转玉米C,4型pepc基因小麦光合生理特性的研究-硕士论文

分类号 河南农业大学硕士学位论文 密级 英文题昏一S t u d y o nP h o t o s y n t h e t i cC h a r a c t e r i s t i co fM a i z eC 4 t y p ep e p cG e n ei nT r a n s g e n i c 里缝煎o P。一 导 专 论文提交 日期： 学位授予 日期： IIIIIJII I l l lI llIJI I J l l1J IIIJII I I IF I I J Y 17 2 8 7 9 5 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论转玉米C 4 型p e p c 基因小麦光合生理特性 学位 文题目的研究级别 硕士 学生 张庆琛 学科导师 姓名专业 作物遗传育种许为钢 姓名 学位论文 不 是否保密 | 2 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：j 长仄i 孚，矽钢导师签名：甲。吖 日期：加，o 年f 月，口日日期：M 哗占月协日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本 和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开 河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为 河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学 所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。i ：_ ；_ 1 研究水蠢谮瑚躲和构学院领导签楼到 日期：劫I o 年l ，月I O 日日期：弘I ) 年6 月I 蝈 日期：如I 拜6 月咱 致谢 本文是在导师许为钢研究员和师母胡琳研究员悉心指导下完成的，恩师严谨 求实的治学态度、渊博的知识、敏锐的洞察力和执着忘我的敬业精神，深深地激 励着我在今后的科学道路上勇于攀登。在三年的学习生涯中，两位老师在我的学 位课程拟定，试验设计与落实，论文发表撰写等方面给予了精心指导，为我创造 了一个良好的学习环境，顺利完成了学业，生活中、工作上给予了无微不至的关 心和帮助，在此向我的恩师许为钢研究员和师母胡琳研究员致以我深深的敬意和 衷心的感谢! 感谢河南农业大学崔党群、朱伟等老师给予我学习、生活中的关心与支持。 感谢张磊博士、李艳师姐、齐学礼师兄从试验设计、试验方法学习以及论文 发表撰写给予的无私指导与帮助；董海滨、王根松、张建周、暂香存、王会伟、 赵明忠等老师在试验完成中提供的帮助；王玉民、李正玲、董淑静、李春鑫、韩 凤龙、王永霞、吴琼、韩琳琳、华夏、张建红等师兄弟和张姗姗、崔迎雪等实习 生在试验中给予的热情帮助；胡中、高崇、游淑兰、张清珍等在整个试验过程中 给予的帮助。 衷心感谢袁丁、胡孔峰老师在学习、生活中给予的关心与帮助；衷心感谢信 阳市农科所王青林、魏迁迁老师给予我生活、工作中的关心与帮助。 特别感谢我的家人，感谢父母对我多年的教育和培养，在我的求学路上给予 了我所能给予的一切，愿永远身体健康。 感谢我的女友刘敏对我一直以来默默地鼓励和支持。 感谢所有在学习、生活、工作中帮助过我的亲朋、老师和同学，祝愿工作顺 利、幸福快乐! 张庆琛 2 0 1 0 年6 月于郑州 目录 摘要I 第一章文献综述1 1 1 C 3 和C 4 光合途径的比较及小麦光合速率与光合酶、产量的关系1 1 2 c 4 光合途径关键酶基因p e p c 分子生物学的研究进展2 1 3 利用c 4 途径关键酶基 p e p c 改善c 3 植物光合特性的可行性4 1 4 C 4 途径p e p c 基因转C 3 植物的光合生理研究进展4 1 5 叶绿素荧光动力学参数的研究与应用进展7 1 6 研究意义目的及创新点9 1 6 1 研究的意义9 1 6 2 研究的目的9 1 6 3 研究的创新点1 0 1 7 技术路线10 第二章转玉米c 4 型p e p c 基因小麦的检测和筛选1 l 2 0 引言1 1 2 1 材料与方法1 l 2 1 1 供试材料与试剂l l 2 1 2 转基因小麦株( 系) P C R 检测1 2 2 1 2 1 小麦基因组总D N A 的提取1 2 2 】2 2P C R 反应体系12 2 1 2 3 目的基因p e p c 的P C R 检测一13 2 1 3 转基因小麦株( 系) S o u t h e r nb l o t 验证一13 2 1 3 1 C T A B 法提取小麦基因组总D N A _ 1 3 2 1 3 2 酶切13 2 1 3 3 电泳1 4 2 1 3 4 转膜14 2 1 3 5 杂交及放射自显影1 4 2 1 4 转基因小麦株( 系) 半定量R T - P C R 验证1 5 2 1 4 1 小麦总R N A 的提取15 2 1 4 2 琼脂糖凝胶电泳检测R N A 15 2 1 4 3 反转录成c D N A 1 6 2 1 4 4 R T - P C R 检测1 6 2 1 5 转基因小麦株( 系) P E P C a s e 活性检测和叶片S D S P A G E 分析1 6 2 1 5 1 P E P C a s e 活性测定1 6 + h 2 1 5 2 叶片S D S P A G E 分析1 6 2 1 6 转基因小麦株( 系) 旗叶净光合速率的测定1 7 2 1 7 转基因T l 代小麦植株千粒重、单穗重测定1 7 2 2 结果与分析l8 2 2 1 转基因小麦株( 系) P C R 检测1 8 2 2 2 转基因小麦株( 系) S o u t h e mb l o t 验证一1 8 2 2 3 转基因小麦株( 系) 半定量R T - P C R 检测结果18 2 2 4 转基因小麦株( 系) 叶片S D S P A G E 分析2 0 2 2 5 转基因小麦株( 系) 旗叶净光合速率和P E P C a s e 活性测定结果2 0 2 2 6 转基因T l 代小麦株( 系) 千粒重、单穗重测定结果2 2 2 2 7 筛选结果2 3 2 3 结论与讨论2 4 第三章转玉米c 4 型p e p c 基因小麦净光合速率对光强、温度和C 0 2 浓度响应的研究2 6 3 0 引言2 6 3 1 材料与方法2 6 3 1 1 供试材料与种植方式2 1 6 3 1 2 转基因小麦旗叶净光合速率对光强的响应2 7 3 1 3 转基因小麦旗叶净光合速率对温度的响应2 7 3 1 4 转基因小麦旗叶净光合速率对C 0 2 浓度的响应2 7 3 2 结果与分析2 7 3 2 1 转基因小麦旗叶净光合速率对光强的响应2 7 3 2 2 转基因小麦旗叶净光合速率对温度的响应2 9 3 2 3 转基因小麦旗叶净光合速率对C 0 2 浓度的响应3 l 3 3 结论与讨论3l 第四章转玉米C 4 型p e p c 基因小麦光合速率日变化及对高温强光胁迫反应的研究3 3 4 0 引言3 3 4 1 材料与方法3 3 4 1 1 供试材料与种植方式3 3 4 1 2 大田条件小麦旗叶光合速率日变化的测定3 3 4 1 3 高温强光胁迫处理及小麦旗叶指标测定3 4 4 2 结果与分析3 4 4 2 1田间小麦旗叶光强、温度和净光合速率的日变化3 4 4 2 2 开花后7 天转基因小麦对高温强光的响应3 5 4 2 2 1 转基因小麦旗叶光合速率的表现。3 5 4 2 2 2 转基因小麦旗叶荧光参数的表现一3 5 4 2 3 开花后1 4 天转基因小麦对高温强光的响应3 7 4 2 3 1 转基因小麦旗叶光合速率的表现3 7 4 2 3 2 转基因小麦旗叶荧光参数的表现。3 8 4 3 结论与讨论4 0 参考文献4 1 A 1 3 S T R A C T 5 0 攻读学位期间发表论文5 0 摘要 本研究以转玉米c 4 型p e p c 基因T l 、T 2 代小麦植株和受体对照周麦1 9 为试验材料，测 定了转基因小麦功能旗叶的P E P C a s e ( 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶) 活性，研究并建立了转基 因高光效小麦光合速率对光强、温度和C 0 2 浓度的响应曲线，分析了大田条件下转基因小 麦的光合速率日变化以及对高温强光胁迫反应特性，并对部分转基因T 。代小麦和对照的单 穗重、千粒重做了比较，获得以下研究结果： 1 测定了转基因T l 代小麦单株1 0 株的P E P C a L s e 相对活性、5 8 株的光合速率，分别比 对照提高了1 2 0 、2 6 ，达到0 0 4 8 、3 1 2 I t m o l C 0 2 m - 2 $ ；转基因T 2 代单株3 0 株的P E P C a s e 相对活性、6 5 株的光合速率，分别比对照提高1 6 3 、2 4 ，达到0 1 5 8 、3 0 1 t a m o l C 0 2m 五s 一， 并且P E P C a s e 活性和净光合速率达极显著正相关( 严0 6 9 4 4 奉+ ) ； 2 低光强下，转基因植株与对照光合速率和表观量子效率差异不明显，表明转基因小 麦和对照利用弱光的能力相当；随着光强升高，转基因小麦表现出较强利用强光的能力，其 光饱和点达到约1 6 8 0 1 t m o l m s ，比对照提高2 0 ，光饱和光合速率提高2 9 ； 3 在温度1 5 4 0 C 间，转基因小麦的光合速率大致均高于对照，尤其在3 0 4 0 C 范围内 转基因植株表现出对高温具有较强的适应能力，转基因植株光合作用的最适温度为3 0 左 右，对照为2 5 左右； 4 。转基因小麦羧化效率比对照提高2 3 ，C 0 2 补偿点下降至7 5 4 p m o l m o l 一，较对照下 降2 ，表明转基因小麦利用C 0 2 的能力增强； 5 抽穗期光合速率日变化发现，对照呈现双峰曲线，出现了“午休”现象，而转基因小 麦趋于单峰曲线；多数时刻转基因小麦光合速率比对照高，尤其在9 ：0 0 1 4 ：0 0 强光时段内差 异更大； 6 花后7 天高温( 约3 4 8 1 2 ) 强光( 约1 9 0 0 1 a m o l m 一s 4 ) 3 h 处理后，转基因小麦和 对照较适宜环境( C o n t r 0 1 ) 光合速率分别下降1 1 、3 2 ，下降至2 5 I _ t m 0 1 C 0 2 - m - 2 s 、 1 5 9 1 t m o l C 0 2 - m - 2 S 一，叶绿素荧光参数F v 佰m 分别下降9 、1 9 ，F v 作m 、O P S I I 、q P 有不 同程度的下降，但转基因小麦比对照下降幅度小；而N P Q 明显上升，但转基因小麦比对照 上升幅度大。花后1 4 天处理后，光合速率、F v F m 、F v F m 、P S I I 、q P 、N P Q 参数变化趋 势与花后7 天的相似。表明转基因小麦具有较好的热耗散能力和耐光抑制的特性； 7 测定的转基因T l 代小麦的单穗重均高于对照( 1 5 9 ) ，分别为1 7 2 9 、2 1 2 9 、1 6 9 9 、 2 2 7 9 、2 1 5 9 、1 7 3 9 ，最大提高5 1 ；千粒重多数高于对照( 4 3 3 9 ) ，分别为4 5 1 9 、4 6 7 9 、 4 3 6 9 、4 8 5 9 、4 6 7 9 、4 0 6 9 ，最大提高1 2 。表明转基因小麦有增加籽粒产量的潜力。 关键词：转基因小麦；玉米；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( P E P C a S e ) ；光合速率；光抑制； 叶绿素荧光 硕士学位论文：转玉米C 。型p e p c 基因小麦光合生理特性的研究 第一章文献综述 1 1C 3 和C 4 光合途径的比较及小麦光合速率与光合酶、产量的关系 高等植物在光合类型上可分为C 3 、C 4 、C A M 三大类。C a l v i n 及其同事( 1 9 4 8 ) 基于1 4 C 0 2 饲喂试验及纸层析的结果，提出了光合作用的碳同化途径( C a l v i n 循环) ，该途径也称C 3 途径。C ，途径最初固定C 0 2 的酶是l ，5 二磷酸核酮糖羧化酶a n 氧酶( R u b i s c o ) ( 该酶不仅 可与C 0 2 反应，也可与0 2 反应，发生光呼吸作用，从而消耗被同化的碳) ，将大气中的C 0 2 同化，产生两分子三碳的磷酸甘油酸( 3 P G A ) 。C 4 途径的首次发现，K a r p i l o v ( 1 9 6 0 ) 在 研究玉米叶片光合作用时，发现C 0 2 同化产物不是3 - P G A ，而是四碳的二羧酸，即苹果酸 ( M A ) 和天冬氨酸( A s p ) 。此后，K o r t s c h a c k 等( 1 9 6 5 ) 报导甘蔗叶片的C 0 2 同化最初产 物也是M A 和A s p 。随之，澳大利亚的H a t c h 和S l a c k ( 1 9 6 6 ) 重复K o r t s c h a c k 等( 1 9 6 5 ) 的试验，证明C 0 2 同化的最初产物是四碳的草酰乙酸( O A A ) ，而O A A 很快转化成M A 和 A s p ，从而确定这类植物光合碳同化的最初产物是四碳的二羧酸。1 9 7 6 年H a t c h 等进一步研 究发现，C 最先标记在羧酸的C 4 羧基上，尔后出现在3 - P A G 的羧基上，再经过C a l v i n 循环 出现在磷酸己糖中，由此提出了C 。途径。 与C 3 途径相比( 图1 1 ) ，C 4 途径固定C 0 2 的酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( P E P C a s e ) 比R u B P C a s e 对C 0 2 有更高亲和力。光合作用中的碳还原和光合磷酸化作用分别在叶肉细胞 ( M C ) 和维管束细胞( B S C ) 两种细胞中进行( H a t c h ，1 9 8 7 ) ，不同于C 3 植物在M C 中进行。 空气中的C 0 2 进入M C 的细胞质中，经P E P C 的催化与受体磷酸烯醇式丙酮酸( P E P ) 形成 草酰乙酸( O A A ) ，经叶绿体中的N A D P 苹果酸脱氢酶( N A D P M E ) 还原为苹果酸( M A ) ， 再转运至B S C 中脱羧，释放出C 0 2 经C a l v i n 循环再固定，而余下的3 c 产物( 丙酮酸) 运回 M C 的叶绿体内，经磷酸丙酮酸二激酶( P P D K ) 催化形成C 0 2 受体P E P ，完成C 4 途径的循 环。M A 和天冬氨酸( A s p ) 在B S C 中脱羧释放C 0 2 ，大大增加了其内的C 0 2 浓度，这种“C 0 2 泵”机制使得R u b i s c o 向羧化方向进行，同时大大抑制了加氧的活性，即提高了羧化能力的 同时降低了光呼吸，使C 4 植物的C 0 2 补偿点低，光呼吸很低，光补偿点高的特性( D a ie t a l ，1 9 9 3 ) ，尤其在高温、高光强及低C 0 2 浓度、干旱等轻度胁迫条件下有较高的光合效率和 水肥利用效率( B l a c k ，l9 7 3 ；K ue ta i ，19 9 6 ；R i c h a r de ta l ，2 0 0 0 ；F u r b a n ke ta l ，2 0 0 0 ) 。 小麦、水稻、大豆等重要农作物均是c ，植物，光合作用碳同化为C ，途径，由于光合作 用常伴随着较高光呼吸，使得光合效率较低。关于C 3 植物小麦光合速率与酶活性的相关研 究基本是一致的，即光合速率高低受N d , 麦自身酶活性高低的影响。李卫芳等( 2 0 0 6 ) 研究 表明小麦旗叶的光合速率高低主要取决于C 3 途径中R u b i s c o 的初始活力，即R u b i s c o 被 R u b i s c o 活化酶活化的程度。郭程瑾等( 2 0 0 2 ) 以不同生态型小麦品种为材料的光合特性研 究揭示出，在叶片功能旺盛时期，光合底物C 0 2 对光合速率的限制主要是非气孔限制，在 功能叶片老化后期，光合底物C 0 2 对光合作用的限制同时存在气孔和非气孔限制，即在小 麦整个生育期中，非气孔限制一直影响着光合速率。近些年来，普通小麦叶片光合特性的研 第一章文献综述 究表明在不同品种间存在差异( 李树华等，2 0 0 0 ；张其德等，2 0 0 1 ) 。随着小麦改良选育，小麦 的光合速率有上升趋势，许为钢等( 1 9 9 9 ) 研究关中地区小麦旗叶的光合速率由早期品种的 约2 1L a m o l C 0 2 m 一2 s - 1 提高到了约2 3 m o lC 0 2 1 1 1 - 2 s - 1 。 M c 唧畸HC d l S - l d k I i l l u m l hC , + l l M e l o p l y l lC 硪蓐d 矗i 口S h f 4 女C I 打 - c o ,P P D K 圆 I - 劬一C 3 - C 腑锐V 。9 1 厂 I A PA T P 罗黯e C 0 f O A # C v t e p l a I l C h 伸o l 躺 曩 o C h l o r o p l a s t C v l o p | l s ! l II 图1 1 C 3 和C 4 光合途径的简图( M i t s u e ，2 0 0 3 ) F i g 1 1S c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fC 3a n dC 4p h o t o s y n t h e s i sp a t h 关于小麦光合速率与产量的相关关系研究结论不尽相同。B r u n ( 1 9 6 7 ) 发现在抽穗期高 产品种的净同化率显著提高。董树亭( 1 9 9 1 ) 研究表明灌浆期的群体光合速率与籽粒产量、 千粒重呈正相关。任德昌等( 1 9 9 8 ) 报道不同成穗类型的小麦群体光合速率与地上干物质积 累和籽粒产量呈正相关。但也有报道表明两者不呈相关关系( T h o m ee ta l ，1 9 6 3 ) 或呈负相 关( E v a n se ta l ，19 7 0 ；S h a r k e ye ta l ，19 9 0 ；岳寿松等，19 8 9 ) 。近些年，对光合速率与小麦产量相 关关系的认识逐步统一。许大全等( 1 9 9 9 ) ，X u 等( 2 0 0 1 ) 先后提出叶片光合速率与作物产 量间不相关或表现负相关的研究是假象，正相关才是两者的真实关系。事实表明，可以通过 光合速率的提高进一步增加小麦产量。 1 2 C 4 光合途径关键酶基因p e p c 分子生物学的研究进展 P E P C ( 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶) 存在于所有能进行光合作用的有机体中，包括高等 植物、绿藻、光合细菌和蓝细菌等。P E P C 是c 4 植物光合作用固定C 0 2 的首要关键酶。目 前，已公布了6 0 多条植物和细菌的P E P C 全序列，包括同一有机体的不同单体，同时还有 5 0 0 多条不完全序列( 赵艳等，2 0 0 6 ) 。在许多物种诸如大肠杆菌( E c o l i ) ( H i s a t a k ee t a l ，1 9 8 4 ) 、 谷氨酸棒杆菌( C g l u t a n i c u m ) ( B e m h a r de ta l ，1 9 8 9 ) 、冰叶日中花( MC r y s t a l l i n u m ) ( R i c k e r s e ta l ，1 9 8 9 ) 、蓝藻( C y a n o b a c t e r i u m ) ( K a t a g i r ie ta l ，1 9 8 5 ；L u i n e n b u r ge ta l ，1 9 9 2 ) 、马铃薯 ( S o l a m u m m b e r o s u m ) ( M e r k e l b a c he t a l ，1 9 9 3 ) 、大豆( G m a x ) ( S u g i m o t oe t a l ，1 9 9 2 ) 、高粱 ( Sv u l g a r e ) ( L e p i n i e ce ta l ，1 9 9 3 ) 、黄花菊属( F l a v e r i a ) ( W e s t h o f f e ta l ，1 9 9 7 ) 、玉米( zm a y s ) ( M a t s u o k ae ta l ，1 9 8 9 ；R i c h a r de ta l ，1 9 8 9 ) 中相继被克隆出来。所有已知的P E P C 均为四聚体， 4 个相同亚基的分子量为9 5 11 0 k D a ，其单体存在2 种构象：R 构象和T 构象，大多数P E P C 都是变构酶，其交构规律是T 构象和R 构象上的一些结构的位移造成，从而影响着P E P C 催化反应的调控。在高等植物中，P E P C 主要以4 种同工酶形式存在，即C 4 光合型、C 3 光 2 硕士学位论文：转玉米C 。型p e p c 基因小麦光合生理特性的研究 合型、C A M 型及非绿色型( H u d s p e t ha n dG r u l a ，1 9 8 9 ；P o e t s c he ta l ，1 9 9 1 ；L e p i n i e ce ta l ，1 9 9 1 ) 。 其中C 。光合型P E P C 的表达在叶肉细胞中进行，并且基因的表达受光的调控，具有组织特 异性( W e s h o f f , 1 9 9 7 ) 。I z u i 等( 1 9 9 2 ) 研究表明，玉米p e p c 基因不同的类型分别位于不同 的染色体，c 4 型位于第九染色体，C 3 型位于第七染色体，C A M 型及非绿色型位于第四或第 五染色体。C 4 型p e p c 基因首先是从玉米和黄花菊属植物F l a v e r i at r i n e r v i a 中克隆出来的， 随之高粱、谷子、甘蔗等作物的C 4 型p e p c 基因相继被克隆。高粱C 4 型p e p c 基因编码区序 列与玉米C 4 型p e p c 序列相比有8 8 同源性( I s h i j i m ae ta l ，1 9 8 5 ；I z u ie ta l ，1 9 8 6 ；C r e t i ne ta l ， 1 9 9 0 ) 。其中玉米C 。型p e p c 基因备受生理学家和育种家的关注。 玉米C 4 型p e p cD N A 基因全长6 8 k b ，包含1O 个外显子，大小为8 5 b p - 9 9 9 b p ，9 个内含 子大小为9 2 8 9 7 b p ，其c D N A 全长2 9 1 k b ，转录起始位点有两个，分别位于上游8 4 处和- 8 1 处( 图1 2 ) ( M a s u o k a , 1 9 8 9 ) 。玉米C 4 型P E P C 是单基因编码( H u d s p e t h e ta l ，1 9 8 9 ) ，由9 7 0 M a i z eC I 一嬲唧e 广一 I U 丽磊了U 图1 2 玉米C 4 型p e p c 全长基因的简图( M a s u o k a , 1 9 8 9 ) F i g 1 2S c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ei n t a c tm a i z eC 4 s p e c i e sp e p cg e n e 个氨基酸残基组成( C r e t i n e ta l ，1 9 9 0 ) 。AVR a j a g o p a l a n 等( 1 9 9 4 ) 对玉米C 4 型P E P Cc D N A 序列分析显示，大多数保守序列位于C 末端区，推测该区域可能包含部分的酶催化位点。 日本学者从c D N A 序列分析推测玉米叶片的P E P C 的一级结构，其C 末端和N 末端分别含 有相对保守和可变的片段，其活性中心和调节位点可能分别位于此两片段中( I z u ie ta l ， 1 9 8 6 ) 。J i a o 等( 1 9 9 0 ) 研究表明，玉米P E P C 酶的磷酸化位点( S e r _ 1 5 ) 位于N 末端1 3 至2 l 片段之间，活性中心赖氨酸残基 ( L y s 6 0 6 ) 则在C 末端。 P E P C 的调控研究结果表明，大多数 P E P C 的活性受到正代谢效应物( 如6 磷酸 葡萄糖) 和负代谢效应物( 苹果酸、天冬氨 酸) 的变构调控( C h o l l e te ta l ，1 9 9 6 ) 。单子 叶植物P E P C 激活剂是G l y 和A l a ，双子叶 植物P E P C 的激活剂是葡萄糖6 磷酸 ( T a k a h a s h i T e r a d ae ta l ，2 0 0 5 ) ，N 末端附近 保守丝氨酸残基的可逆蛋白磷酸化的共价 3 图1 3C 3 植物细胞中C 4 微循环的机制( K u ，1 9 9 7 ) F i g 1 3E n g i n e e r i n go f al i m i t e dC 4p a t h w a yi nC 3 m e s o p h y l lc e l l 第一章文献综述 修饰等促进P E P C 活性；抑制剂是L 苹果酸、L 天冬氨酸等光合循环中的代谢因子( V i d a le t a l ，1 9 9 7 ) 抑制P E P C 活性。在转C 4 型p e p c 基因C 3 植物中，一般认为是P E P C 活性的过表 达诱导C 3 植物内源c 4 酶微循环( 图1 3 ) ( I m a i z u m iN ，1 9 9 7 ) 系统表达活性提高，减少了苹 果酸对P E P C 活性的抑制，使P E P C 对P E P 的亲和力提高( 焦德茂等，2 0 0 3 ) ，这有待进一步 研究论证。 1 3 利用C 4 途径关键酶基因p e p c 改善C 3 植物光合特性的可行性 c 。植物具有C 0 2 浓缩机制，C 0 2 补偿点低，光呼吸很低，光补偿点高的特性，能在高 温、高光强及低C 0 2 浓度、干旱等轻度胁迫条件下有较高的光合效率和水肥利用效率 ( B l a c k , 1 9 7 3 ；K u e t a l ，1 9 9 6 ；R i c h a r de t a l ，2 0 0 0 ；F u r b a n k e t a l ，2 0 0 0 ) 。C 4 光合关键酶在对生物和 非生物逆境( 机械损伤、低温、盐害、高光强及紫外辐射等) 的防御机制中也有较重要的作 用( W a l t e re ta l ，1 9 9 4 ；S c h a f e ta l ，1 9 9 5 ) 。而大多数农作物如小麦、水稻、大豆等均是C 3 植物， 由于光合作用都伴随着较高光呼吸，使得光合效率较低。所以，科学家们一直就期望将玉米 等C 。植物的高光效特性引入小麦等C 3 植物，以提高小麦等C 3 植物光合作用，进而提高小 麦品种生物学产量和籽粒产量。 酶学研究表明，c 3 途径和c 4 途径中的P E P C 存在着很高的同源性，而且编码这类蛋白 质的同源基因，是从同一祖先基因进化而来的。 进化和系统发育学研究指出，C 4 和C A M 植物是在逆境条件下经过长期驯化，从c 3 植 物进化来的( M o o r e ，1 9 8 2 ；K ue ta l ，1 9 9 6 ) 。虽然C 4 和C 3 植物在形态结构上存在着明显的差 异，但许多研究表明c 3 植物有可能在不具有K r a n z 结构的前提下，被诱导在单细胞中进行 类似C 4 循环的代谢。如水生植物H y d r i l l av e r t i c i l l t a ( B o w e s ，1 9 7 9 ；B o w e s e te ta l ，1 9 8 9 ；M a g n i n e ta l ，19 9 7 ；R e i s k i n de ta l ，19 9 7 ) 、E g e r i ad e n s a ( C a s a t ie ta l ，2 0 0 0 ) 、藜科植物B o r s z c z o w i a a r a l o c a s p i c a ( F r e i t a ge ta l ，2 0 0 0 ) 、典型C 3 植物烟草( H i b b e r d e ta l ，2 0 0 2 ) 等自身缺少C 4 植物 的典型解剖K r a n z 结构，但通过环境等诱导可以实现类似C 。循环的代谢方式。 高光效基因工程育种研究表明，利用生物技术手段将c 4 途径P E P C 酶基因转化c 3 植物 水稻( K ue ta l ，1 9 9 9 ，2 0 0 0 ；焦德茂等，2 0 0 1 ；J i a oDMe ta l ，2 0 0 5 ) 、小麦( 陈绪清等，2 0 0 4 ；张彬 等，2 0 0 7 ) ，成功获得了光合特性改善的转基因c 3 植物。以上这些事实证明此途径是切实可 行的。 1 4 C 4 途径p e p c 基因转C 3 植物的光合生理研究进展 据理论推算，太阳光能中真正被转化为作物各类物质的能量，小麦、水稻等C 3 植物为 光能的5 6 ，玉米等为光能的8 左右。但实际C 4 植物则只能转化所接受太阳光能的2 左右，C 3 植物仅为1 - 1 5 左右。若将光能利用率提高到5 左右，则小麦的经济产量可达 到1 0 0 0 k g 6 6 7 m 2 ，水稻可达到2 0 0 0 k g 6 6 7 m 2 ，提高光能利用率是实现小麦、水稻等C 3 植物 超高产的一条有效途径( 刘振业，1 9 7 9 ) 。匡廷云( 2 0 0 4 ) 提出，要大幅度提高光能利用率实 4 硕士学位论文：转玉米c 。型p e p c 基因小麦光合生理特性的研究 现超高产，就必须采用外在光能转化效率( 株型育种) 、内在光能转化效率( 高光效育种) 和杂种优势( 产量构成因素) 相结合的方式。目前，小麦与水稻等禾本科农作物的株叶型构 建和产量构成因素等遗传改良获得了巨大的成功，显著地提高了群体光合能力，同时收获指 数由2 0 世纪5 0 年代的0 3 左右提高到了O 5 5 左右( 许为钢等，1 9 9 4 ) ，实现了产量水平大幅 度提高。在此基础上若实现超高产，重在如何改进单位叶面积的光合机能( 许为钢等，2 0 0 9 ) 内在光能转化效率。近些年，由于生物技术的飞跃发展，将玉米等C 4 植物P E P C 酶基 因( 高光效特性) 引入小麦、水稻等C 3 植物，为提高C 3 植物的光合效能提供了机遇和途径。 许多研究表明，C 4 途径P E P C 活性在转基因C 3 植物中可以高表达。转玉米p e p c c D N A 烟草 植株的P E P C 活性比对照提高了2 2 倍( H u d s p e t he ta l ，19 9 2 ) ；转C o r y n i b a c t e r i u mg l u t a n i c u m 、 Ec o l i 和F l a v e r i at r i n e r v i a p e p c 马铃薯的P E P C 活性比对照分别提高了2 4 、5 4 倍( K o g a m i e ta l ，19 9 4 ；G e h l i ne ta l ，19 9 6 ) ；转玉米p e p cc D N AM o r i c a n d i aa r v e n s i s ( C 3 C 4 中间类型植物) 植 株的P E P C 活性为对照2 倍( T a n a b ee ta l ，2 0 0 0 ) ，但以上研究都未能提高转基因植株的光合 速率。 K u 等( 1 9 9 9 ) 利用农杆菌介导将玉米全长p e p c 基因( M a t s u o k ae ta l ，1 9 8 9 ) 导入水稻 K i t a a k e 中，将P E P C 活性提高了1 11 0 倍，而且耐光氧化能力增强。此研究成果又一次引起 了社会各界科学家们的关注。其中高表达的转P E P C 基因植株水稻引人注目，但有关光合生 理的研究有不同的报道。A g a r i a 等( 2 0 0 2 ) 和F u k a y a m a 等( 2 0 0 3 ) 对在室内中等光强下生 长的P E P C 活性增加5 0 倍转基因水稻的研究发现，其光合速率的变化不明显，暗呼吸速率 增加了1 5 倍，而且P E P C 活性与光合速率没有显著相关性。然而在我国长江中下游地区夏 季高光强和高温的自然条件下，焦德茂课题组利用K u 等的T 3 代转P E P C 基因材料，通过加 代和检测，获得了稳定高表达2 0 倍的转基因株系，净光合速率提高了5 5 ( 焦德茂等，2 0 0 2 ) 。 J i a o 等( 2 0 0 3 ) 研究发现原种水稻叶片中具有完整的C 4 光合酶体系；用外源O A A 或M A 饲 喂叶片或叶绿体后明显增加了光合速率，证明具有一个有限的光合C 。微循环。随之又对其 株系的光合生理特性做了较深入、系统地研究。 对净光合速率分别对光强、温度、C 0 2 浓度响应的研究表明，转基因水稻的光饱和点比 原种K i t a a k e ( 对照) 提高了2 0 0 I t m o l m s ，表观量子效率( A Q Y ) 没有明显变化，饱和 光合速率比原种提高5 5 ( 达到了3 l “m o l C 0 2 m s 。1 左右) ，利用高光强的能力增强；对照 的最适温度为3 0 3 5 ( 2 间，而转基因水稻表现出较宽广的适应温度，并且比对照有较好地适 应高温、低温的能力；羧化效率提高5 0 ，C 0 2 补偿点降低2 6 ，呈现出较强吸收C 0 2 的 能力( 黄雪清等，2 0 0 2 ；J i a oD e m a oe ta l ，2 0 0 3 ) 。迟伟等( 2 0 0 1 ) 测定转基因水稻和对照的P E P C 酶活性以及光合速率的日变化，研究表明，两者在一天中转基因水稻的变化均高于对照，且 变化趋势相似；P E P C 酶活性日变化均呈现单峰，早晨较低，伴随着光有效辐射的增加在中 午1 2 ：0 0 时刻达到最大，光强减弱其随之下降，然而对照除中午1 2 ：0 0 外其他时刻仅有微 弱的变化；光合速率日变化转基因水稻呈现单峰，峰值出现在1 0 ：0 0 时刻( 光强达到 第一章文献综述 1 2 0 0 l m a 0 1 m - 2 s 。1 ) ，对照变化呈现双峰曲线，峰值分别出现在1 0 ：0 0 、1 5 ：0 0 时刻，上午峰 大于下午峰，出现了许大全等( 1 9 9 2 ) 所指出的“午休”现象。 焦德茂等( 2 0 0 1 ) 研究在高光强( 3 h ) 和光氧化剂甲基紫精( M V ) 处理后，与对照相 比，转基因水稻的P S I I 光化学效率( F v F m ) 、光化学猝灭( q P ) 下降较少，耐光氧化能力 增强。王仁雷等( 2 0 0 2 ) 研究在高光强1 4 0 0 1 , t m o l n 1 - 2 s d ( 2 h ) 下，转基因水稻的F v F m 下 降较少、q P 较恒定；光氧化处理后，F v F m 下降较少、叶绿素含量和组分的衰减较慢。张 谦等( 2 0 0 4 ) 研究了夏季高光高温自然条件下叶绿素荧光参数和活性氧代谢有关指标的日变 化进程，发现转基因水稻的光合作用光抑制减轻，使用P E P C a s e 的专一抑制剂3 ，3 二氯2 ( 二 羟膦甲基) 丙烯酯( D C P C ) 证明光合增加确与P E P C 基因的导入有关；在中午均有光抑制 现象，其中转基因水稻中午F v F m 下降较少，光抑制较轻，光能转化为化学能的效率较高， 热耗散较低。王荣富等( 2 0 0 7 ) 研究中午高光强较早晨低光强下P E P C a s e 活性显著提高， 且转基因水稻提高较多；光氧化条件下，叶绿素和蛋白质含量均发生不同程度的衰减，但转 基因水稻降幅显著低于对照，表现出耐光氧化的能力。李霞等( 2 0 0 5 ) 研究结果表明，与对 照相比，转基因水稻随光氧化逆境的加剧，使得叶片中超氧化物歧化酶( S O D ) 和过氧化物 酶( P O D ) 诱导活性逐步增强，超氧阴离子的产生速率较低，膜脂过氧化物丙二醛( M D A ) 积累较少，维持较稳定的P sI I 活性和光合能力，表现耐光抑制、光氧化特性。 何立斌等( 2 0 0 5 ) 研究水稻在分蘖初期、分蘖盛期、拔节期、始穗期、齐穗期、成熟期 和剑叶不同生长时期的光合动态变化发现，转基因水稻的P E P C a s e 活性和净光合速率在不 同时期各不相同，相对对照，均有不同程度的提高；剑叶完全展开时两者提高最明显。 朱素琴等( 2 0 0 4 ) 研究的N a H S 0 3 处理后转基因水稻净光合速率大幅增加，这与已知可 促进循环光合磷酸化的辅助因子硫酸甲酯吩嗪( P M S ) 的效应相似( 增加了A T P 的供应) ，推 测水稻叶片中增加A T P 的供应可明显增强水稻的光合速率。张边江等( 2 0 0 8 ) 研究验证了 A T P 处理后转P E P C + P P D K 双基因水稻增强了光合生产力，表明A T P 是设计类似C 4 基因水 稻的关键因子。 凌丽俐等( 2 0 0 6 ) 运用稳定和放射性碳同位素研究第8 代转P E P C 基因水稻表明，该种 质为C 3 植物，但C 。原初光合产物增多，表现出C 。光合特性有所改善，并且能够稳定遗传。 李霞等( 2 0 0 7 ) 研究发现，转基因水稻叶片、茎鞘和穗干重有部分增加，但以穗重增加为主； 籽粒中可溶性糖含量和蛋白质含量显著增加，淀粉含量没有增加，推测籽粒中较多的可溶性 糖可能更多