碱基顺序的化学分析法.ppt

3.5核酸碱基顺序分析中的化学方法,DNA化学顺序方法于1977年由A.M.Mamamx和W.Gilbert第一次报道，因此又称为MG法（化学降解法）。这一方法是将模板DNA的一端标记，之后按碱基顺序逐个地将整个大分子断裂，标记的DNA片段的长度或大小与每个碱基的所在位置相对应，当这些反应产物经过变性聚苯稀酰胺凝胶电泳分离后，其代表的DNA顺序便可以从同位素标记的自显影带形上读出。这项技术可以测出距离标记位点250核苷酸以内的DNA序列。经过多年的努力在模板DNA末端标记和特异性化学反应方面都进行了改进，使这一方法成为DNA序列分析的基本方法。,化学降解法测序原理,在MG法测序系统中，一个末端标记的DNA片段在4组或5组互为独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。在这几组反应中通过化学裂解形成的放射性标记的分子具有共同起点放射性标记末端，而其终点不同发生化学降解的位点。每组混合物中的含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在待测DNA全长片段中的位置。此后，将各组反应产物进行序列胶高压电压分离，再通过放射自显影显示序列结果。,原理示意图,方法成败的关键,一、对特定碱基进行化学修饰二、经过修饰的碱基从糖环上脱落，DNA主链在修饰碱基5和3磷酸二脂键断裂。,DNA样品的制备待测DNA样品的末端标记单末端标记DNA片段的分离纯化碱基特异化学裂解反应序列胶高压电泳分解读取序列,化学法测序的一般流程,载体的选择,化学法中用的最多的是Messing及其同事构建的pUC系列载体。它们是化学法测序中比较好的载体。,Puc质粒系列图谱,Psp64/图谱,DNA样品的制备,DNA样品必须是来自转化细胞的单菌落，绝对不含有宿主细胞的染色体DNA及其RNA。1、氯化铯-溴化乙啶梯度平衡离心法纯化质粒DNA。2、寡核苷酸从固相支持物上洗脱下的寡核苷酸不具有5末端磷酸基团。测序前用高压液相柱或电泳技术纯化进行5末端标记。,DNA样品的末端标记,Klenow片段酶介导的标记反应1.在一支微量离心管中加入：具有3凹端的DNA片段3种dNTP混合液Klenow片段酶缓冲液-32P-dATP2.混合均匀后加入0.5微升Klenow片段酶，混匀后置于20-22保温30分钟。3.70加热10分钟终止反应。,单末端标记DNA片段的分离和纯化,一般采用变性DNA的中性琼脂糖凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行分离。最常用的洗脱方法是机械洗脱和电洗脱，目前已有许多种商品化电洗脱装置，性能优良回收率高。,双链DNA的解链及两条链的分离回收,双链DNA的变性1.在一支微量离心管中加入32P标记的DNA片段;变性加样溶液2.混匀后置于90保温2分钟，迅速放入冰浴冷却。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制备一块适宜浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶确定凝胶中放射性标记的DNA片段的位置1.电泳结束后，轻轻去掉一块玻璃板，用保鲜膜盖住胶，再将放射性溶液取几滴于3滤纸条上，置于胶的不对称四点上，用透明胶带固定。将整个凝胶投入X射线胶片暗合内，上面覆盖一张X射线胶片进行放射自显影。室温曝光5-10分钟后显影、定影。不同大小的片段便呈现出来。2.将凝胶上四处人为标记与X射线胶片上相应的显影点重叠，则相应于X射线胶片上DNA单链显影处的凝胶必定含有这个单链的标记DNA片段。用注射器针头沿显影条带四周穿孔并直入凝胶内，再将已被针孔划出范围的凝胶用锐利的刀片切割下来，放入一支离心管中。,从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收DNA,方法一机械性洗脱【碾碎-浸泡-过滤-沉淀法】1、将切下的胶块置于1.5ml微量离心管中2、用干净的玻璃棒将胶块捣碎3、加入400l洗脱缓冲液4、盖好管盖并用parafilm膜封口5、37震荡至少4小时或过夜6、用硅化玻璃棉装入一个1ml枪头7、将洗脱液过滤到一支微量离心管中8、再另加100l洗脱缓冲液到洗脱管中洗脱残余样品9、重复710、用手提式射线监测器监测过滤样品，样品应大部分得以回收11、像过滤样品中加入1.0ml无水乙醇，-70放置5分钟沉淀DNA样品12、在4以15000r/min离心15分钟收集DNA沉淀并在真空下干燥DNA沉淀13、将沉淀重新溶于200l0.3mol/l乙酸钠中，加入500l无水乙醇，-70放置5分钟14、在4以15000r/min离心15分钟15、用95乙醇洗沉淀样品一次，然后真空干燥DNA样品,方法二电洗脱,1、小心将胶条置入一个直径1cm的透析袋中，钳住一端2、加1TBE于透析袋中，赶出气泡3、挤出多余的缓冲液，再扎紧透析袋另一端4、将透析袋置于水平电泳板上用1TBE浸没5、恒压100V电泳6、改变电泳方向，30秒，使样品脱离透析膜7、取出透析袋，用新枪头吸取透析袋中缓冲液到另一新离心管中8、用1/2体积1TBE洗净透析管，并将其吸入样品管中9、用酚抽提洗脱回收样品，然后以乙醇沉淀,通过第二次限制酶酶切及凝胶电泳分离回收末端标记的DNA片段,第二次限制性酶酶解将干燥的DNA样品溶于适量体积的双蒸水中，溶解完毕，加入：10限制酶缓冲液合适的限制性内切酶补充灭菌双蒸水至总体积为20l，混匀后于37保温2小时若酶切反应完全，像酶切反应液中加入5ul加样缓冲液非变性聚丙烯凝胶电泳分离,合成的寡核苷酸DNA样品的5末端标记,合成的寡核苷酸DNA测序前应用T4多核苷酸激酶进行5末端标记。1、取100ngoligo样品溶于20l双蒸水中，加入：10T4多核苷酸激酶T4多核苷酸激酶-32P-ATP2、混匀后置于37保温30分钟3、加入10ul加样缓冲液以终止反应4、上样于20非变性聚丙烯酰胺凝胶，以300V电泳适当时间5、放射自显影和洗脱,特异性的碱基化学裂解反应,碱基特异性地裂解反应包括：先对特定碱基进行化学修饰；碱基的消除：是修饰的碱基从糖环上脱落。要确保每一个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰。随后用哌啶裂解修饰碱基的5和3位置。得到一组长度从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子，比较G,A+G,C+T,C各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列,测序流程图,合成的寡聚核苷酸的MG测序法,合成的100碱基以下寡聚核苷酸的测序方法唯一不同之处在于碱基修饰反应的时间。G反应20分钟G+A反应为1小时T+G反应为1小时C反应应为1小时切割产物可用20的变性PAGE胶进行分离,序列胶高压电泳及序列的阅读,核苷酸顺序的阅读化学裂解反应并不完全是绝对碱基特异性的，四条带为G，G+A，C+T，C。这些带分别来自G，G+A，C+T，C处断裂的DNA片段中心的两条带G+A，C+A，含有所有标记DNA的降解产物。需要通过从C+T泳道出现的条带中扣除C泳道的条带而推断T残基的位置，同样的，A残基的位置也要通过从A+G泳道的条带推断出来。读片时应从底部开始，越靠近标记端断裂的那些产物越接近胶片的底部。,MG法与Sanger双脱氧链终止法的比较,与进行合成反应的双脱氧链终止法不同，MG法是对待侧DNA进行化学降解。应该说，这一方法是在体外研究Iac阻抑物与Iac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。因此，MG法所独具的鲜明的特点是可以探测DNA构象和蛋白质-DNA相互作用。然而，由于种种原因（如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等），MG法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。随着M13噬菌体和噬菌粒载体的发展，加上酶学方法的改进以及双链DNA测序技术的发展，双脱氧链终止法如今比MG法应用广泛。然而，化学降解法较链终止法具有一个明显的优点：所测序列来原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝。因此，MG法有着Sanger法所不具有的特殊用途：可以对合成的寡核苷酸进行测序；可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况：可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用等。然而，由于Sanger法既简便有快速，因此是目前最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。,双脱氧链终止法M13单链测序系统,双脱氧链终止法测序是Sanger等于1977年建立起来的。该法测序原理简单，操作容易，均能我饿诶一般实验室所接受，目前成为世界各实验室测序的主要方法。在Sanger链终止测序的基础上，逐渐形成了越来越完善的序列测定系统。早期，通过分子克隆技术将目的DNA插入到单链线状噬菌体M13载体上，提取单链模板用于序列测定。而随着技术的改进和发展，目前双链DNA的测序水平已基本接近M13系统。因此，可以相信质粒系统将越来越被广泛应用。近几年，由于高温DNA聚合酶广泛应用于双脱氧链终止法测序，故建立了更为简单、方便的测序方法，可以直接对体外扩增DNA产物进行序列测定，不必将其克隆在载体上。,双脱氧链终止法的测序原理,酶学原理：在正常的体外合成反应体系中，加入的核苷酸单体为4种2-脱氧核糖核苷酸三磷酸、这一反应体系中，引物与模板退火形成双链区后，DNA聚合酶便结合到DNA双链区上而启动DNA的合成：在引物的引导下，聚合酶在模板链上沿3-5的方向移动，利用体系中的4种核苷酸聚合成一条与模板链互补的DNA新生链。,机构图,然而在体外合成的反应体系中加入双脱氧核苷三磷酸，DNA合成情况则完全不同。这些双脱氧核苷三磷酸在DNA聚合酶的作用下，通过其5三磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端的脱氧核糖3-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有3-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链终止。如果再加入一种一定比例的ddNTP，则新合成的DNA在可能掺入正常DNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于竞争，因此，产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。这些片段具有共同的起点引物的5端，而有不同的终点，其长度取决于ddNTP掺入的位置与引物5端之间的距离。,原理图,载体系统,具有特殊生活周期的单链丝状噬菌体M13是Sanger双脱氧链终止法测序工作的最先选择。在M13的生活周期中，既有复制型双链DNA，又有单链DNA形式。前者可以作为克隆的载体，后者可以作为序列测定的模板。因此，可以将目的DNA与M13RF双链DNA相连而达到克隆的目的，然后提取成熟的M13噬菌体并纯化单链DNA作为测序模板。M13载体系统用于序列测定载体有它的优点。目前常用的M13载体为M13mp18与M13mp19.,M13系统单链DNA的序列测定,M13DNA物理图谱,M13/1918图,M13载体系统的双脱氧测定图,从,M13载体系统的双脱氧链终止法序列测定,单链模板DNA的制备双脱氧测序反应序列胶高压电泳及放射自显影DNA序列的阅读,单链模板DNA的制备,将待测目的DNA插入到M13载体上的MCS中，通过转染受体菌获得重组克隆的噬菌体。M13感染细胞后并不使细胞裂解，但感染的细胞生长缓慢，并不断释放成熟的噬菌体，一个细胞在噬菌体复制的每一代释放出200左右的噬菌体。在液体培养基培养感染细胞时，噬菌体不断从细胞中释放出来并在培养基内积累。从单一噬菌斑形成的噬菌体