石斛兰试管开花及其分子机制研究-硕士论文

分类号：S 6 8 2 3 1 ，Q 8 1 3 密级： 福建农林大学硕士学位论文 单位代码：1 0 3 8 9 学号：1 0 7 2 2 0 6 石斛兰试管开花及其分子机制研究 学科门类：农学 一级学科名称：林学 二级学科名称：园林植物与观赏园艺 研究方向：园林植物生物技术 研究生：李璐 指导教师：赖钟雄研究员 完成时间：二0 0 年四月 f f f f f f f I I f f f f f 删 9 6 3 S e c o n dR a n kD i s c i p l i n e ：O r n a m e n t a l P l a n t sa n d H 0 r t i c ul t ur e R e s e a r c hF i e l d ：B i o t e c h n o l o g yi nO r n a m e n t a lP l a n t s P o s t g r a d u a t e ：L iL u S u p e r v i s o r ：P r o f L a iZ h o n g x i o n g S u b m i t t e dT i m e ：A p r i l ，2 0 1 0 I n s t i t u t eo fH o r t i c u l t u r a lB i o t e c h n o l o g y F u ji a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y F u z h o u3 5 0 0 0 2 P R C h i n a 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：杏 日期：wf D 占、，D 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 指导教师亲笔 日期：l u 6 ，D 陬己、L o 福建农林大学硕士学位论文 目录 目录 缩写词I 摘要I I A b s t r a c t I V 第一章引言l l 植物试管开花研究进展一2 1 1 植物试管开花2 1 2 植物开花诱导的分子机制2 2L R R - R L K 基因分子生物学研究进展3 2 1L R R - R L K 基因的功能4 2 2L R R - R L K 基因的克隆及表达研究5 3 实时荧光定量P C R 技术及其在植物中的应用5 4 兰科植物试管开花研究进展6 4 1 兰科植物试管开花研究进展6 4 2 石斛兰试管开花研究进展7 5 本研究的意义和内容1 2 5 1 本研究的意义1 2 5 2 本研究的主要内容1 2 第二章石斛兰离体再生体系的优化。1 3 l 材料与方法13 1 1 材料1 3 1 2 方法。13 2 结果和分析1 5 2 1 春石斛快速繁殖条件的优化1 5 2 2 铁皮石斛快速繁殖条件的优化。2 0 3 讨论2 3 3 1 香蕉匀浆物和6 - B A 在石斛兰原球茎的增殖中的作用2 3 3 26 - B A 对长期继代保存的材料复壮的影响2 4 3 3 香蕉匀浆物对长期继代保存的材料复壮的影响2 4 3 4 长期继代保存的材料在适当的条件下能够正常壮苗生根2 4 3 5 综合赋值分析法在植物组织培养统计中的应用2 5 第三章石斛兰的试管开花。2 6 第一节春石斛的试管开花。2 6 l 材料和方法2 7 1 1 材料。2 7 1 2 方法2 7 2 结果和分析2 9 2 1 不同基本培养基对春石斛试管苗花芽诱导的影响2 9 2 26 - B A 对春石斛试管苗花芽诱导的影响2 9 2 3 改良M S 培养基对6 - B A 诱导春石斛试管苗花芽的影响3 0 2 4Z T 对春石斛试管苗花芽诱导的影响3l 2 5T D Z 对春石斛试管苗花芽诱导的影响。3 1 2 6 不同浓度马铃薯添加物对春石斛试管苗花芽诱导的影响3 2 祸建农林大学硕士学位论文目录 2 7T D Z 、转瓶时间和添加物综合作用对春石斛试管苗花芽诱导的影响3 2 2 86 - B A 、转瓶时问和和添加物对春石斛试管苗花芽诱导的影响3 2 2 9 A B A 和转瓶时间对春石斛试管苗花芽诱导的影响3 2 2 1 0 综合N 含量、N H 4 + - N ：N 0 3 - N 比例、P 含量、T D Z 、糖、椰汁、低温和P P 3 3 3 等因素对 春石斛试管苗花芽诱导的影响3 2 3 讨论3 9 3 1 多种控制途径均可诱导石斛兰试管成花3 9 3 2 营养元素在春石斛试管苗诱导试管花中的作用3 9 3 3 激素在春石斛试管苗诱导试管花中的作用4 0 3 4 温度和光照影响春石斛试管苗成花4 l 3 5 附加物在春石斛试管苗诱导试管花中的作用4 l 3 6 材料的状态对春石斛试管苗诱导试管花中的影响4 l 第二节铁皮石斛试管开花4 2 1 材料与方法4 2 1 1 材料。4 2 1 2 方法。4 2 2 结果和分析。4 2 2 16 B A 对铁皮石斛试管苗花芽诱导的影响4 2 2 2T D Z 对铁皮石斛试管苗花芽诱导的影响。4 3 3 讨论。4 4 第四章春石斛L R R - R L K 基因的克隆4 5 l 材料和试剂4 5 1 1 供试材料。4 5 1 2 方法。4 5 2 结果与分析4 8 2 1 春石斛总R N A 的提取4 8 2 2 春石斛原球茎L R R - R L K 基因保守区的克隆4 8 2 3 石斛兰P L BL R R - R L K 基因3 R A C E 的克隆5 0 2 4 春石斛L R R - R L K 基因保守区和3 端的拼接及分析5 l 3 讨论5 3 3 1 多糖多酚类植物总R N A 的提取5 3 3 2 春石斛L R R R L K 基因克隆的意义5 3 第五章春石斛花芽形成过程中L R R - R L K 基因表达分析5 5 第一节春石斛原球茎中E F - l a 基因的克隆5 5 l 材料和方法5 5 1 1 材料。5 5 1 2 方法。5 5 2 结果与分析5 6 2 1 春石斛原球茎总K N A 的提取结果5 6 2 2 春石斛原球茎E F - l a 基因保守区扩增结果5 7 2 3 春石斛原球茎E F - l a 基因片段序列分析5 7 3 讨论5 9 第二节春石斛花芽形成过程中L R R - R L K 基因表达分析6 0 l 材料和方法6 0 目录 1 1 材 s 6 0 1 2 主要试剂和仪器6 0 1 3 方法6 0 2 结果与分析一6 2 2 1R N A 纯度和完整性6 2 2 2 标准曲线的建立6 3 2 3 目的基因和内参基因的特异性扩增一“ 2 4 春石斛花芽形成过程中L R R - R L K 基因的表达量差异6 5 3 讨论6 6 3 11 8 Sr R N A 比E F - l a 更适宜作为春石斛试管成花各个阶段L R R - R L K 基因表达的内参基因 6 6 3 2L R R - R L K 基因在春石斛试管成花各个阶段表达规律一6 7 第六章小结一6 9 1 石斛兰离体再生体系的优化6 9 2 石斛兰的试管开花6 9 3 春石斛L R R - R L K 基因的克隆7 0 4 己艘魁K 基因在春石斛花芽形成过程中的荧光定量表达7 l 参考文献7 2 附录l 春石斛P L B s 增殖体系优化评分说明7 9 附录2 石斛壮苗生根体系优化评分说明8 0 附录3 图版及图版说明8 1 A p p e n d i x1P l a t e s & E x p l a n a t i o n 8 3 附录4 春石斛L R R - R L K 基因序列登录G e n B a n k 信息9 4 附录5 春石斛E F - l a 基因序列登录G e n B a n k 信息一9 6 附录6 春石斛h y p o t h e t i c a lp r o t e i n 基因序列登录G e n B a n k 信息9 8 附录7 春石斛L R R - R L K 基冈拼序列B l a s t 部分结果1 0 0 附录8 春石斛E F - 1a 基因序列B l a s t 部分结果1 0 5 致谢110 福建农林大学硕士学位论文 缩写词 缩写词 缩写词英文全称中文名称 6 - B A 6 - B e n z y l a m i n o p u r i n e 6 苄基腺嘌呤- A P A d a p t e rp r i m e r 接头引物 b pB a s e p a i r 碱基对 c D N A C o m p l e m e n t a r yd e o x yr i b o n u c l e i ca c i d 互补D N A C WC o c o n u tw a t e r 椰汁 d D a y 天 D E P C D i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙脂 D N A D e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 h H o u r小时 k b K i l o b a s e千碱基 K C K n u d s o nC ( 1 9 4 6 )K C 培养基 l e u c i n e r i c hr e p e a tr e c e p t o r - l i k ep r o t e i n富含亮氨酸重复序列的类受体 L I * I 也K K i n a s e 蛋白激酶 腑 蛋口诹孵 m i nM i n u t e分钟 M S M u r a s h i g ea n dS k o o g M S 培养基 N A A a - N a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d a - 萘乙酸 N c m N a t i o 船l n 他f o r b i o e c h n o I o g Y 美国国家生物技术信息中心N C m芙国国冢生物玟木信恳甲心 l n f o r m a t i o n O D O p t i c a ld e l n s i t y 光密度 P C R P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n 聚合酶链式反应 P L B sP r o t o c o r m 1 i k eb o d i e s 原球茎 R N A R i b o n u c I e i cA c i d核糖核酸 r p m R o t a t i o np e rminute鞠吩 福建农林大学硕士学位论文摘要 摘要 石斛兰( D e n d r o b i u m ) 是一种具有较高观赏价值的热带兰花。本研究以春石斛和铁皮石 斛原球茎为材料，进行石斛兰离体再生体系优化、试管开花研究，花器官发育相关基因 L R R - R L K 基因克隆及其在试管开花过程中的定量表达研究。主要结果如下： 1 石斛兰离体再生体系的优化 以保存5 年的春石斛原球茎为材料，采用L 9 ( 3 4 ) 正交试验设计，比较不同N H 4 + - N ： N O a - N 比值、6 - B A 浓度以及香蕉匀浆物浓度对原球茎增殖的影响，结果表明：K C + 6 B A1 0 m g L + 香蕉匀浆物1 0g L 最适宜春石斛原球茎的增殖，其中香蕉匀浆物对其影响最大，最 适宜的浓度为1 0g L ：以保存5 年的春石斛和铁皮石斛原球茎为材料，采用L 9 ( 3 4 ) 正交 试验设计，比较不同浓度的6 B A 、白糖和香蕉( 或椰汁) 对其壮苗生根条件的优化，结果 表明：香蕉添加物比椰汁更能促进春石斛试管苗的壮苗生根，适宜春石斛壮苗生根的培养基 为1 2 M S + 6 一B A 0m e L + 糖2 0g L + 香蕉5 0g L ，而对于铁皮石斛，椰汁更有利于其壮苗生 根，最佳培养基为1 2 M S + 6 - B A 0m g L + 白糖3 0g 几十椰汁1 0 0m l ，I ，更适宜铁皮石斛试管苗 的壮苗生根。 2 石斛兰试管开花研究 从不同培养基、不同浓度6 - B A 、改良培养基、不同浓度Z T 、T D Z 、不同浓度马铃薯添 加物等单因子以及这些因子结合使用对春石斛试管苗开花的条件进行了研究。结果表明：多 因子比单因子更容易促进春石斛试管苗的开花，而且多因子结合使用更容易获得正常的试管 花，改M S ( 1 1 0N ，N H 4 + - N ：N O a - N 为4 ：1 ) + T D Z 0 1m g L + 白糖2 0g L + C W l 0 0m L L + P P 3 3 3 1 0 m g L ，1 4 低温处理2 0d 为春石斛试管苗花芽诱导率最高的处理，诱导率达到31 9 1 ， N H 4 + - N ：N 0 3 - N 、N 、T D Z 、P P 3 3 3 、糖、椰汁、低温和P P 3 3 3 对花芽诱导率的影响均达到显著 水平，而改M S ( 1 1 0N ，N I - h + - N ：N 0 3 - h i 为2 ：1 ，5P ) + T D Z 0 2m g L + 糖4 0g L + C W l 0 0 m L L + P P 3 3 3 1 0m g L ，1 4 低温处理3 0d 为春石斛正常试管花的诱导培养基，各因素对其 影响程度依次为：糖 P P 3 3 3 低温 P ) z = 椰汁 N I - h + N ：N 0 3 - N N 。 从不同浓度的6 - B A 和T D Z 对铁皮石斛试管苗花芽诱导的影响进行了研究。结果表明： T D Z 比6 - B A 更适宜铁皮石斛试管苗花芽的诱导，最适培养基为1 2 M S + T D Z 0 2 m g L + C W l 0 0 札几+ 白糖2 0m g L ，花芽诱导率最高达到9 4 7 9 ( 以花芽统计) 和6 2 5 0 ( 以开花的试管苗统计) 。 3 春石斛原球茎L R R - R L K 基因的克隆 以春石斛原球茎为材料，提取总R N A ，进行春石斛L R R - R L K 基因克隆研究。试验结果 表明：使用通用植物总R N A 提取试剂盒提取的R N A 条带清晰、明亮，但有D N A 污染；改 进的T r i z o l 试剂法提取的结果虽不稳定，易降解，但无D N A 污染，纯度较高，在不同的试 验阶段应根据试验要求选择不同的方法提取石斛兰总R N A 。根据已有其它植物L R R - R L K 基 n 福建农林大学硕士学位论文 摘要 因保守区序列设计一对引物，用R T - P C R 扩增出特异片段，得到了春石斛保守区和3 端序列， 整个片段长1 0 3 4b p ，并得到一个由5 3 1 个碱基组成的开放阅读框，编码1 7 6 个氨基酸，通 过核苷酸序列和氨基酸序列的B l a s t 比对发现：春石斛L R R - R L K 基因的核苷酸序列与已登录 的其它植物L R R - R L K 基因同源性较高，最高达到7 4 ；而其编码的氨基酸序列与多种物种 均达到9 0 以上。已经在G e n B a n k 上登录，登录号为G U 3 5 7 4 9 8 1 。 4 春石斛试管苗开花过程中L R R - R L K 基因表达的荧光定量P C R 分析 采用荧光定量P C R 技术，对春石斛试管苗开花过程中L R R - R L K 基因在m R N A 水平上 的表达进行了定量研究。试验首先克隆了内参基因E F - l a ，得到了长7 1 6b p 的片段，编码 2 3 7 个氨基酸序列，通过核苷酸序列和氨基酸序列的B l a s t 比对发现春石斛E F - l a 基因的核 苷酸序列与已登录的其它植物E F - l a 基因同源性非常高，适宜作为荧光定量表达过程中的 内参基因的待选基因。已经在G e n B a n k 上登录，登录号为G U 3 8 2 6 7 4 1 。对2 个待选内参基 因E F - l a 基因和1 8 Sr R N A 基因进行了筛选比较，结果表明：1 8 Sr R N A 更适宜作为春石斛 L R R - R L K 基因定量表达分析的内参基因。对春石斛离体开花过程中L R R - R L K 基因的定量表 达分析表明：在原球茎阶段，L R R - R L K 基因表达量较高，在普通培养基中培养分化成幼 苗后逐渐升高，当把幼苗转入花芽诱导培养基中之后，表达量逐渐降低，直到形成花芽 时降到最低，当花芽转变到成花时，L R R - R L K 基因表达量又上升，说明L R R - R L K 基因 可能在芽的分化以及春石斛花芽成熟过程中发挥重要的作用。 关键词：石斛兰；试管开花；L R R R L K ；基因克隆；荧光定量P C R I I I 福建农林大学硕士学位论文A b s t r a c t S t u d i e so n 扬v i t r of l o w e r i n ga n dr e l a t e d m o l e c u l a rm e C n a n l S ml n P 刀口加D 1 1 1 聊 ll1h- A b s t r a c t D e n d r o b i u mi sak i n do f p o p u l a rt r o p i c a lo r c h i d I nt h i se x p e r i m e n t , t h eP L B so f D e n d r o b i u m n o b i l ea n dD e n d r o b i u mc a n d i d u mw e r eu s e da st h em a t e r i a l sf o rt h er e s e a r c ho fo p t i m i z a t i o no f t h ec o n d i t i o n so f r o o t i n ga n ds h o o tg r o w t hi nt h et i s s u ec u l t u r ei nD e n d r o b i u m ，i nv i t r of l o w e r i n g ， g e n ec l o n i n go fL R R - R L Kr e l a t e dt of l o w e rd e v e l o p m e n t , a n dg e n ee x p r e s s i o no fL R R - R L Ka t d i f f e r e n ts t a g e so fi nv i t r of l o w e r i n gi nD e n d r o b i u mn o b g e n em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 T h er e g e n e r a t i o ns y s t e mw a so p t i m i z e di nD e n d r o b i u m T h eP L B so f D e n d r o b i u mn o b i l ew e r eu s e da st h em a t e r i a l sf o rt h es t u d i e so np r o l i f e r a t i o no f p r o t o c o r m s ，a n dt h ee f f e c t so fm e d i u m , 6 - B Aa n db a n a n aj u i c ew e r es t u d i e d T h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h em e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hb a n a n aj u i c ec o u l di m p r o v et h ep r o l i f e r a t i o nc o e f f i c i e n c y s i g n i f i c a n t l y n eb e s tp r o l i f e r a t i o nm e d i u mf o rp r o t o c o r m sW a st h eK Cm e d i u ms u p p l e m e n t e d w i t h1 0m 班6 - B Aa n d10 9 Lb a n a n a T h eP L B so fD e n d r o b i u mn o b i l ea n dD e n d r o b i u m c a n d i d u mc o n s e r v e df o r5y e a r sw e r eu s e da st h em a t e r i a l sf o rt h e t h eo r t h o g o n a lt e s t so f o p t i m i z a t i o no ft h ec o n d i t i o n so fr o o t i n ga n ds h o o tg r o w t hi nt h et i s s u ec u l t u r eo fD e n d r o b i u m n o b i l ea n dD e n d r o b i u mc a n d i d u m n l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s tm e d i u mf o rr o o t i n ga n ds h o o t g r o w t ho f D e n d r o b i u mn o b i l ew a sI 2 M Sm e d i u mw i t h6 - B A 0m g L ，s u g a r2 0g L ，a n db a n a n a5 0 g L ，a n dt h eb e s tm e d i u mf o rr o o t i n ga n ds h o o tg r o w t ho fD e n d r o b i u mc a n d i d u mt i s s u ec u l t u r e s e e d l i n gW a s1 2 M Sw i t h6 - B A 0m g La n ds u g a r10g L 2 R e s e a r c ho fi nv i t r of l o w e r i n go f p l a n t l e t si nD e n d r o b i u m T h ee f f e c t so fb a s a lm e d i u m ，6 - B A ，m o d i f i e dM Sm e d i u m , Z T ，T D Z ，p o t a t oj u i c eo ni nv i t r o f l o w e r i n gw e r ec o m p a r e di nD e n d r o b i u mn o b i l e T h er e s u l t s s h o w e dt h a tm u l t i f 础o r s c o m b i n a t i o nW a se a s i e rt oi n d u c ef l o w e r i n ga n do b t a i nn o r m a li nv i t r of l o w e r st h a ns i n g l ef a c t o r i nD e n d r o b i u mn o b i l e n em o d i f i e dM S ( 1 1 0N ，N H 4 + - N N 0 3 - N4 ：1 ) s u p p l e m e n t e dw i t h T D Z 0 1m g L ，s u g a r2 0g L ，C W l 0 0m L 几，P P 3 3 3 1 0m g La n d1 4 t r e a t e df o r2 0d a y sw a st h e b e s tf o ri nv i t r o f l o w e r i n g a n dt h ei n d u c i n gr a t ew a s31 91 1 1 1 ef r e q u e n c yo ff l o r a lb u d i n d u c t i o nW a Ss i g n i f i c a n t l ya f f e c t e d b yN H 4 + - N ：N 0 3 。- N ，N ，T D Z ，P P 3 3 3 ，s u g a r , C W ，l o w t e m p e r a t u r et r e a t m e n ta n dP P 3 3 3 ；a n dt h em o d i f i e dM S ( 1 1 0N ，N I - 1 4 + N ：N 0 3 - N2 - l ，5P ) s u p p l e m e n t e dw i t hT D Z 0 2m g L ，s u g a r4 0g t , ，C W10 0m L L ，P P 3 3 3 1 0m g La n d14 t r e a t e d f o r3 0d a y sW a st h eb e s tf o ri n d u c i n gn o r m a lf l o w e rb u d s ，a n dt h ei n f l u e n c ed e g r e eo ft h ea b o v e f a c t o r sW a ss u g a r P P 3 3 3 l o wt e m p e r a t u r et r e a t m e n t P T D Z = C W N H 4 + - N ：N 0 3 。- N N I V 福建农林人学硕士学位论文 A b s t t a c t T h ee f f e c t so f6 - B Aa n dT D Zo n nv i t r of l o w e r i n gw e r ea l s oc o m p a r e di nD e n d r o b i u m c a n d i d u m T h er e s u l t ss h o w e dt h a tT D Zw a se a s i e rt oi n d u c ef l o w e r i n gt h a n6 - B A ，a n dt h eb e s t m e d i u mW a SI 2 M Ss u p p l e m e n t e dw i t hT D Z 0 2m g L ，C WI0 0m L La n ds u g a r 2 0m g L ，a n dt h e f l o w e r i n gr a t ew a s9 4 7 9 ( c o u n t e db yt h en u m b e ro ff l o w e rb u d s ) o r6 2 5 0 ( c o u n t e db yt h e n u m b e ro ff l o w e r i n gp l a n t l e t s ) i nD e n d r o b i u mc a n d i d u m 3 G e n ec l o n i n go fL R R - R L Ki nD e n d r o b i u mn o b i l eP L B s T h eP L B so fD e n d r o b i u mn o b g ew e r eu s e d 越t h em a t e r i a l sf o rR N Ae x t r a c t i o na n df u r t h e r g e n ec l o n i n go fL R R - R L Ki nD e n d r o b i u mn o b g e T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eR N As t r i p s e x t r a c t e db yg e n e r a lt o t a lR N Ak i tw e r eb r i g h ta n dc l e a r , b u tw i t hD N Ac o n t a m i n a t i o n ；t h es t r i p s e x t r a c t e db ym o d i f i e dT r i z o lw e r ew i t h o u tD N Ac o n t a m i n a t i o n ，b u tu n s t a b l e T h es u i t a b l em e t h o d f o rR N Ae x t r a c t i o ns h o u l db es e l e c t e db a s e do nt h er e q u i r e m e n to fd i f f e r e n te x p e r i m e n t s Ap a i ro f s p e c i f i cp r i m e r so fw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt oL R R - R L Ki no t h e rp l a n t st oa m p l i f yf r a g m e n t s ， c o n s e r v e ds e q u e n c ea n d3 s e q u e n c ew e r eo b t a i n e d , a n dt h et o t a ls e q u e n c eW a s10 3 4b p S e q u e n c e a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ef u l ll e n g t he D N Ac o n t a i n e da5 31b po p e nr e a d i n gf r a m ea n de n c o d e d 17 6a m i n oa c i d s T h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eW a sh i g h l yh o m o l o g o u sw i t hL R R - R L Ki n o t h e rp l a n t s T h er e g i s t e r e dN o o f t h eg e n eW a sG U 3 5 7 4 9 8 1i nG e n B a n k 4 E x p r e s s i o na n a l y s i so f 工R 尼J 配置g e n eb yr e a lt i m eR T - P C Rd u r i n g nv i t r of l o w e r i n gi n D e n d r o b i u mn o b i l e T h ee x p r e s s i o na n a l y s i so fL R R - R L Kg e n eb yr e a lt i m eR T - P C Rd u r i n g nv i t r of l o w e r i n g W a sc a r d e do u ti nD e n d r o b i u mn o b i 跆E F - l af r a g m e n tW a Sf w s tc l o n e d 嬲ac a n d i d a t er e f e r e n c e g e n e ，a n di tW a S7 1 6b p ，e n c o d e d2 3 7a m i n oa c i d s S e q u e n c ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a ta m i n oa c i d s e q u e n c ew a sh i g h l yh o m o l o g o u sw i t hE F - l ai no t h e rp l a n t s ，w h i c hW a ss u i t a b l et ob et e s t e da sa c a n d i d a t er e f e r e n c eg e n e T h er e g i s t e r e dN o W a sG U 3 5 7 4 9 8 1i nG e n B a n k T os e l e c tam o r e s t a b l er e f e r e n c eg e n ef o re x p r e s s i o na n a l y s i so nL R R - R L Kg e n e 1 8 Sr R N Aa n dE F - l aw e r eb o t h c o m p a r e d ，a n dt h er e s u l ts h o w e dt h a t1 8 Sr R N AW a sm o r es u i t a b l e T h ea n a l y s i so nL R R - R L K g e n ed u r i n g nv i t r of l o w e r i n gb yr e a lt i m eR T - P C Ri nD e n d r o b i u mn o b i l es h o w e dt h a tt h e e x p r e s s i o no fL R R - R L Kw a sa t ar e l a t i v e l y h i g hl e v e li nP L B s ，a n da t ah i g h e rl e v e li n g e n e r a lt e s t - t u b ep l a n t l e t s ，b u tw h e nt h ep l a n t l e t sw e r et r a n s f e r r e do n t of l o r a li n d u c t i o n m e d i u m ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l sd e c r e a s e d , a