小麦K型细胞质雄性不育系和保持系蛋白质组差异研究-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 密级 论文题目：小麦K 型细胞质雄性不育系和保持系 英文题目： ! Q 鲤i 翌墨B 星! 丛曼鱼! QK 二g 丝Q 卫! 垒兰坐i 堡丛垒! 星 S t e r i l e ( C M S ) l i n ea n dm a i n t a i n e rl i n ei n C o m m o n 蚴e a t 学位申请人： 导 专 论文提交 日期： 学位授予 日期： JP l I II III l ll flr l l ll l III Y 17 2 8 7 9 6 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 小麦K 型细胞质雄性不育系和保持系蛋学位 文题目 白质组差异研究级别 硕士 学生学科导师 姓名 郭春燕作物遗传育种詹克慧教授 专业姓名 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生躲蟊者燕新签名苏移 日期：砷年月，彭日 日期：沙二年月日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 研究生签砷暑岛新签渺学院领毒躲 - ；7 蠕J ，。f 以_ 矗j 一一t lt 一 。l L 一。、f 一 ，弩涮 口删：冽9 平扫月7 扫口口删勺岁胪6 - j ，6 口口删：二，。上卜( ，月y 口 致谢 本文是在导师詹克慧教授的悉心指导下完成的。从论文的选题到撰写，都倾 注了导师大量的心血。导师渊博的学识及严谨、认真、负责的治学态度不仅为我 毕业论文的顺利完成指明了正确的方向和途径，而且给我以启发、教育和鞭策， 让我终生受益。三年来，恩师对我生活上的关怀和学业上的教育、培养，更使我 终生难忘。在此特向恩师致以崇高的敬意和衷心的感谢! 在论文的选题和完成过程中，崔党群老师、陈新建老师、陈军营老师、许海 霞老师、程西永老师、董中东老师及其他各位老师都提出了宝贵的意见，给予无 私的帮助，特此致以深深的谢意! 感谢陈锋教授及河南省农科院的胡琳研究员在百忙之中对论文的评阅。 感谢农学院、研究生处的领导和老师对我的工作、学习和生活各方面的支持 和帮助! 特别感谢生命科学院副院长吴建宇教授及玉米中心李玉玲教授在论文开 题时给予的建议和意见! 感谢曾给予我帮助的师兄马东钦，师姐许兰杰、金艳，同窗朱有朋、徐艳花、 徐园园，师妹马彩艳、尚晓丽，师弟孙文鑫、周扬、张福彦、刘华，2 0 0 5 级实习 生杨钊钊、郑杭杭、郭晓、郭慧娟，2 0 0 6 级实习生林利美、孙鑫蕊、耿彦超、张 源源，是他们的辛勤汗水使我的实验得以顺利完成。 另外，还要感谢在我求学和生活过程中给我关心和帮助的所有同学、朋友， 是他们在精神上给了我极大的支持和鼓励。要特别感谢我的家人，是他们的辛勤 劳动养育了我，在物质上给予了无私帮助，在精神上不断鼓励我，使我的学业得 以顺利完成。 郭春燕 2 0 1 0 年6 月 目录 摘要1 l 文献综述3 1 1 植物细胞质雄性不育的研究：3 1 1 - 1 叶绿体与细胞质雄性不育3 1 1 2 线粒体与细胞质雄性不育4 1 1 3 转基因植物研究9 L1 4 花粉败育机理研究1 0 1 2 小麦K 型雄性不育系的研究1 l 1 2 1 小麦K 型雄性不育系的来源1 l 1 2 2 小麦雄性不育的遗传机理研究1 2 1 3 蛋白质组学技术研究进展及其应用1 3 1 3 1 蛋白质组学的概念、研究内容及意义1 3 1 3 2 蛋白质组学相关技术1 4 1 3 3 蛋白组学的应用1 8 2 引言2 2 3 材料与方法- 2 3 3 1 材料与试剂2 3 3 1 1 材料及其获取方法2 3 3 1 2 试剂2 3 3 1 3 仪器2 4 3 2 方法2 4 3 2 1 蛋白提取方法2 4 3 2 2 蛋白质沉淀的溶解2 5 3 2 3 蛋白质浓度测定2 5 3 2 4 上样量：2 5 3 2 5 双向电泳：2 5 3 2 6 图像的扫描与分析2 6 4 结果与分析2 6 4 1 不同提取方法、裂解液处理、上样量的双向电泳结果比较2 6 4 1 1 蛋白质提取方法的比较2 6 4 1 2 不同裂解液的比较2 6 4 1 3 不同上样量的比较2 7 4 2K 型细胞质雄性不育系与保持系双向电泳图谱比较2 8 4 3 差异表达蛋白点的质谱鉴定3 0 5 结论与讨论3 6 5 1 小麦花药蛋白质的提取3 6 5 2 关于粗蛋白的裂解3 6 5 3 蛋白上样量的确定3 6 5 4 差异蛋白质的功能3 6 5 4 1 细胞质型苹果酸脱氢酶( c M D H ) 3 7 5 4 2S 一腺苷甲硫氨酸合成酶3 8 5 4 3 细胞壁关联蛋白激酶1 ( w A K l ) 3 9 5 4 4 谷氨酰胺合成酶亚基( G S e ) 3 9 5 4 5O E C 3 3 k D 蛋白3 9 5 4 6 磷酸丙糖异构酶( T P I ) 4 0 5 5 关于两个品种的差异蛋白4 l 5 6 进一步的研究设想4 1 参考文献4 2 A B S T R A C T 5 3 河南农业大学硕士学位论文 摘要 细胞质雄性不育( c y t o p l a s m i cm a l es t e r i l i t y ，C M S ) 是一种广泛存在于高等植物中的生 物学现象，因其雄性生殖系统不能产生有功能的花粉，而雌性生殖系统发育和营养生长完全 正常的特点，使其在杂交制种中免去了“去雄”的繁琐步骤，已成为作物杂种优势利用的重 要途径。关于细胞质雄性不育形成的内在机理仍需更进一步的研究。迄今为止，已从生态学、 遗传学、分子生物学等方面细胞质雄性不育开展了相关研究，但蛋白质表达方面的研究还较 少。 本研究利用改进的蛋白质双向电泳技术，从发育遗传学的角度，对小麦K 型细胞质雄性 不育系及其保持系的不同器官及不同发育时期表达相关的蛋白产物进行了差异分析。结果如 下： 1 以小麦处于二核一三核期的花药为材料，比较了三种不同蛋白质提取方法三氯乙酸 丙酮法、尿素硫脲法、K C I - 醋酸铵甲醇法对双向电泳结果的影响，并在蛋白质裂解液组成、 蛋白质上样量等方面进行了探索与优化。结果表明，与尿素硫脲法及K C l 一醋酸铵甲醇法相 比，采用三氯乙酸丙酮法提取蛋白质操作简便，所得的双向电泳图谱蛋白质点数较多，蛋 白点形状规则、清晰，且重复性好，图谱背景也比较清晰。样品溶解于含有硫脲的蛋白质裂 解液I I 中，可显著提高蛋白质的溶解性。以三氯乙酸丙酮提取法提取小麦花药中的蛋白，用 蛋白质裂解液 7 m o l L 尿素，2 m o l L 硫脲，4 ( W V ) C H A P S ，1 ( V v ) p H = 3 1 0 的固 相p H 梯度( i m m o b i l i z e dp Hg r a d i e n t s ，I P G ) b u f f e r 溶解蛋白，以p H 3 - 7 线性2 4 c m 的I P G 胶 条进行双向凝胶电泳，在上样量为1 0 0 0 g ，1 2 S D S P A G E 胶浓度下，蛋白质得到了更好 的分离，图谱效果最好。 2 利用蛋白质双向电泳技术，构建小麦K 型不育系豫麦2 l 和豫农4 3 及其保持系的苗期 叶片和二核一三核期旗叶的蛋白图谱。发现不育系与保持系凝胶上的蛋白质双向电泳图谱基 本相同，只有豫农4 3 不育系与保持系有3 个蛋白点存在差异。 3 通过对花药蛋白的双向电泳分析，构建小麦K 型不育系豫麦2 1 和豫农4 3 与其保持系 处于二核一三核期花药的蛋白图谱。结果表明，大部分蛋白质属于酸性蛋白，主要集中分布 在p H4 7 区域内，有1 2 个蛋白质点在不同亲和阶段表现差异，其中在豫农4 3 不育系与保 持系之间发现5 个差异点：A 4 、A 5 、A 6 、A 7 、A 8 。A 5 是仅在豫农4 3 保持系花药中表达的点； 点A 4 、A 6 、A 8 仅在豫农4 3 不育系花药中表达；点A 7 在豫农4 3 保持系花药中上调表达，而 在不育系中下调表达。在豫麦2 1 不育系与保持系之间发现B l 、B 2 、B 3 、B 4 、B 5 B 6 、B 7 ， 一共7 个差异点，从图中可以看出这些差异表达的蛋白质点大部分为量上面的差别。其中， B l 和B 7 在豫麦2 1 不育系花药中表达上调，而在保持系中下调表达；点B 2 、B 3 、B 4 、B 5 、 B 6 在豫麦2 1 不育系花药中表达下调，在保持系中表达上调。 4 利用二级质谱肽( L C E S I 骼M s ) 和蛋白数据库分析鉴定差异蛋白，共鉴定1 5 个蛋 河南农业大学硕士学位论文 白点，其中1 0 个得到成功鉴定。分别代表6 种不同的蛋白，即：O E C 3 3 k D 蛋白、细胞质型 苹果酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、S 一腺苷甲硫氨酸合成酶、细胞壁关联的蛋白激酶、谷氨酰 胺合成酶。推测这些差异表达蛋白与植物生理生化代谢的酶活性、能量代谢等存在密切关系， 是小麦细胞质雄性不育差异表达的关键蛋白。 关键词：小麦；K 型雄性不育系与保持系；旗叶；花药；蛋白质；双向电泳 河南农业大学硕士学位论文 1 文献综述 植物雄性不育是一种在有性繁殖过程中不能产生正常的花药或雄配子体的现象。在 1 7 6 3 年K o l r e u t e r 就已经观察到雄性不育现象。一个世纪以后C o l e m a n ( 1 8 7 6 ) 首先引入“植 物雄性不育”的概念。据K a u l 的报道已在4 3 科1 6 2 属3 2 0 个种的6 1 7 个品种或种间发现 雄性不育现象。2 0 世纪以来雄性不育的遗传理论不断发展，从植物雄性不育的遗传背景来 看，可以将其分为核不育( g e n e i cm a l es t e r i l i t y ，G M S ) 和细胞质不育( c y t o p l a s mi c e m a l e s t e r i l i t y ，C M S ) 两种类型。核不育受核基因控制，而细胞质不育受细胞质与细胞核物质的双 重控制。目前人们发现和利用的大多数的植物雄性不育都是细胞质雄性不育( C M S ) 。 1 1 植物细胞质雄性不育的研究 植物细胞质雄性不育是细胞核与细胞质物质之间相互作用的结果，具有母性遗传特征。 细胞质雄性不育显著特点是在其有性生殖过程中雄配子败育，表现为形态结构在后期小孢子 内壁加厚过程受阻，小孢子大量破坏，不能形成饱满的花粉粒；生理生化方面花药中蛋白质合 成途径被破坏，蛋白氮总量显著下降，醇溶性氮( 特别是酰胺态氮) 含量大幅上升而它的雌配 子发育不受任何影响。 植物的核外遗传系统包括线粒体和叶绿体，我们自然联想到细胞质雄性不育与线粒体和 叶绿体有关。人们对细胞质雄性不育的分子水平研究大致上有两个方面，核酸与蛋白质。 1 1 1 叶绿体与细胞质雄性不育 1 1 1 1 叶绿体D N A ( c h l o r o p l a s t c p D N A ) 与细胞质雄性不育 叶绿体与线粒体都是细胞内进行能量转换的场所，两者在结构上具有一定的相似性。 均由两层膜包被而成，且内外膜的性质、结构有显著的差异。均为半自主性细胞器，具有 自身的D N A 和蛋白质合成体系。叶绿体是植物细胞特有的细胞器，高等植物叶绿体D N A ( c p D N A ) 为共价闭合环状分子。已经研究过的绝大多数高等植物叶绿体D N A 分子中，均有两个长度为 2 0 - 2 8 k b 的反向重复序列。由于这两个反向重复序列的存在，环状D N A 分子因此被分割成一 个大的和一个小的单拷贝区，其长度因植物的种类而不同。但是也有例外，如蚕豆和豌豆的 叶绿体中至今仍未发现重复区的存在，叶绿体D N A 分子的结构较稳定。有关叶绿体与细胞质 雄性不育关系方面的研究发展较晚，研究报道也不多。叶绿体D N A 与雄性不育有关的报道最 早见于烟草与棉花，以后陆续在油菜、玉米、高粱、小麦等作物中发现叶绿体D N A 与细胞质 雄性不育有关。李继耕心1 在小麦、菠菜、玉米、水稻、高粱等多种作物中，利用双向电泳技 术对叶绿体与雄性不育关系进行了系统的研究，结果表明：不育系的叶绿体基因组与其相应 的保持系之间存在明显差异。他认为叶绿体D N A 突变引起它所编码的一系列蛋白质特性的变 化，因此叶绿体与雄性不育现象有某种联系也是有可能性的。在萝卜不育系4 0 1 1 A 中c p D N A 的特异序列编码核糖体蛋白小亚基S 。：C 末端7 个氨基酸残基和S ，的N 末端的9 3 个氨基酸， 从而构成r p s l 2 - r p s 7 操纵子的一部分，说明叶绿体核糖体蛋白S - z 和S t 可能与C 3 1 S 存在某些 河南农业大学硕士学位论文 方面的联系。M i k a m i 研究显示甜菜D N A 的H i n dH I 酶切图谱中可育系的一个片段在不育系中 消失，代之而出现的是两个较小片段。C h e n 1 等应用分子原位杂交证实了高粱雄性不育系和 保持系的c p D N A 的R F L PH i n dI l l 酶切片段确实不同，并且克隆成功了r p o c 2 这一基因片段， 通过测序与其它作物如玉米、水稻、烟草等同源性序列进行比较，证实r p o c 2 编码R N A 聚合 酶亚基。但他在报告中对于C M S 机理是否同这一基因片段有没有关系并没有作出确定的结 论。但K a d o w a k i H l 刘一农幢1 利用单向凝胶电泳发现在油菜中不育系比保持系缺少一个分子 量约为1 1 6 1 0 6 道尔顿的片段，利用含变性剂浓度梯度双向P A G E 电泳，在玉米、小麦和 油菜中都找到了不育系与保持系c p D N A 间的差异。范昌发等旧1 研究发现高梁不育系叶绿体中 的n d h D 基因与保持系的序列不同，利用S o u t h e r n 杂交在不育系中得到4 9 k b 的带，在保持 系则为4 4 5 k b ，上述研究认为叶绿体基因组与C M S 有关。 从现有的研究资料看，c p D N A 与C I V I S 有关的结论并不多，两者之间的关系有待于进一步 深入。 1 1 1 2 叶绿体蛋白与雄性不育 一切生命现象最终由蛋白质来体现，人们对雄性不育系与可育系D N A 比较得到的差异也 应在其翻译产物中体现出来，蛋白质离体翻译技术就是关于细胞质雄性不育翻译水平研究的 一项重要手段。叶绿体和线粒体都具有自己独立完整的蛋白质合成系统如m R N A 、核糖体、 r R N A 、t R N A 等，可以独立地合成一些多肽，体外翻译技术就是基于此建立起来的。细胞器 离体翻译是指细胞器在离体状态下，在人工提供的翻译环境中，不受核基因影响地独立地合 成蛋白质。 M o r g e n t h e l e 哺1 用菠菜叶绿体离体培养合成多肽。刘祚昌等盯1 对高粱叶绿体基因组的离 体翻译产物进行分析，进一步证实标记信号最强的3 7 K D 的多肽是叶绿体膜蛋白，另一强带 是l ，5 - - - 磷酸核酮糖羧化酶( R U B P 羧化酶) 大亚基。据此推断细胞质雄性不育的形成与叶 绿体遗传系统有关。这一观点在多种植物中得到证实旧。R e m y 采用蛋白质双向电泳技术观察 到油菜不育系与可育系之间A T P 合成酶的B 亚基位置发生改变。李家洋旧1 对高粱、玉米、 甜菜的可育系与不育系的叶绿体类囊体多肽进行研究，发现单向电泳中只有个别带深浅有差 异，即蛋白质存在量的差异，而双向电泳在3 3 K D 附近斑点的数量、大小、分布均有明显差 异，表示叶绿体类囊体膜多肽的组成与细胞质雄性不育可能有联系。迄今为止，尚未在任何 细胞质雄性不育植物的叶绿体基因组中找到一个可能与其育性密切相关的D N A 片段。 1 1 2 线粒体与细胞质雄性不育 在线粒体与雄性不育的关系，最初的研究是根据线粒体D N A ( m i t o c h o n d r i a lD N A ，m t D N A ) 被核酸内切酶消化的图谱差异而确定的，大部分研究者认为高等植物细胞质雄性不育与线粒 体有密切关系。细胞质雄性不育与线粒体的关系在很多植物中都有报道，研究比较深入的高 等植物有水稻、玉米、矮牵牛、小麦、白菜、菜豆、向日葵等。近年来对这些植物的不育系、 保持系的研究主要集中在两方面，即保持系与不育系在线粒体基因组的结构、线粒体基因、 4 河南农业大学硕士学位论文 转录与翻译产物方面的差异以及与雄性不育之间存在的可能关系。 1 1 2 1 植物线粒体基因组与细胞质雄性不育 与动物、真菌以及一些低等植物的线粒体基因组相比较，高等植物的线粒体基因组有以 下特点：( I ) 基因组庞大，而且大小差异悬殊。高等植物线粒体基因组大部分都在2 0 0 k b 以上， 有的可以达到2 5 0 0 k b 。( 2 ) 基因组的构型复杂多变，其构型主要有闭环、开环、线状、超螺 旋和多聚体等，环状还有主次之分，而且次环分子的数目和种类往往可以变化。( 3 ) 有的植 物线粒体基因组中含有能够独立存在且能自我复制的线粒体质粒。( 4 ) 植物线粒体基因组大 小相对其编码能力显得冗长多余，基因组含有大量的重复序列、非编码序列，甚至还有其它 来源的序列。 植物线粒体基因组具有整合其它基因组D N A 序列并保持稳定遗传的特性，这些被整合的 D N A 片段称为漫游D N A 。漫游D N A 整合入线粒体基因组是以随机的形式完成，与植物物种和 整合的片段大小有关。 通过比较小麦、玉米、油菜、水稻、向日葵和高粱等正常和不育胞质线粒体基因组限制 性酶切物理图谱，发现两者线粒体基因组组织结构存在着很大的差异，两者不仅在同源序列、 功能基因排列顺序和方向存在差异，而且都含有非同源序列 I O A I , 1 2 】。1 9 9 0 年L e v i n g 和P r i n g n 引 第一次次运用多种限制性内切核酸酶酶切玉米正常细胞质( N ) 和T 型胞质的m t D N A ，发现两 者的酶切图谱存在明显的差异。李小明等应用R L F P 技术，研究了红莲型不育系、保持系、 杂种一代及野败型、马协型不育系的线粒体基因组，在分子水平揭示了不育胞质的多样性。 许仁林等“”运用A P - P C R 技术对野败型水稻珍汕9 7 A 、保持系珍汕9 7 B 和F 1 杂种的m t D N A 的 多态性进行了比较，结果从野败型水稻珍汕9 7 A 中得到了一个特异的扩增片段。黄占景等“引 运用R A P D 方法对小麦A 型不育系7 5 3 3 6 9 A 与其相应的保持系7 5 3 3 6 9 B 的m t D N A 进行了比 较研究，同样也发现两者具有多态性。蔡陈岐等对水稻野败型细胞质雄性不育系珍汕9 7 A 、 保持系珍汕9 7 B 、F 1 汕优6 3 三者之间与另一种孢子体细胞质雄性不育系马协A 、保持系马 协B 、F 1 马协6 3 三者之间m t D N A 进行比较也获得了同样的结果。凌杏元等n 朝运用A F L P 技术 筛选分离出野败型水稻m t D N A 中与雄性不育性状相关的片段。 通过上述方法所获得的正常的细胞质线粒体D N A 和不育系D N A 的多态性涉及全基因组， 范围广，差异片段冗杂，与不育性的形成不可能全都有关系，所以很有必要分离以及克隆这 些差异片段进而作进一步的分析和鉴定。研究者还对线粒体的质粒样D N A ( P l a s m i d l i k eD N A ) 与C M S 关系做了研究。P r i n g 1 从玉米S 型细胞质m t D N A 中发现两个低分子量的质粒样D N A ， 命名为S 1 和S 2 ，每个分子的两端均具有2 0 8 b p 反向重复序列( I R ) 。1 9 8 5 年S c h a r d a l 和 L a n s d a l e n 引证实了S 1 - S 2 的2 0 8 b p 的反向重复序列( I R ) 与线粒体主D N A 的一，6 6 区域存在较高的同源性，并且在这个区域内，S l 、S 2 分子与线粒体主D N A 发生了交换与重 组，从而导致了线粒体主D N A 的分子重排以及线性化的m t D N A 分子的产生。从以往研究看来， 与C M S 有关的m t D N A 片段，如水稻的u r f - r m c 、玉米的u r f B T 、矮牵牛的p c f 的产生就有可 I = = = 慧= 三一 制，并通过转座子形式再整合到线粒体基因组的不同位点上，也可能插入到核基因组中，作 为线粒体向细胞核转递信息的一种机制，但是一部分人在水稻不育系和保持系研究中没有发 现两者的质粒样D N A 存在差异，因此从目前的研究来看，对质粒样D N A 与C M S 的关系并没有 确切的定论。 植物线粒体基因组中存在着大量的重复序列。这些重复序列片段通常在1 - 1 0 K b 之间。 但是最小的只有7 k b ，而最大的可以达到几百个k b ，如在T - C M S 型玉米线粒体基因组中有一 段1 6 5 k b 的重复序列，而在C M S 矮牵牛线粒体基因组中重复片段长度可达2 5 2 K b t l 9 】。研究表 明，线粒体基因组具有大量重复序列的特点与细胞质雄性不育的存在密切的关系。因为重复 序列导致了基因组的重排，而重排产生基因新的表达调控方式，甚至产生了新的基因，一些 与细胞质雄性不育密切相关的“嵌合基因”如矮牵牛的p c f 基因和玉米的o r f l 3 基因就是线 粒体基因组D N A 重组的产物晗叫高等植物线粒体基因组中通常还存在有其它来源的D N A 序列。 玉米线粒体和叶绿体基因组有1 2 1 k b 的同源区，其同源性大于9 0 ，该同源区包括两个t R N A 基因、1 6 sr R N A 基因3 部分和1 ，5 一二磷酸核酮糖大亚基基因。G r e e n 和M a r e c h a l 在线粒体 基因组中可以找到核基因片段心。由此看来，高等植物细胞内的三大遗传系统之间存在遗传 物质的交换。 1 1 2 2 线粒体基因与细胞质雄性不育 尽管高等植物线的粒体基因组十分庞大，但它所编码的功能基因是有限的。拟南芥的线 粒体基因组D N A 是迄今为止唯一一个全序列测定的高等植物线粒体基因组，全长3 6 6 9 2 4 b p 的D N A 序列却只编码5 7 个基因。高等植物线粒体基因的编码序列保守性很强，但是编码区 以外的序列保守性却很低，这个特点有利于利用已知基因对其它各种植物线粒体基因进行多 态性变化的研究。在植物线粒体D N A 中还含有一些开放阅读框架O R F ( o p e nr e a d i n gf r a m e s ) ， 它们可以转录，但其功能和编码蛋白还不清楚。这些阅读框有一部分是通过线粒体基因组重 排形成的嵌合基因，已发现的在不同植物中近2 0 个不同嵌合基因中有的与植物雄性不育性 有关曙引。与玉米T - C M S 有关的线粒体基因为u f r 一1 3 ，不育系的该位点是基因组经过7 次重 组所形成的嵌合基因，它含有r m 2 6 基因和a t p 6 基因的部分序列，该位点靠近线粒体D N A 的重复序列，可以编码1 3 k D 的线粒体多肽。 向日葵细胞质雄性不育系和保持系的m t D N A 只发现在a t p A 基因位点附近存在着差异， 该位点附近不育系和保持系都含一个1 2 k b 的倒位片段，但是与保持系不同的是，不育系多 一个5 k b 的插入，结果形成一个新的与C M S 有关的o r f 5 2 2t 2 3 , 2 4 1 。 水稻B T - C M S 不育系线粒体D N A ( m t D N A ) 含有两个a t p 基因，而保持系只有一个。通过 序列分析表明，不育系两个a t P 6 基因中的一个与保持系完全一致，只是在终止子下游4 9 位产生了歧化。另一个a t P 6 基因是一个嵌合基因，通过线粒体D N A 分子内的重组产生， K o d o w a k i 将它命名为u r f r m c 晗5 矧。水稻野败型不育系和保持系除了前面发现线粒体D N A 酶 6 河南农业大学硕士学位论文 切图谱存在差异以外，还发现C O XI 、C O XI I 、c o x I I I 、c o b 、a t p 6 、a t p 9 、a t p A 等位点的区 域组织结构或拷贝数有差异阻。 水稻红莲型细胞质雄性不育系和保持系m t D N A 的差异仅见梅启明等的报导晗引油菜波利 马细胞质雄性不育系是在生产上利用的主要的细胞质类型，其不育性与a t p 6 位点的区域嵌 合基因o r f 2 2 4 有关。另一种油菜不育胞质类型的不育性则与a t p 6 基因下游的o r f 2 6 3 有关 2 9 J o 甜菜C M S 不育胞质a t p A 基因附近有重组发生，其序列和转录也发生改变。x u e 等发现不育 胞质m t D N A 存在一个特异的阅读框，它与a t P 6 基因共转录也有研究表明甜菜细胞质雄性不育 可能同一个1 3 k b 的质粒有关训。萝卜细胞质雄性不育性可能同a t p 6 基因有关，因为正常和 不育胞质a t p 6 基因5 端和编码区有差异1 。也有人认为其不育性可能与不育系一段2 5 k b 的N c oI 酶切片段有关，该片段有两个阅读框o r f l 3 8 和o r f l 5 8 ，其中o r f l 3 8 只在不育胞质中 转录，推测可以编码一个1 6 k D 的蛋白旧引。以上几种植物与其细胞质雄性不育有关的基因中， 最有可能是雄性不育基因的是嵌合基因，尽管不同植物的嵌合基因各不相同，但都有类似的 结构，即有功能的5 调控区域通过重复序列与阅读框衔接。 1 1 2 3 与细胞质雄性不育有关的基因或片段的转录 玉米T - C M S 细胞质雄性不育基因u r f 一1 3 最初是利用不育和可育细胞质线粒体总R N A 分 别同不育线粒体D N A 文库通过差次杂交发现的引。O R F l 3 序列能同和1 1 k b 、1 5 k b 、1 8 k b 和2 O k b 、3 9 k b5 种R N A 分子进行杂交，当引入核恢复基因后该序列则仅同6 0 0 b p 和1 6 k b 的R N A 分子杂交，而且转录产物丰度大大下降。保持系和育性回复突变等可育胞质因为没有 该基因序列，从而检查不到任何转录产物。玉米S - C M S 雄性不育有关的序列转录产物为1 6 k b m R N A ，当引入核恢复基因r f 3 转录产物1 6 k b ，m R N A 含量下降。 使矮牵牛雄性不育基因位点S - p c f 中的三个基因n a d 3 、p c f 和r p s l 2 一同转录，S l 核 酸酶作图发现S - p c f 存在三个转录起点和两个个转录终点。p c f 仅在不育系中表达，并且花 药中的表达量是子房和叶片中的4 - 5 倍n 引，由此可见雄性不育基因p c f 的表达有组织特异性。 与向日葵细胞质雄性不育有关的基因o r f 5 2 2 附近a t p A 基因与保持系的保持一致，但是转 录产物却不同，前者转录产物为3 2 k b 、3 O k b 、2 8 k b 、2 3 k b 、2 O k b 和1 8 k b6 种m R N A ，后 者只2 3 k b 和2 O k b 两种。对另一类型的向日葵不育胞质C M SB a s o a t p A 位点转录分析同样发现 不育系和保持系不同，不育系多出3 种转录分子( 2 5 k b ，1 2 k b 和2 5 0 b p ) ，尽管不育系和保持 系a t p A 基因完全一致。出现上述差异的原因是不育系有一个新的阅读框o r f 5 2 2 与a t p A 共转录 【3 5 】 。 o 与T - C M S 小麦不育有关基因o r f 2 5 6 ，不育系F 。杂种均能转录，但不受核恢复基因影响。 与油菜波利马不育系不育性有关的o r f 2 2 4 阅读框与a t p 6 基因共转录，而当引入核恢复基因 后，o r f 2 2 4 和a t p 6 单独转录分别产生2 个和1 个m R N A 分子m 1 。高粱不育系C O XI 基因位点 转录产生3 3 k b 和3 2 k b 、2 2 k b3 种m R N A 分子，而正常胞质则产生3 4 k b 、2 6 k b 、2 3 k b 、 河南农业大学硕士学位论文 1 - 8 k b4 种分子。萝卜与不育有关的基因o r f l 3 8 只在不育胞质中转录。 综上所述，虽然与细胞质雄性不育有关的基因各不相同，但其不育系和保持系的转录产 物均有差异，而且有的仅在不育系中表达。除个别情况以外( 如小麦的o r f 2 5 6 等) 核恢复基 因都会影响它们的表达。另外，上述与不育有关的基因位点的转录往往具有组织特异性。 值得一提的是近年来有关R N A 编辑与细胞质雄性不育关系的研究。线粒体基因转录产物 R N A 的编辑普遍存在口7 3 8 1 。R N A 编辑有的与植物细胞质雄性不育有关，1 w a h a c h i 等刚发现 B T C M S 水稻不育系正常的a t p 6 基因与保持系的序列相同，只是下游与保持系存在差异，当 引入恢复基因以后该a t p 6 基因转录产物由原来的2 O k bm R N A 变为1 5 k b 和0 4 5 k b 两个 m R N A ，且发现2 O k b 的m R N A 分子只是部分编辑，而1 5 k b 、0 4 5 k b 的R N A 则全部编辑。 最能说明编辑与C M S 关系的例子是小麦线粒体基因a t p 9 ，与正常品系相比不育系a t p 9 表达R N A 编辑不仅不完全，且有U A 、G A 、A G 等新的编辑形式，由于出现C u 从而使 3 7 位密码子处产生终止密码子，而当引入合适的显性恢复基因后，正常的编辑则会被恢复 1 。用转基因技术把编辑和未编辑的a t p 9 基因转化烟草原生质体，结果显示导入编辑a t p 9 基因的再生植株全部可育，而导入未编辑a t p 9 基因的再生植株却表现出雄性不育H 。一般 认为细胞质雄性不育可能与线粒体R N A 编辑的偏离和不充分有关，由于编辑位点常位于密码 子的第一、二位，而且大多数为C u ，因而编辑有可能改变编码蛋白的氨基酸序列，甚至 造成蛋白分子的截短或延长，进而影响蛋白的功能【4 2 1 。 1 1 2 4 线粒体蛋白质与雄性不育 植物线粒体蛋白质组含有2 0 0 0 - 3 0 0 0 个基因产物，而线粒体基因组本身只编码包括氧 化磷酸化、细胞色素C 、核糖体复合物的亚基等3 0 4 0 种蛋白质，其它由核基因编码的线粒 体蛋白质大部分是线粒体基因转录和翻译系统的组成成分H3 4 引。线粒体拥有自己的D N A ( m t D N A ) ，可以进行转录、翻译和蛋白质合成。线粒体蛋白质只有2 是线粒体自己合成的， 9 8 的线粒体蛋白质是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后运往线粒体的，线粒体是真核细 胞非常重要的细胞器，在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用。 线粒体总蛋白可用聚丙烯酸胺凝胶电泳或双向电泳加以分析。线粒体合成蛋白的研究则 可用线粒体体外翻译方法。而对特定基因表达蛋白的确定和分析则常与免疫学方法，其策略 如下：将有关O R F 克隆到大肠杆菌表达载体中合成融合蛋白，将其纯化制备抗体，通过与线 粒体多肽的免疫反应( E L I S A ) 确定O R F 与C M S 的关系。也可根据O R F 的核苷酸序列人工合成 寡聚多肽，再制备抗体，从而鉴定特异的线粒体多肽。 与T - C M S 玉米C M S 有关的线粒体多肽研究最为深入。1 9 7 8 年F o r d e 等H 引。运用线粒体 体外翻译技术发现T - C M S 玉米不育系合成特异的1 3 K D 蛋白。D e w e y 等发现了u r f 一1 3 ，他们 用人工合成的该基因寡聚多肽以及w i s e 等用u r f l 3 导入大肠杆菌合成的蛋白制备抗体，都 证明了该基因能够合成1 3 k D 的多肽H 6 4 引；C h a u m o n t 等【4 8 】将u f r - 1 3 转入烟草，同样在转化 植株中检测到了1 3 K D 蛋白。该1 3 k D 蛋白只在不育系中才有合成，当引入核恢复基因后其丰 河南农业大学硕士学位论文 度显著下降。 与矮牵牛C M S 有关的p c f 基因编码2 5 K D 蛋白，该基因的表达有组织特异性，其产物主 要集中在小孢子发生组织中旧。在向日葵中，与C M S 有关基因o r f 5 2 2 编码1 6 K D 多肽，该基 因的表达也有组织特异性，产物主要集中在雄性小花中啪1 。T - C M S 小麦中，与C M S 相关基因 o r f 2 5 6 表达产生7 k D 的线粒体内膜蛋白，而普通小麦和可育杂种均未检测到该多肽的存在 哺。与萝卜C M S 有关o r f l 3 8 编码1 6 k D 蛋白，恢复基因可降低花蕾中该多肽的丰度。在甜菜 S 。- C M S 系统中，叶片可以合成特异的6 k D 线粒体多肽，但是在根中却检测不到。与大豆C M S 有关基因o r f 2 3 9 可编码2 7 k D 蛋白，且只存在于生殖器官中嵋纠。另外，在对高粱、胡萝卜以 及虾蒴草线粒体体外翻译研究时均发现有特异多肽的合成，其多肽分别为4 2 K D 、1 7 K D 和 1 8 K D ，不过这些多肽与基因的关系不明确。 以上结果显示，大多数材料胞质不育系线粒体能合成一个特异的多肽，且有的多肽已经 证明是与C M S 有关的基因编码的，并主要集中在小孢子发生组织中，但是也有的不育系缺少 某一特异多肽的合成，这表明不同材料的细胞质雄性不育机理可能有所不同。 1 1 3 转基因植物研究 确定基因功能最有效的方法就是转基因研究以及反义R N A 技术，这两种技术也是证明基 因功能最有力的证据。但至今尚无完备的技术可直接将外源基因导入线粒体。 植物线粒体蛋白大多由核基因编码，这些蛋白在细胞质中合成以后再输入线粒体。对众 多核编码的线粒体蛋白序列分析发现它们均有一段共同的序列称之为引导序列( t a r g e t i n g S e q u e n e e ) ，正是通过引导序列将它们引导到线粒体功能部位。因此，可以将线粒体基因与 引导序列融合后转化植物来研究线粒体基因的功能旧引H e m o u l d 等运用上述技术将小麦a t p 9 基因c D N A 导入烟草并获得转化植株。转化植株经P C R 分析表明，线粒体基因a t p 9 已被整合 入烟草核基因组，并证实该新整合的位点遵循孟德尔遗传规律。通过N o r t h e r n 杂交分析表 明，整合线粒体基因可以正常转录产生具有p o l y A 的m R N A 。用前导肽作为抗原制备抗体， 并经酶标免疫学反应( E L I S A ) 证实确有细胞质合成的a t p 9 基因融合蛋白进入了线粒体。转基 因植株育性观察发现，含编辑a t p 9 的转化植株皆为可育，而含未编辑a t p 9 的转化植株有的 可育，有的半不育，有的完全不育。可见对小麦而言a t p 9 基因转录产物是否编辑会对细胞 质雄性不育性产生很大的影响【5 引。 C h a u m o n t 等H 副采取类似的技术对玉米u f r - 1 3 基因的功能进行了研究。结果在含引导 序列的转化烟草植株的线粒体膜部位检测到T - u f r - 1 3 的表达产物U R F l 3 ，而在无引导序列 的对照组中则没有产生U R F l 3 。这说明了u f r - 1 3 确实表达产生一个1 3 k D 的分子，并且是一 个膜蛋白。但实验发现只有极少一部分转化植株有部分和完全不育的表型，u f r 一1 3 的表达 与不育似乎没有相关。作者对此的解释是：表达蛋白U R F l 3 量不够，不足以引起细胞质雄 性不育；烟草中可能缺少类似于T - C M S 型玉米中的某种物质，该物质在T C M S 玉米中与 U R F l 3 蛋白相互作用才导致花粉的败育；也可能是U R F l 3 融合蛋白N 端1 8 个氨基酸的前 河南农业大学硕士学位论文 导肽影响了雄性不育性的表达；或许U R F l 3 根本就不会造成细胞质雄性不育，这一点与以 往的研究结论不一致。 W i n t z 对矮牵牛p c f 也进行了类似的研究，结果显示：转基因烟草和转基因矮牵牛线 粒体中均检测到了p c f 的表达产物2 5 k D 蛋白；转基因矮牵牛中2 5 k D 蛋白的表达位置与细 胞质雄性不育矮牵牛2 5 k D 蛋白的表达位置不同，前者仅存在于线粒体基质中，而后者在线 粒体膜和基质中都有出现，两者2 5 k D 表达时期与部位也不同，转基因矮牵牛在减数分裂后 期花药的绒毡层中表达，而雄性不育矮牵牛在减数分裂前期花药的小孢子发生组织和绒毡层 中均有表达；转化烟草和转化矮牵牛均未发现不育株晦5 1 。以上玉米T - C M S 型胞质和C M S 矮牵牛与细胞质雄性不育有关的线粒体基因是所有植物中研究最为深入的，但在转基因植物 研究中并未能出现预期的结果。对于这一情况还应进行细致的研究分析，毕竟线粒体基因转 基因研究还未成熟，其中还有许多细节问题如模式植物背景、前导肽影响等还有待进一步分 析研究。 1 1 4 花粉败育机理研究 细胞质雄性不育最大的特点就是花粉发育不正常，而植物其它组织器官的发育均表现正 常，这表明线粒体的功能是正常的。线粒体功能基因是线粒体行使正常功能必不可少的，这 些基因的任何突变都会对植物产生严重的损伤或致死。因此细胞质雄性不育是线粒体某一关 键基因发生很大变化引起的可能性不大。这一观点同目前对细胞质雄性不育分子机理的研究 相吻合，许多与细胞质雄性不育有关的基因往往是一些经重排产生的嵌合基因，编码的是线 粒体非必需的多肽，即使涉及一些线粒体功能基因，这些功能基因在线粒体基因组中往往也 有正常的拷贝。 那么为什么这一附加多肽或缺陷多肽只是仅仅妨碍雄性配子的发育而导致雄性不育呢? 这可能存在两种解释：附加多肽或缺陷多肽干扰了线粒体功能的正常行使，但不同组织细 胞对此的耐受力不同，线粒体在不同细胞中的重要性不同。与花粉发育有关的组织细胞对线 粒体功能的反应最敏感，依赖性最大，因而也最容易被损害m 1 ；有可能在花药发育过程中 产生某种特殊的物质，它们与这些附加型多肽相互作用而导致花粉发育受阻。这种推测的花 药特异性物质完全有可能存在，因为花药执行特殊的功能，很多物质如胞粉素等只在花药中 合成。但是迄今为止分离这些花药特异物质的尝试都没有取得成功。 “毒性假说”解释了T - C M S 型玉米U R F l 3 蛋白导致细胞质雄性不育的机理，该假说认为 U R F l 3 本身就是一种毒蛋白，它与线粒体内膜结合形成一个通道，从而导致线粒体膜通透性 增强，基质内离子外泄，正常膜电势降低，能量合成受阻，尽管它有可能对T - C M S 玉米整株 细胞都存在毒性，但对它花药的毒性更大，从而最终导致花粉败育。 综上所述，植物雄性不育性作为一种性状，是一个极其复杂的分子生物学过程，涉及育 性基因在特定时空的表达，以及体外因子对这种表达的影响和调节等因素。目前已成功克隆 了许多与C M S 有关的m t D N A 片段，分析c p D