1 ，后经细 胞学观察F 1 的染色体在减数分裂中全部为单价体。杂种在生活力和形态上与亲本有 很大差异：有些杂种表现出很强的生活力，而有些杂种却生长迟缓。这些杂种无论 自交、相互问杂交还是回交都近不育。在F 2 中自发产生了双二倍体，染色体数为3 6 ， 大部分育性较高，减数分裂也正常，并且性状稳定。进入二十世纪八十年代以后， 合成的萝卜一甘蓝异缘四倍体的主要目的是作为桥梁作物，把萝卜的有用基因向甘蓝 或甘蓝型油菜中转移( M c c o l l u m ，19 8 0 ；M a t s u z a w ae ta 1 ，19 8 5 ；O l e s s o n E l l e r s t r o m ， 19 8 0 ；K a m e y ae ta 1 ，19 8 9 ；H a g i m o r ie ta 1 ，19 9 2 ；S a r a s h i m a & M a t s u z a w a ，19 8 8 ；M o t e g i e ta 1 ，2 0 0 3 ；程雨贵，2 0 0 5 ；陈洪高，2 0 0 6 ；c h e n W U ，2 0 0 8 ) 。萝卜甘蓝在农业生 产上有许多可以利用的优点，但也有一些问题需待进一步解决。除育性障碍以外，还 有先期抽苔、干物质产量不稳定以及在整体水平上杂交所常有的一些缺点需要解决。 1 1 2 萝l 、芸薹远缘杂交的应用前景 萝卜甘蓝的研究已经有近两百年的历史，但是至今还没有在生产上直接应用， 其原因是远缘杂交的育性障碍。虽然萝卜甘蓝的应用存在一些实际困难，但是我们 也必须看到这种新物种潜在的利用价值。 第一，萝卜芸薹这种新的植物株型整齐并且高大，无论鲜重还是干物质都超过 最好的亲本，其中干物质重量至少超过亲本4 ，最高的可超过亲本7 5 ( E l l e r s t r o m ， 1 9 7 7 ) 。在瑞典，人们将生长速度较快、品质优良的萝卜与高产甘蓝进行杂交，经染 色体加倍后合成的异源四倍体( I m C C ) ，具有生长周期较短、适于高密度栽培、叶 茎比高、品质优良等优点，并且干物质产量比亲本高出1 7 ( O l s s o ne ta 1 ，1 9 8 0 ) 。 因此可以作为一种饲料作物种植。 第二，利用油菜与蓝花子萝卜属杂种，建立油菜的染色体异附加系，对于探讨油 菜与萝卜属植物的亲缘关系和减数分裂时的染色体行为，一些质量性状如花色、种皮 颜色、有无蜡粉、自交不亲和性等与相应萝卜染色体的对应关系等，都具有重要的理 论价值和实际意义。 第三，利用油菜与萝卜变种一蓝花子杂种( A A C C R R ) ，将蓝花子优异特性如抗 早、抗寒、耐贫瘠、耐酸碱等导入油菜中以提高油菜品种的抗性，具有重要现实意义 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 ( 李旭峰，1 9 9 5 ) 。 第四，在抗病性和抗虫性方面表现出来的应用价值。芸薹属作物极易受到芸薹 属根肿病( p l a s m a d i o p h o r ab r a s s i c a ) 的侵害，而萝卜对这种病有抗性。M c n a u g h t o n 对萝卜甘蓝( 以甘蓝为母本) 进行了真菌接种实验，结果表明萝卜甘蓝植株对根肿 菌的抗性超过了对照中最好的抗病品种( M c n a u g h t o n ，1 9 7 3 ) 。另外，还有研究表明 萝卜甘蓝具有霜霉病( p e r o n o s p o r ap a r a s i t i c a ) 的特性( K l u c z e w k i ，19 8 0 ) 。除了抗 病性，萝卜甘蓝在抗虫性、抗寒性方面也存在很多优势( P e t e r k a ，2 0 0 4 ) 。 1 2 远缘杂交与雄性不育 远缘杂交是产生雄性不育的一个重要途径。据K a u l 统计，在已发现的雄性不育 材料中，其中约1 0 的核不育材料和7 0 以上的细胞质雄性不育材料是通过种间或 属间杂交得到( K a u le ta 1 ，1 9 8 8 ) 。B a r m e r o l 等将萝卜雄性不育材料分别与结球甘蓝 和甘蓝型油菜杂交，通过连续回交，育成了萝卜细胞质结球甘蓝和甘蓝型油菜雄性 不育系( B a r m e r o le ta 1 ，1 9 7 4 ) 。此外，通过远缘杂交并结合回交的方法，甘蓝型油 菜P l oC M S 己转育到结球白菜上( 柯桂兰，1 9 9 2 ) 。 1 2 1 远缘杂交产生雄性不育的机理 雄性不育( M a l es t e r i l i t y ) 是指雄蕊发育不良，不能产生有功能的花粉，但雌 蕊发育及营养生长正常，能够接受正常花粉而授精结实的生物学现象。雄性不育在 整个植物界中都是广泛存在的。雄性不育是杂种优势利用的重要途径之一。特别是 在白花授粉作物和常异花授粉作物的育种中，雄性不育显得尤为重要。据K a u l 在1 9 8 8 年报道，已经在4 3 个科1 6 2 个属6 1 7 个物种及种间杂种中发现了雄性不育，其中包括 水稻、玉米、小麦、高梁、棉花、油菜等主要农作物( 涂玉琴，2 0 0 9 ) 。利用属间或 种间杂交是创造不育材料的一条重要途径( 傅廷栋，1 9 9 5 ) 。湖南农业大学袁隆平 ( 2 0 0 2 ) 教授培育的杂交水稻就是通过雄性不育的野生稻与栽培稻进行远缘杂交， 然后再连续回交的方法培育成功的。通过连续回交使母本核基因被父本核基因取代， 由于核质不亲和造成雄性不育，从而为水稻杂种优势利用打开突破口。小麦“T 型 雄性不育系也是远缘杂交的产物。 1 3 油菜雄性不育与杂种优势的利用 杂种优势( H e t e r o s i s ) 是指两个遗传特性不同的亲本有性杂交，产生的杂种F l 在生长势、抗逆性、适应性等方面明显优于双亲的现象，它普遍存在于生物界中。 4 萝卜廿蓝双二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究 作物杂种优势涉及作物生长发育的各个不同时期，但是不同作物类型，不同性状的 杂种优势表现各不相同。油菜具有很强的杂种优势，增产效果明显。国内外研究证 明，甘蓝型春油菜F 1 杂种优势率约为2 0 4 0 ，冬油菜平均优势率约为3 0 一4 0 ( Y a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ；M o h r i n ge ta l ，1 9 9 9 ；G i r k ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。由于油菜与其他大田作物 相比具有花器外露，分枝性强，属无限花絮，花期长，花期容易调整等优点，因此 推广杂交油菜具有投资少、效益大的优势，前景广阔( 傅廷栋，1 9 9 5 ) 。油菜杂种优 势利用的途径主要有：利用细胞质雄性不育三系法制备杂交种、利用细胞核雄性不 育制备杂交种、化学杀雄制备杂交种及利用生态型雄性不育制备杂交种等。其中利 用较多的是细胞质雄性不育及细胞核雄性不育。 1 3 1 细胞质雄性不育的研究 细胞质雄性不育( C y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y , C M S ) 是由细胞质基因与细胞核基 因共同控制的一类雄性不育。细胞质雄性不育系杂种的应用是油菜杂种优势利用的 主要途径。国内外推广应用的油菜杂交种，多数是来自C M S 系统。据统计，我国 1 9 8 5 1 9 9 6 年审定通过的3 7 个油菜杂交种中有2 2 个大约占6 0 都是C M S 三系杂种 ( 傅廷栋和涂金星，2 0 0 2 ) 。目前在生产上利用较多的是P o lC M S ，O g uC M S ( O g u r a ， 1 9 6 8 ) ，陕2 A C M S ( 李殿荣，1 9 8 0 ) 。 O g uC M S 即萝匐胞质雄性不育型，是O g u r a ( 1 9 8 6 ) 在日本孤儿岛的一个同本 萝匐群体中发现的天然雄性不育型。这种不育材料的花蕾瘦小，柱头弯曲或突出在 花蕾外面，它的细胞质是不育的S 胞质，核基因是r f r f , 因此它的育性遗传组成为S ( r f r f ) ，表现为雄性不育。O g uC M S 的不育性非常稳定，不育彻底。B o n n e r o t ( 1 9 7 7 ) 把O g uC M S 引到法国，用欧洲的萝匐品种与之测交，最终找到了保持系，并发现部 分品种中含有恢复基因。B a n n e r o t 等( 1 9 7 7 ) 用连续回交的方法把甘蓝型油菜的核 导入O g uC M S 中最终育成甘蓝型油菜不育系。原始的O g uC M S 存在一些问题，主 要是：油菜中不存在其恢复基因；低温下叶绿素缺乏，叶片黄化；蜜腺发育不良， 影响昆虫传粉等( 傅廷栋，2 0 0 0 ) 。 P o lC M S 是华中农业大学傅廷栋教授于1 9 7 2 年在甘蓝型油菜品种“P o l i m a ”中 发现的天然雄性不育株。此C M S 系统是国际上公认的“第一个有实用价值的油菜雄 性不育类型”( F a ne ta 1 ，1 9 8 6 ；F a n g M c v e t t y , 1 9 8 7 ；R o b b e l e n ，1 9 9 1 ) 。研究证明， P o lC M S 的败育基因存在于线粒体中，育性的恢复受到一对主效基因的控制( 崔德 拆等，1 9 7 9 ；F a n ge ta l ，1 9 8 7 ；王俊霞等，2 0 0 0 ) ，但同时受到微效修饰基因的影响 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 ( 杨光圣，1 9 8 8 ) 。P o lC M S 系统最大的优点是容易实现三系配套，杂种制种程序简 单。1 9 7 6 年湖南农科院首先实现了三系配套。随后，澳大利亚、加拿大、瑞典、波 兰和印度等国也相继实现了三系配套，并育成多个三系杂交种，如“H y o l a 4 0 、 “H y o l a 4 0 1 、“H y o l a 4 1 7 等，国内育成的代表性杂交种有“华杂3 号 、“华杂6 2 号 ( 易斌，2 0 0 7 ) 。但是，P o lC M S 在应用过程中，存在的主要问题有：在较高或 较低温度下容易出现微量花粉，这种育性不稳定现象与细胞核基因型有关。根据P o l C M S 不育系对温度反应的不同，可将其分成高温不育型、低温不育型和稳定不育型， 其中稳定不育型比例很低( F ue ta l ，1 9 8 7 ；傅廷栋等，1 9 8 9 ) 。因此，选育出稳定型 不育系是利用P o lC M S 进行杂交种的选育的主要突破口。 目前在生产上主要应用的细胞质雄性不育，约有7 0 的细胞质不育杂种，且基 本上来自P o lC M S 。由于单一化的不育胞质，_ 旦出现不利的天气或自然灾害，损 失将会非常严重。因此发现和创建新的不育胞质一直是油菜改良的重要突破口。芸 薹属植物有非常丰富的种质资源，可以通过远缘杂交创建新的不育系或对现有不育 系进行改良。当前，通过与近缘物种远缘杂交创建或转育的雄性不育系有O g uC M S ， t o u rC M S ，o x yC M S 和N s aC M S 等( 胡琼，2 0 0 6 ) 。而P r a k a s h ( 2 0 0 1 ) 更认为能提 供不育细胞质的芸苔属近缘种至少有8 个之多。因此，通过远缘杂交创建新的雄性 不育材料是芸苔属植物利用杂种优势的一个重要途径。 H i n a t a 和K o n n o ( 19 7 9 ) 利用D i p l o t a x i sm u r a l i s 和B r a s s i c ac a m p e s t r i s 进行有性 远缘杂交，获得了含丑c a m p e s t r i s 细胞核而含D m u r a l i s 细胞质的细胞质雄性不育 系。B a t r a 等( 1 9 9 0 ) 通过D s f 帕a ( 2 n = 2 0 ) 与B j u n c e a 的远缘杂交，经过胚抢 救获得双二倍体，后进行回交从而获得了不育性很稳定的细胞质雄性不育系。 N a n a d a K u m a r 等( 19 9 3 ) 利用D i p l o t a x i ss i e t t i a n a 与B r a s s i c ac a m p e s t r i s 进行有性 杂交，对不育的F l 杂种用秋水仙素加倍，后再进行回交，在B C 2 代中得到可育和不 可育的植株，在其中可选育到细胞质雄性不育系和恢复系。自O g u r a ( 1 9 6 8 ) 在 R a p h a n u ss a t i v u s 中发现了细胞质雄性不育系O g u r aC M S ，B a n n e r o t 等( 1 9 7 4 ) 就通 过属间远缘杂交将其转入到甘蓝和甘蓝型油菜中，并在1 9 7 7 年育成了甘蓝型油菜 O g uC M S ，但在油菜中没有找到恢复基因。P a u l m a n n 和R o b b e l e n ( 1 9 8 8 ) 通过将不 育系与属间双二倍体A A C C R R ( 2 n = 5 6 ) 杂交将萝卜的恢复基因导入油菜。徐利远 等( 1 9 9 6 ) 利用油菜与萝卜的变种兰花子异源四倍体杂种A A C C R R 为桥梁，将 兰花子的O g u 恢复基因导入油菜，使油菜育性得到很好的恢复。萝卜的不育胞质已 经被转育到许多芸薹属植物中，已见报道的还有芥菜、埃塞俄比亚芥、花椰菜、青 6 萝b 什蓝双二倍体雄性不育性的遗传及细胞学研究 花菜、球茎、包子甘蓝、芜菁等作物。 1 3 2 细胞核雄性不育的研究 细胞核雄性不育是由细胞核基因控制的一类雄性不育，是油菜杂种优势利用的 另一条重要途径。核不育系统不仅不育性非常彻底稳定，而且不存在不育胞质的不 良效应和胞质单一化的问题，所以在杂种优势利用中有广阔前景。目前，国内外利 用的油菜雄性核不育类型主要有显性核不育、两对隐性重叠基因控制的核不育、互 作型隐性核不育和转基因核不育( 易斌，2 0 0 7 ) 。四I I 宜宾地区农科所( 1 9 7 2 ) 发现 的宜3 A 属于显性核不育。单基因显性细胞核雄性不育型其不育性彻底、稳定，几 乎所有品种都是它的保持系，杂交或兄妹交的后代出现1 ：1 的育性分离，没有恢复源， 不能用于杂交种生产，但在轮回选择和基础研究上有一定的利用价值，M a t h i a s ( 1 9 8 5 ) 在波兰冬油菜品种中发现的天然不育即属此类。$ 4 5 A ( 潘涛等，1 9 8 8 ) 和1 1 7 A ( 侯国佐等，1 9 9 1 ) 是两对隐性重叠基因控制的核不育系。双基因隐性细胞核雄性 不育系，雄性不育由核内2 对隐性重叠基因控制，当2 个位点均处于隐性纯合状态时 表现为雄性不育，当存在其中的_ 个可育基因或两个可育基因同时存在时，即表现 为可育。双基因隐性细胞核雄性不育的不育性稳定、彻底，不受环境影响，恢复源 广泛，但缺点是找不到完全保持系，只能以两型系的形式加以利用，用于杂交种生 产时也必需大面积拔除5 0 可育株，因而其利用受到了较大限制。另外一类重要的 细胞核雄性不育是由3 对隐性基因控制即隐不育材性上位基因互作控制的细胞核雄 性不育。安徽省农业科学院陈凤祥等( 1 9 9 3 ，1 9 9 8 ) 报道的核料9 0 1 2 A 属于此类型。 其不育性受2 对隐性重叠基因( m s 3 m s 3m s 4 m s 4 ) 和1 对隐性上位基因( e s p e s p ) 控制。 当m s 3 、m s 4 中有至少一个位点处于显性时或上位抑制基因处于隐性纯合状态时，此 材料即表现为可育。根据这一原理，可以通过“临保系( m s 3 m s 3m s 4 m s 4e s p e s p ) 繁殖不育系，从而减少拔去母本行5 0 可育株的麻烦。目前利用此不育系已经育成 的品种有皖油1 4 号和皖油1 8 号( 陈凤祥等，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ) 。 1 4 油菜雄性不育的细胞学研究 关于植物雄性不育花药发育的细胞学研究，前人已经做过大量的研究工作。水 稻、拟南芥、油菜、大豆等作物中均有报道( 孙日飞，1 9 9 5 ；杨守萍，1 9 9 9 ；S a n d e r s e ta l ，1 9 9 9 ；黄邦全，2 0 0 0 ；冯九焕等，2 0 0 1 ；K ue ta 1 ，2 0 0 3 ；叶纨芝，2 0 0 4 ；樊云 芳，2 0 0 6 ) 。他们研究的目的主要在于确定雄性不育材料的败育时期及败育特点。不 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 同作物，同种作物的不同