研究生讲课肿瘤干细胞.ppt

肿瘤干细胞,高全立河南省肿瘤医院生物治疗科,干细胞生物学特性,干细胞有自我复制更新能力：通常情况下只有干细胞具有分裂产生子代干细胞的能力干细胞有定向分化为功能细胞能力已经定向分化的细胞一般情况下不能逆转化为干细胞,干细胞分类,根据来源分类胚胎干细胞成体干细胞根据分化潜能分类：全能干细胞多能干细胞单能干细胞,胚胎干细胞培育过程,干细胞的再编程,核移植如克隆羊多莉细胞融合基因转染：iPSOCT4,SOX2,KLF4,c-MYC小分子化合物诱导：,多能干细胞多向分化图,横向分化亚全能干细胞？,肿瘤的异质性肿瘤干细胞,Reya,T.,etal.Nature.2001.414.105-111,肿瘤干细胞的起源,由正常干细胞经多基因多步骤突变累积而来由骨髓来源的干细胞与基因发生改变的组织细胞融合而来由基因发生改变已分化的细胞逆转化而来,Cancerstemcellsshouldbethetherapytarget,Reya,T.,etal.Nature.2001.414.105-111,肿瘤干细胞的特性,维持肿瘤生长的基础具有自我更新和多向分化的能力肿瘤组织中含量极低对常用的治疗方法耐药：如化疗、放疗、分子靶向治疗。免疫治疗如何？,ABC转运蛋白在肿瘤干细胞多药耐药中的作用,ABC转运子示意图(通过水解ATP将多种化疗药物泵出细胞外）,肿瘤干细胞的可变性,易于转化为间质样细胞，表达许多成纤维细胞的特性非肿瘤干细胞可通过EMT转变为肿瘤干细胞,EMT-表皮细胞向间质细胞转化MET-间质细胞向表皮细胞转化,肿瘤干细胞的间质细胞学特性,EMT（表皮细胞向间质细胞转化）是肿瘤侵袭和转移的主要机制之一，肿瘤干细胞易于侵袭和转移。多个实验证实肿瘤干细胞具有间质细胞的生物学特性。乳腺上皮细胞系通过EMT可产生乳腺癌干细胞。,肿瘤干细胞的表面分子标记,CD44：乳腺癌，头颈部鳞癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，大肠癌CD133：脑胶质瘤，大肠癌，胰腺癌，肺癌，肝癌，恶性黑色素瘤，卵巢癌CD90：肝癌，肺癌CD24：胰腺癌阳性，乳腺癌阴性CD117：卵巢癌CD278：恶性黑色素瘤,肿瘤干细胞表面标记与预后,CD44：头颈部鳞癌的预后不良标记。乳腺癌中12个研究中的898例meta分析，CD44为预后不良的标记。大肠癌中存在争议。CD133：脑胶质瘤高表达预后差。大肠癌高表达预后差，肺癌有争议。外周血CD133mRNA的表达水平与预后相关（JClinOncol,201129(12):1547-55).,肿瘤干细胞高表达胚胎干细胞相关基因,Oct4Sox2NANOGKlfBmi1C-Myc,胚胎干细胞基因与肿瘤预后的关系,Oct4：肺癌及乳腺癌中高表达分化差，预后差Sox2：口腔鳞癌、食管癌高表达预后差，而肺鳞癌中高表达预后良好的指标。NANOG：口腔鳞癌中高表达预后差，大肠癌中的表达与预后无关。c-Myc：与多种肿瘤的预后不良相关。,EMT相关基因与肿瘤的预后的关系,E-cadherinN-cadherinVimentin尽管存在争议，一些文章支持与肿瘤的预后相关,肿瘤干细胞其它功能基因与预后,ALDH1（乙醛脱氢酶1）：ALDEFLUOR的试剂来分选ALDH-1阳性细胞。其表达与多种肿瘤的预后明显相关。ABC转运子家族蛋白：MDR1，ABCG2，ABCB5等，其功能与SP细胞相关。其表达于预后的关系不明确。,肿瘤干细胞是否存在的争议,正常组织的干细胞所占比例很低，而某些肿瘤含有很高比例的肿瘤干细胞。非肿瘤干细胞很容易通过EMT转变为肿瘤干细胞。,免疫标记技术,抗原抗体反应,免疫组化技术,基本原理常用酶标抗体间接法,免疫组化的优缺点,优点：特异性敏感性定位性缺点：假阳性率高设计好对照是关键：阴性对照、阳性对照、自身对照,免疫荧光基本原理,流式细胞仪的工作原理,流式细胞仪,流式细胞仪的应用,细胞生物学肿瘤些免疫学血液学药物学,流式细胞结果分析（散点图）,流式细胞分析,肺癌干细胞的分离鉴定,DIGESTION:-CollagenaseI37C-2hours-Washing,SINGLECELLSUSPENSION,CULTURING:Serumfreemedium,原代肺癌细胞培养,原代培养建立的肺癌细胞系,Wehaveestablished5squamouscarcinoma(B),4adenocarcinoma(D),1largecelllungcancer(C),1smallcelllungcancer(A),and1lungcarcinoidcelllines.,原代培养的肺癌细胞在NOD/SCID小鼠能形成肿瘤,原代培养的肺癌细胞中含有一小群CD44强阳性的细胞,Smallcelllungcancer(LC004),largecelllungcancer(LC006)havecd44strongpositivepopulationcells.,CD44强阳性细胞具有较强的增值能力,Whenseeded500cells/well,therewasnoobviousdifferencebetweentheCD44+andCD44+/-cells(figureA),butwhenseeded150cells/well,CD44+cellsmuchstrongerproliferativeability(figureB).,CD44+细胞具有较强的克隆形成能力,A:largecelllungcancercellline(LC006)B:smallcelllinecellline(LC004),只有CD44+的细胞可以形成holoclone,Whensinglecellseededinto96wellplate,onlyCD44+CD+cellscouldformholoclone,100CD44+CD90+cellscouldformabout1-3holoclones.,只有CD44+的细胞在超低粘附的培养板中形成细胞球,A&C:cellspheresformedbyCD44+cellsofLC-006andLC021.B&D:nocellsphereformedbyCD44+cellsofLC-006andLC021.,部分原代培养的肺癌细胞表达CD90,A:watchedbybluefluorescentlight,B:watchedbyredfluorescentlight,C:watchedbywhitelight,D:overlapofAandB,肺癌细胞表达CD44+CD90+,4maintypesoflungcancer,adenocarcinoma(LC007),squamouscarcinoma(LC021),smallcelllungcancer(LC004)andlargecelllungcancer(LC006)allhadtheCD44+CD90+smallpopulationcells.,大细胞肺癌中的CD44+CD90+和CD44+CD90-细胞具有间质细胞的形态,A:CD44+CD90+.B:CD44+CD90-C:CD44+CD90+D:CD44+CD90-,大细胞肺癌中的CD44+CD90+细胞高表达胚胎干细胞和间质细胞相关的基因,鳞癌细胞CD44+CD90+和CD44+CD90-具有间质细胞的形态,A:LC021-P3beforesorting.B:CD44+CD90+.C:CD44+CD90-.D:CD44+CD90+.E:CD44+CD90-.,CD44+CD90+的鳞癌细胞具有最强的细胞球形成能力和X线抵抗能力,CD44+CD90+的大细胞肺癌具有最强的细胞球形成能力和X线抵抗能力,TGF-1对肿瘤细胞的作用,抑制肿瘤细胞的生长。使肿瘤细胞恶性程度增强。诱导肿瘤细胞产生EMT。,TGF-1对CD44+CD90+大细胞肺癌抑制能力最弱,TGF-1诱导肺癌细胞产生EMT,TGF-1增加CD44+CD90+大细胞肺癌细胞的比例,TGF-1处理过的CD44+CD90+同样具有最强的X线照射抵抗能力,lungcancercellsco