药剂学毕业论文ppt课件

基于纳米混悬技术的难溶性中药有效部位给药系统的研究,课题支持,国家新药创制重大专项（2009ZX09103-349）,内容提要,引言,1,实验部分,2,全文结论,3,致谢,4,引言,纳米混悬给药系统（Nanosuspension，简称NS）,引言,据统计，中药药效物质中约有50%为水难溶性药物。,难溶性中药有效部位,瓶颈问题,引言,波棱瓜子为葫芦科植物波棱瓜（Herpetospermumcaudigerum)的干燥成熟种子，具有清热解毒，去火降热，助消化等功效。,总木脂素,活性部位,波棱瓜子,临床用途,赤巴病、黄疸型肝炎、胆囊炎、消化不良等。,结构分析,苯并呋喃木脂素类成分。,BCS类难溶性药物,引言,主要化学成分结构式,波棱酮(Herpetone),波棱素(Herpetin),波棱芴酮(Herpetfluorenone),波棱酚(Herpetenol),波棱甲素(Herpetrione),引言,技术路线,总木脂素,纳米混悬剂,制备工艺研究,固体化研究,体外溶出度考察,体内药代动力学研究,药效学研究,粉末,稳定性考察,形态学考察、粒径和多分散度测定,再分散性评价,波棱瓜子,提取纯化工艺研究,实验部分,HTL的制备,HTL-NS的制备,HTL-NS的固体化研究,HTL-NS的体内药代动力学研究,HTL-NS的药效学研究,主要内容,HTL的制备,一.评价标准的建立,HPLC法,出膏率=所得膏率/药材的投入量100%,波棱甲素得率=干膏中波棱甲素的含量/药材中波棱甲素的含量100%,波棱甲素的含量,出膏率,波棱甲素得率,HTL的制备,二、提取工艺的考察,1.吸水率的考察方法：,药材粗粉,10倍量水浸泡,每隔30min观察1次,收集未被吸收的水液,直至完全浸透,结果：波棱瓜子药材的吸水率为210%。,HTL的制备,2.正交试验优化提取条件以波棱甲素含量为指标，考察溶剂用量、提取时间、乙醇浓度、提取次数四个因素，三个水平。,表1提取因素水平,HTL的制备,表2HTL提取工艺正交试验表,HTL的制备,表3HTL提取工艺正交试验方差分析表,从直观分析和方差分析结果可以看出，四个影响因素的主次顺序为DBCA，其中D有显著性意义。最佳组合为A2B3C3D3，即7倍量的90%乙醇提取3次，每次3小时。考虑到实际生产中降低成本、生产效率等因素，确定最佳提取工艺为A1B1C2D3，即5倍量的80%乙醇提取3次，每次1小时。,HTL的制备,3.提取工艺的验证分别称取波棱瓜子药材粗粉100g，共6份，其中三份按正交试验所得的最佳制备工艺(A2B3C3D3)，另外三份按次最佳制备工艺(A1B1C2D3)。滤过，合并滤液，回收乙醇，65真空干燥。,表4验证试验结果,HTL的制备,4.波棱瓜子药材中波棱甲素提取率的考察取波棱瓜子药材粗粉100g，按A1B1C2D3提取；另取波棱瓜子药材粗粉5.0g，按质控分析方法提取。分别测定波棱甲素的含量，计算波棱甲素的提取率。,表5波棱甲素提取率的考察结果,结果显示，该提取工艺对波棱瓜子药材中的波棱甲素提取率较高，工艺可行。,HTL的制备,三、精制纯化工艺的考察,1.色素工艺的考察波棱瓜子药材提取液中含有大量的叶绿素，其在冷乙醇溶液中的溶解度较小，放置过程中会大量析出。,6h,12h,24h,HTL的制备,2.除油工艺的考察波棱瓜子药材提取液中含有大量的脂肪油，和本品的功能主治无关，而且润肠致泻，必须将之除去。通过静态放置试验发现，该脂肪油密度比水小，通过静置后油水分离效果很好。因此，考察不同静置时间对除油效果的影响。,结果表明，静置12小时后油水分离效果最好。,HTL的制备,3.分离纯化工艺的考察为减少服用剂量，同时利于干燥、粉碎、减少吸湿、潮解及成型等问题，需对乙醇提取液进行纯化。由于目标成分是带有酚羟基的木脂素类化合物，因此，本研究对碱溶酸沉和萃取两种方法进行了考察，结果表明用乙酸乙酯萃取的方法较好。,HTL的制备,4.精制纯化工艺的验证方法：,波棱瓜子粗粉,乙醇提取液,浓缩液,静置24小时后，过滤，浓缩至无醇味,浸膏,静置12小时后，分去油层,乙酸乙酯溶液,1倍量乙酸乙酯萃取4次,HTL,50减压浓缩干燥,HTL的制备,表6验证试验结果,结果显示，该精制纯化工艺稳定可行。,HTL的制备,四、HTL质量控制研究,（1）总木脂素的含量测定；（2）波棱甲素的含量测定。,（1）干燥失重；（2）炽灼残渣。方法参照中国药典2005版。,棕色粉末，味苦。,以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶板展开剂：二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(3:2:0.2)显色剂：20%硫酸乙醇溶液,性状,检查,鉴别,含量测定,质量标准,HTL的制备,五、HTL固体状态的稳定性考察,称取HTL原料药约1g，置于量瓶中。分别于第0、1、2、4、6个月取样，采用HPLC法测定波棱甲素的含量。,图1稳定性试验结果,结果显示，HTL固形物中波棱甲素的含量在6个月内基本保持不变，理化性质稳定。,HTL-NS的制备,研磨法,微乳法,纳米沉淀法,高压乳匀法,HTL-NS的制备,1.制备工艺的初步确定,采用高压乳匀法制备HTL-NS。先将波棱瓜子总木脂素原料药和表面活性剂加入适量蒸馏水中，充分搅拌混匀，然后进行高速探头超声乳化，最后高压乳匀，得HTL-NS。,一、HTL-NS制备工艺的考察,HTL-NS的制备,2.表面活性剂的考察,为了得到稳定的纳米混悬剂，避免纳米粒子的凝聚和增大，制备过程中需加入一些表面活性剂。表面活性剂的种类、用量及用法均会不同程度影响纳米粒的粒径、分散性和稳定性，因此，制备不同的纳米粒宜选择相适宜的表面活性剂。,HTL-NS的制备,（1）表面活性剂种类的筛选,表7表面活性剂种类的筛选,本研究以平均粒径和体系观察为指标，考察了Poloxamer、吐温80、卵磷脂、SDS、PVPK30、PVA等常用表面活性剂。,HTL-NS的制备,（2）表面活性剂用法的考察,为了进一步优化表面活性剂的使用，充分发挥其作用，本课题还对表面活性剂的使用方法经行了研究，考察了SDS和PVPK30在单用和合用时，对粒径和体系稳定性的影响。,结果表明，将两种辅料合用，制备HTL-NS时效果更佳，粒径更小，且体系更稳定。,HTL-NS的制备,3.高压乳匀参数的考察,在HTL-NS的制备过程中，除了表面活性剂的使用，高压乳匀过程也是影响粒径和体系稳定性的一个重要因素。本课题以粒径和体系观察为指标，对高压乳匀的压力和循环次数进行了考察。,结果表明，在1000bar压力条件下高压乳匀10次，制备得到的HTL-NS效果最佳。,HTL-NS的制备,4.处方设计及优化以粒径为指标，考察主药与辅料的比例、SDS与PVPK30的比例，主药与蒸馏水的比例三个因素，三个水平。,表8因素水平表,HTL-NS的制备,1,2,3,3,9,3,1,2,3,8,2,3,1,3,7,2,1,3,2,6,1,3,2,2,5,3,2,1,2,4,3,3,3,1,3,2,2,2,1,2,1,1,1,1,1,D,C,B,A,试验编号,表9正交试验表,HTL-NS的制备,表10方差分析表,根据直观分析和方差分析表可见，三个因素影响的主次顺序为ABC，其中A、B的影响有显著意义，最佳组合为A2B2C3。考虑到蒸馏水加入量过大，会影响干燥效率，同时主药：蒸馏水的影响没有显著意义，因此选择A2B2C1为制备HTL-NS的最佳工艺，即主药：辅料为20:3，SDS：PVPK30为2:3，主药：蒸馏水为1:20。,HTL-NS的制备,5.制备工艺的验证,制备工艺：,HTL,SDS、PVPK30,加入适量蒸馏水，充分搅拌均匀,2000r/min高速探头超声乳化,1000bar压力下高压乳匀10圈,HTL-NS,HTL-NS的制备,按上述工艺制备三批HTL-NS，测定平均粒径及多分散度指数。,表11HTL-NS三批验证结果,三批验证结果显示，其平均粒径的范围在200-300nm之间，PdI的平均值为0.137，粒径大小符合标准，且分布均匀，说明该工艺稳定可行，重现性好。,HTL-NS的制备,1.表面形态观察,方法：取HTL-NS加适量蒸馏水稀释后，滴加至锡箔纸上，常温下放置，待溶剂挥干后，于扫描镜下观察其形态并拍摄照片。,二、HTL-NS形态学考察,由图可见，按照最佳工艺制备的HTL-NS，纳米在扫描电镜下呈不规则球形，大小均匀。,HTL-NS的制备,2.粒径及多分散度的测定,方法：取HTL-NS适量，加蒸馏水稀释后，放入粒径测定仪中，进行粒径和多分散度的测定。,结果表明，HTL-NS的平均粒径为239.9nm，多分散度指数为0.140。说明按照最佳工艺制备的HTL纳米粒粒径小，粒径分布均匀，范围窄。,HTL-NS的固体化研究,HTL-NS为溶液，属于热力学不稳定体系，物理稳定性存在担忧，另服用携带不方便，非常必要将其固体化，以提高稳定性的同时，方便患者使用。研究发现，纳米混悬液固体化后常出现粒径明显变大、粒子发生聚合、储存过程老化等再分散性差问题。因此，固体化再分散后溶液是否还呈纳米状态，是关键的科学技术问题，也是制约药物纳米发展的瓶颈问题。,HTL-NS的固体化研究,一、干燥方法的选择,喷雾干燥,真空干燥,冷冻干燥,HTL-NS的固体化研究,二、保护剂的选择,采用冷冻干燥后，虽然粒径仍呈纳米状态，但是固体化前后粒径变化较大，且外观不好。为了改善这一情况，则需要在干燥前加入适量的保护剂。,表12保护剂的评价方法及标准,HTL-NS的固体化研究,1.保护剂的考察,按最佳工艺制备HTL-NS，分别加入不同浓度的葡萄糖、甘露醇、乳糖、山梨醇作保护剂，充分混匀后，进行冷冻干燥。干燥结束后，按上述标准进行评价。,表13各处方冻干品评价结果,HTL-NS的固体化研究,2.冻干HTL-NS的制备工艺验证,按最佳工艺制备冻干HTL-NS，测定平均粒径、多分散度指数、粒径变化差值和再分散性。,表14冻干HTL-NS三批验证结果,三批验证结果显示，平均粒径范围在200-300nm之间，多分散度指数的平均值为0.196，平均粒径变成差值为28nm，粒径大小符合纳米标准，且分布均匀，固体化前后粒径变化小，再分散性好，说明最佳工艺稳定可行，重现性好。,HTL-NS的固体化研究,3.冻干HTL-NS的稳定性考察,按最佳工艺制备冻干HTL-NS三批，常温下放置3个月后，测定平均粒径、多分散度指数、粒径变化差值和再分散性。,HTL-NS的固体化研究,4.HTL-NS的体外溶出度考察,（1）溶出介质的考察在HTL中，大多数木脂素都含有-OH，因此在酸性溶液中溶解性较差。现选用pH=6.8的磷酸盐缓冲液和pH=7.5的磷酸盐缓冲液两种不同溶出介质进行HTL-NS的溶出度比较试验。,HTL-NS的固体化研究,（2）溶出体积的考察,溶出介质的体积需符合药物漏槽条件，即溶出介质的量要超过药物全部溶解时所需要的介质量，至少为药物溶解用量的三倍以上。同时还需考虑高效液相色谱法含量测定时的最低检测限，故将溶出介质的体积定为900ml。,HTL-NS的固体化研究,（3）溶出度测定方法的建立,色谱条件：AlltimaC18色谱柱(5m，2504.6mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(24:76)；流速：1.0ml/min；检测波长：240nm；柱温：30。,专属性考察,线性考察,精密度试验,回收率试验,稳定性试验,方法学考察,HTL-NS的固体化研究,（4）HTL-NS胶囊和HTL物理混合物胶囊的制备,取适量干燥至恒重的固体化HTL-NS粉末分装到胶囊中，制成HTL-NS胶囊（每粒含波棱甲素100mg）；另取适量干燥至恒重的HTL粉末按制备HTL-NS的处方比例称取辅料，通过物理混匀后，分装到胶囊中，制成HTL物理混合物胶囊（每粒含波棱甲素100mg），备用。,HTL-NS的固体化研究,（5）溶出度的测定,分别取HTL-NS胶囊和HTL物理混合物胶囊各6粒，量取经脱气处理的pH=7.5磷酸盐缓冲溶液900ml至溶出杯中，加温使溶出介质温度在(370.5)，调转速为100r/min。将胶囊投入溶出杯内，分别于5、10、15、20、30、45、60min时取样按外标法计算出供试品溶液的质量浓度，并计算出每粒的溶出度。,HTL-NS的体内药代动力学研究,1.色谱条件色谱柱：AlltimaC18(5m，2504.6mm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(24:76)；流速：1.0ml/min；检测波长：240nm；柱温：室温；进样量：20l。,一、血药浓度测定方法的建立,2.血浆样品的处理与测定精密移取血浆0.2mL置于具塞离心管中，加入甲醇沉淀蛋白，涡旋振摇30s，3000r/min离心5min，吸取上清液于40用氮气吹干，残渣加入100l甲醇溶解，充分涡旋振荡，3000r/min离心5min，取上清液20l进样测定。,HTL-NS的体内药代动力学研究,3.专属性考察,A.空白B.波棱甲素对照品C.血浆对照品D.HTL-NS血浆浓度,由图可见，血浆中杂质和波棱甲素有较好的分离度，血浆中内源性杂质无干扰，因此本法有较高的专属性。,HTL-NS的体内药代动力学研究,4.标准曲线的绘制以药物浓度(x)对峰面积(Y)作线性回归，回归方程为Y=59.976X7.296，r=0.9989(n=6)，波棱甲素血浆浓度在0.297-11.88g/mL范围内线性关系良好。最低检测限为0.2g/ml。,5.精密度试验血浆中波棱甲素日内平均精密度RSD2.72%(n=5)，日间平均精密度RSD79%，方法平均回收率为98.6%-101.3%，RSD3.5%。,HTL-NS的体内药代动力学研究,实验动物：Wistar大鼠16只，、各半，(20020)g，SPF级给药前禁食12h，不禁水，按体重随机分为2组A组：口服灌胃HTL-NSB组：口服灌胃参比制剂HTL给药剂量：270mg/kg（以波棱甲素计算）取血时间：0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16h采集血样：眼眶后静脉丛取血保存方式:血样经肝素抗凝后分取血浆，冷藏，备用数据处理：3P97药动学软件,二、给药方法、样品采集和数学分析,HTL-NS的体内药代动力学研究,三、药代动力学试验结果,表15波棱甲素大鼠体内药代动力学参数表,0T:HTL-NSfromzeroto14h;HTLfromzeroto10h.,HTL-NS的药效学研究,1.试验方法实验动物：Wistar大鼠40只，、各半，(20010)g，SPF级按体重随机分为4组A组：正常对照组；B组：肝损伤模型组；C组：HTL组；D组：HTL-NS组。造模方法：腹腔注射10%CCl4植物油(按0.5ml/100g体重给予)，每周两次，连续给予12周，正常对照组则给予同体积的生理盐水。给药方法：造模同时每日灌胃给药一次，C、D组按0.081g/kg(以波棱甲素计)给药(按0.5ml/100g体重给予)，A、B组灌胃给予同体积的生理盐水。样品采集：实验结束前，禁食12小时。取股动脉血，3000r/min离心10min，分离血清，测定GPT、GOT、TP、ALB；取肝组织作羟脯氨酸测定，计算肝胶原蛋白含量，同时做组织化学及组织病理学检查。,一、对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响,HTL-NS的药效学研究,2.试验结果,表16对四氯化碳致大鼠慢性肝损伤的影响,与正常组比较#p0.05，#p0.01；与模型组比较*p0.05，*p0.01,与模型组比较，*p0.05，*p0.01,表17对大鼠肝胶原蛋白含量的影响,HTL-NS的药效学研究,正常对照组：肝组织正常结构；B.模型对照组：肝脏较大面积坏死，假小叶形成；C.HTL-NS组：少量纤维增生；D.HTL组：胶原纤维不明显。,HTL-NS的药效学研究,1.试验方法实验动物：昆明种小鼠40只，、各半，(202)g，SPF级按体重随机分为4组A组：正常对照组；B组：肝损伤模型组；C组：HTL组；D组：HTL-NS组。给药方法：C、D组按0.117g/kg(以波棱甲素计)给药，每天2次，连续给药7天，A、B组灌胃给予同体积的生理盐水。造模方法：连续给药7天后，腹腔注射D-GalN800mg/kg(按0.2ml/10g体重给予)，正常对照组则给予同体积的生理盐水。样品采集：造模后20小时，小鼠摘眼球取血，测血清GPT、GOT值，并取肝组织作病理学检查。,二、对D-GalN所致小鼠急性肝损伤的影响,HTL-NS的药效学研究,2.试验结果,表18对D-GalN致小鼠急性肝损伤的影响,与正常对照组比较，#p0.05,#p0.01；与模型组比较，*p0.05，*p0.01,正常对照组：正常肝组织结构；模型对照组：部分肝细胞肿胀、变性；HTL-NS组：个别肝细胞肿胀；HTL组：肝细胞轻度水样变性。,全文结论,1、在确定波棱瓜子抗病毒性肝炎有效部位的基础上，对其总木脂素部位的提取和纯化工艺进行考察，确定了最佳制备工艺。同时建立波棱瓜子总木脂素的质量标准，为波棱瓜子相关药物的开发奠定基础。2、本文采用高压匀质法制备波棱瓜子总木脂素纳米混悬液，通过对表面活性剂、高压乳匀参数的考察，以及正交处方优化，确定制备的最佳工艺。在此基础上，对HTL-NS的表征进行了初步评价。3、为了提高HTL-NS的稳定性，本课题还对其固体化工艺进行了研究。通过对干燥方法和保护剂的考察，最终选用冷冻干燥法，以5%乳糖作为冻干保护剂。同时建立了以波棱甲素为指标的体外溶出度测定方法，对HTL-NS和HTL的溶出行为进行了比较，结果显示，HTL-NS的溶出效果明显优于HTL。,全文结论,本课题在国家重大专项的支持下，将纳米混悬技术应用到难溶性中药有效部位，以BCSII类难溶性药物HTL为模型药，采用高压匀质法制备了中药波棱瓜子总木脂素纳米粒，为我国难溶性中药有效部位的纳米药物产业化提供示