油茶AACT基因和FAD6基因的全长cDNA克隆及原核表达-硕士论文

工S2 773 F u l l l e n g t he D N Ac l o n i n go f A A C T g e n ea n dF A D 6g e n e f r o mC a m e l l i ao l e i f e r aa n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n b y H uJ i a o At h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e R e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f M a s t e ro fA g r i c u l t u r e i n F o r e s tg e n e t i c sa n dB r e e d i n g l n C e n t r a lS o u t hU n i v e r s i t yo fF o r e s t r ya n dT e c h n o l o g y 4 9 8S h a o s h a nS o u t hR o a d ，T i a n x i nD i s t r i c t C h a n g s h aH u n a n4 10 0 0 4 ，P R C H I N A S u p e r v i s o r P r o f e s s o rT a nX i a o f e n g M a y ，2 0 1 0 中南林业科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所旱交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技人学或 其他教育机构的学位或证j 1 5 所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的 个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后 果由本人承担。 、 作者签名：啾 I 砂o 年S 月7 中日 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或 借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于： 1 、 保密口，在年解密后适目j 本授权二B 。 2 、 不保密d 。 ( 请您在以上相应方框打“、”) 作者签名：舨 导师签名： 7 。l o 年5 月y 妒日 加N 年蚋叶日 本研究论文得到国家“十一五 科技支撑课题一一“油 茶可持续丰产栽培关键技术研究”( 编号：2 0 0 9 B A D B 1B 0 2 ) 及国家“十一五 科技支撑专题一一“油茶优质高产栽培技 术研究( 编号：2 0 0 6 B A D 18 8 0 2 0 4 ) ”的经费资助，谨此致谢! 。 硕十学位论文油茶A A C T 基冈和F A D 6 基因的c D N A 克隆及原核表达 摘要 油茶是我国南方重要的木本油料树种，也是世界四大木本油料树种 之一。茶油是优质的食用油，主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成， 其含量一般在9 0 以上。在油脂合成过程中，乙酰辅酶A 酰基转移酶 ( A A C T ) 催化蛋白质的酰基化和去酰基化，而脂肪酸脱饱和酶6 ( F A D 6 ) 则控制油酸脱氢形成亚油酸和亚麻酸等多不饱和脂肪酸。本研究在油茶 种子c D N A 文库和E S T 序列的基础上，通过油茶种子R N A 提取、筒并 R T P C R 、R A C E 、生物信息学分析、原核表达等方法分离克隆了油茶A A C T 和F A D 6 基因的全长c D N A ，并研究了其原核表达，为揭示油茶油脂合成 规律和油茶的分子育种提供了理论依据和科学基础。主要研究结果如下： 1 油茶A A C T 基因的全长c D N A 克隆。通过序列分析从本实验室已 构建的油茶近成熟种子E S T 文库中鉴定出一条油茶A A C T 基因，克隆编 号为6 15 5 ，总长度为l414 b p ，编码序列l l5 9 b p ，含2 0 3 b p 的完整的3 端U T R ( U n t r a n s l a t e dr e g i o n ，非转录区) 。通过B l a s t 分析发现油茶A A C T 基因5 端缺失约l4 个氨基酸残基。在已知油茶A A C T 基因E S T 序列基 础上，设计6 条特异引物，以油茶优良无性系湘林l 号种仁总R N A 为模板，通过反应体系和反应条件优化，最终通过A U A P G S P 2 引物组合 扩增出一条7 0 0 b p 左右的目的片段，将该片段回收、克隆、测序，获得 7l8 b p 的c D N A 序列，将该序列与油茶A A C T 基因进行序列拼接，确定 了油茶A A C T 基因的全长c D N A 序列，将该序列提交至G e n e B a n k ，登录 号为G U 5 9 4 0 5 9 。 2 油茶A A C T 基因的生物信息学分析。油茶A A C T 基因全长c D N A 序列为14 9 5 b p ，含有一个12 2 7 b p 的O R F ，编码4 0 8 个氨基酸残基；此 外还含有长6 5 b p 的57 端非编码区，长2 0 3 b p 的3 端非编码区及一个 p o l y A 尾巴。在氨基酸序列水平上，该基因与胡黄连( Pk u r r o o a ) 的A A C T 基因的相似性最高，为8 6 ，与稻瘟病菌( M g r i s e a ) 的最低，为6 5 。 通过在线预测，油茶A A C T 基因编码蛋白的等电点p I 为6 19 ，分子量 M w 为4 16 2 8 6 D a ，不稳定系数为2 5 7 3 ，属于稳定蛋白；该蛋白整体表 现为疏水性，存在有极小几率的信号肽，是一个非分泌蛋白。次蛋白内 含有4 0 4 4 的a 螺旋，15 4 4 的1 3 折叠，具有6 个不为明显的螺旋结构。 I 硕十学位论文 模体搜索结果表明在A A C T 上具有两个硫解酶结构域，并存在多种N 糖 基化位点、蛋白激酶C 磷酸化位点、硫解酶活性位点等多个功能结构域。 3 油茶A A C T 基因的原核表达。将测序为正确的重组克隆质粒 ( p M D l8 A A C T ) 用N c oI 和X h oI 双酶切并回收后，与同样双酶切回收 的P E T 2 8 a 相连接，转化至B L 2l 感受态细胞中，得到的转化子经P C R 鉴定和双酶切分析，筛选出符合J 下确阅读框的重组子，成功地构建重组 表达质粒( p E T 2 8 a A A C T ) ，并得到了油茶A A C T 蛋白，分子量为 4l6 2 8 6 D a ，与预期分子量大小完全一致。 4 油茶F A D 6 基因的全长c D N A 克隆。根据G e n e B a n k 中己发布的 F A D 6 基因的序列信息，通过核苷酸序列和氨基酸序列的多序列比对，在 F A D 6 基因的保守区设计一对简并引物，以油茶优良无性系湘林一号种仁 总R N A 为模板，通过简并R T P C R 、回收、克隆、测序后，获得一条4 8 6 b p 的e D N A 序列，B l a s t 分析后确定该序列即为油茶F A D 6 基因部分序列， 与茶树( C a m e l l i as i n e n s i s ) 的C s F A D 6 基因相似性最高，为9 6 ，仅有 1 1 处碱基不同。根据茶树C s F A D 6 基因的全长e D N A 序列信息，在包含 起始密码子和终止密码子附近设计一对特异引物，通过R T P C R 、回收、 克隆、测序，成功获得一条长为l4 51b p 的e D N A 序列，序列分析确定该 序列即为油茶F A D 6 基因的全长e D N A ，并将该序列提交至G e n e B a n k ， 登录号为G U 5 9 4 0 6 0 。 5 油茶F A D 6 基因的生物信息学分析。油茶F A D 6 基因O R F ( O p e n R e a d i n gF r a m e ，开放阅读框) 大小为l3 4 7 b p ，编码4 4 8 个氨基酸残基； 在氨基酸序列水平上，该基因与茶树( C s i n e n s i s ) 的C s F A D 6 基因的相 似性最高，为8 6 ，与洋蓝蓟( E g e n t i a n o i d e s ) 的最低，仅为3 6 。通 过在线预测，油茶F A D 6 基因编码蛋白的等电点p I 为8 6 7 ，分子量M w 为5l38 2 3 D a ，不稳定系数为4 3 9 0 ，属于不稳定蛋白；具有两个跨膜结 构域，没有信号肽切割位点，是一个非分泌蛋白。该蛋白内含有4 5 7 6 的Q 螺旋，7 5 9 的1 3 折叠，可能存在4 个螺旋结构。模体搜索结果表 明在油茶F A D 6 上存在一个C y t b 5 ( 细胞色素5 ) 结构域，并同时具有多 种N 糖基化位点、蛋白激酶C 磷酸化位点、N 肉豆蔻磷酸化位点等多个 功能结构域。 关键词：油茶；脂肪酸合成；A A C T ；F A D 6 ；e D N A 克隆；R A C E ；原核表达 n 硕士学位论文 油茶A A C T 基冈和F A D 6 基冈的e D N A 克隆及原核表达 Ab s t r a c t A st h ep r i n c i p a ls p e c i e so fw o o d yo i lp l a n t si nt h eS o u t ho fC h i n a ， C a m e l l i ao l e i r e r ai so n eo ft h ef o u rm o s t f a m o u se d i b l eo i l w o o d y p l a n t s C a m e l l i ao i lc o n t a i n so l e i ca c i da n dl i n o l e i ca c i dU F Am o s t l y ，a n d t h ea v e r a g ec o n t e n to fU F Ai sa b o v e9 0 I nt h ep r o c e s so ft h eo i l c o m b i n i n g A A C T i sa n e n z y m e t h a t c a t a l y z e s t h ef o r m a t i o no f a c e t o a c e t y l C o Af r o mt w om o l e c u l e so fa c e t y l C O A F a t t y a c i dd e s a t u r a s e c a t a l y z eo l e i ca c i di n t ol i n o l e i ca c i d ，l i n o l e n i ca c i da n db yd e h y d r o g e n a t i o n O nt h eb a s eo ft h ee D N Aa n dE S Tl i b r a r yo fC a m e l l i ao l e i f e r a W eh a v e s e p a r a t i e d a n di d e n t i f i e dA A C Ta n dF A D 6f r o mt h ee D N Al i b r a r yo f C a m e l l i ao l e i f e r ab yt h em e t h o d so fR N Ac o l l e c t 、d e n g e n e r a t i o nR T P C R 、 b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i sa n dP r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，S ot h es t u d yo fA A C T a n dF A D 6g e n ef r o mC a m e l l i aO l e i f e r aa r ei m p o r t a n tf o rr e v e a l i n gt h e l i p i d sb i o s y n t h e s i sp a t t e r n sa n dm o l e c u l a rb r e e d i n gi nC a m e l l i aO l e i f e r a T h em a i nr e s u l t si nt h ep a p e ra r ea sf o l l o w s ： 1 F u l l l e n g t he D N Ac l o n i n go fa c e t y l C o AC - a c e t y l t r a n s f e r a s eg e n e f r o mC a m e l l i ao l e i f e r a I nt h ec o n s t r u c t e de D N Al i b r a r yo f C a m e l l i a o l e i f e r ab yo u rl a b o r a t o r y ，t h e r ei saA A C Tg e n e ，t h ec l o n en u m b e ri s6 15 5 ， t h et o t a ll e n g t hi s1414 b pa n d2 0 3 b pu n t r a n s l a t e dr e g i o na t3 e n d a n dh a sa e D N As e q u e n c ed e l e t i o no fu n t r a n s l a t e dr e g i o na n dc o d e sa b o u t14a m i n o a c i d sa t5 t e r m i n a l ，B a s eo ns e q u e n c e si n f o r m a t i o no fA A C Tg e n e ，w e d e s i g n e ds i xp a i ro fp r i m e ri nA A C Tc o n s e r v e dr e g i o n s ，a7 0 0 b pf r a g m e n t w a so b t a i n e db y5 R A C Es t r a t e g yt oa m p l i f yt h eR N Ao fs e e do ff i n e v a r i e t i e sc l o n eX i a n g L i nN o 1 A c c o r d i n gt ot h es p l i c e ds e q u e n c ea n d a n a l y z i n go fb l a s t ，w ec a nc o n c l u d et h es e q u e n c ei sp a r t - l e n g t he D N Ao f F A D 6g e n e ，w eh a v es u b m i tt h es e q u e n c et ot h eG e n e B a n k ，t h er e c e i p t n u m b e ri sG U 5 9 4 0 5 9 2 B i o i n f o r m a t i ca n a l y s i so fA A C Tg e n ef r o mC a m e l l i ao l e i f e r a T h e e D N As e q u e n c ei s14 9 5 b pi nl e n g t h ，a n dh a sa12 2 7 b pO R Fc o d i n g4 0 8 I I I 硕十学位论文 油茶A A C T 基冈和F A D 6 基冈的e D N A 克隆及原核表达 a m i n oa c i d s ，2 0 3 b pu n t r a n s l a t e dr e g i o na t5 e n da n d3 1 1b pu n t r a n s l a t e d r e g i o nw i t hap o l y At a i l a t3 e n db yu s i n gV e c t o rN T I9 0 B i o i n f o r m a t i c a n a l y s i so fA A C Tg e n ef r o mC a m e l l i ao l e i f e r a T h ee D N As e q u e n c e i s 14 9 5 b pi nl e n g t h ，a n dh a sa12 2 7 b pO R Fc o d i n g4 0 8a m i n oa c i d s ，2 0 3 b p u n t r a n s l a t e dr e g i o na t5 e n da n d311b pu n t r a n s l a t e dr e g i o nw i t hap o l y A t a i la t3 e n db yu s i n gV e c t o rN T I1O 0 T h eh o m o l o g yp e r c e n t a g eo ft h e c D N As e q u e n c ef r o mc a m e l l i ao l e i f e r aw i t h 尸- k u r r o o ai nG e n e B a n ki So v e r 8 6 ，S Ow ec a nc o n c l u d et h es e q u e n c ei sf u l l l e n g t he D N Ao fA A C Tg e n e T h es e c o n ds t r u c t u r e ，i s o e l e c t r i cp o i n t ，m o l e c u l a rw e i g h t ，t r a n s m e m b r a n e d o m a i na n ds i g n a lp e p t i d ea n dS Oo no ft h ed e d u c e da m i m oa c i ds e q u e n c e w a sp r e d i c t e da n da n a l y z e db yA n t h e p r o t5 0 ，a n dt h er e s u l t sa r e ：p Iv a l u ei s 6 19 ，m o l e c u l a rw e i g h ti s416 2 8 6D a ，u n s t a b i t i l yr a t i oi s2 5 7 3 ，b e l o n gt oa s t a b i t i l yp r o t e i n b e l o n gt os t a b i t i l yp r o t e i n ，i ta l s oh a v et w os t e pa s t r i d e s t r u c t u r er e g i o n ，n os i n g a lp e p t i d es i t e ，i s au n s e c r e t o r yp r o t e i n ，s i x t r a n s m e m b r a n ed o m a i n ，O t h e rr e s u l t so fA A C Th a v et w oT h i o l a s e sa c t i v e s t r u c t u r er e g i o n ，a n da l s oh a v em a n yc A M P - a n dc G M P d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t ea n dP r o t e i nk i n a s eCp h o s p h o r y l a t i o ns i t ea n d T h i o l a s e sa c t i v es i t e 3 P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fA A C Tg e n ef r o mC a m e l l i ao l e i f e r a T h e f r a g m e n te n c o d i n gt h eA A C Tg e n e w a se x c i s e df r o mt h ep o s i t i v ec l o n e p M D 18 A A C Tb yN c oIa n dX h oIa n dp u r i f i e db ya g r o s eg e lf r a c t i o n m e t h o d ，t h e nt h ef r a g m e n t w a ss u b c l o n e di n t ot h ep E T - 28 ae x p r e s s i o n v e c t o rd i g e s t e db yN c oIa n dX h oI r e s t r i c t i o ne n z y m e s ，t h er e c o m b i n a n t e x p r e s s i o np l a s m i d s w e r ei d e n t i f i e db yP C Ra n dr e s t r i c t i o ne n z y m e s a n a l y s i s T h er e s u l t si n d i c a t e dt h ef r a g m e n tw a sc o r r e c t l yi n s e r t e di n t ot h e p E T 2 8 ae x p r e s s i o nv e c t o ra n dc o n f o r m e dt o ar e a d i n gf r a m e T h ef u s i o n p r o t e i n w e r e e x p r e s s e d i nE c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) h o s tw i t h a p r e d i c t e d m o l e c u l a rw e i g h to f41k D a 4 F u l l l e n g t h e D N Ac l o n i n go ff a t t ya c i dd e s a t u r a s e6g e n ef r o m C a m e l l i ao l e i f e r a B a s eo ns e q u e n c e si n f o r m a t i o no fF A D 6g e n ep u b l i s h e d i nG e n e B a n k ，w ed e s i g n e dap a i ro fp r i m e ri nF A D 6c o n s e r v e dr e g i o n s ，a I V 硕十学位论文 油茶A A C T 基冈和F A D 6 基冈的c D N A 克隆及原核表达 4 8 6 b pf r a g m e n tw a so b t a i n e db yR T P C Rs t r a t e g yt oa m p l i f yt h eR N A o f s e e do ff i n ev a r i e t i e sc l o n eX i a n g L i nN o 1 A f t e ra n a l y z i n go fb l a s t ，w ec a n c o n c l u d et h es e q u e n c ei sp a r t l e n g t he D N Ao fF A D 6g e n e ，t h e r ei so n l y1 1 b a s i cg r o u p si n d i f f e r e n t l y ，b a s eo ns e q u e n c e si n f o r m a t i o no ft h eF A D 6g e n e ， a14 5lb ps e q u e n c ew a sf o r m e db yR T - P C R ，w eh a v es u b m i tt h es e q u e n c et o t h eG e n e B a n k ，t h er e c e i p tn u m b e ri sG U 5 9 4 0 6 0 5 B i o i n f o r m a t i ca n a l y s i so fF A D 6g e n ef r o mC a m e l l i ao l e i f e r a T h e c D N As e q u e n c eh a sa13 4 7 b pO R Fc o d i n g4 4 8a m i n oa c i d s ，t h eh o m o l o g y p e r c e n t a g eo ft h ee D N As e q u e n c ef r o mc a m e l l i ao l e i f e r aw i t hC s F A D 6o f C a m e l l i as i n e n s i si nG e n e B a n ki so v e r8 6 ，a n dw i t ht h eE g P 行f f 口”D f d P si s b e l o w36 T h es e c o n ds t r u c t u r e ，i s o e l e c t r i cp o i n t ，m o l e c u l a rw e i g h t ， t r a n s m e m b r a n ed o m a i na n ds i g n a lp e p t i d ea n dS Oo no ft h ed e d u c e da m i m o a c i ds e q u e n c ew a sp r e d i c t e da n da n a l y z e db yA n t h e p r o t5 0 ，a n dt h er e s u l t s a r e ：p Iv a l u ei s8 6 7 ，m o l e c u l a rw e i g h ti s 513 8 2 3D a ，b e l o n gt ou n s t a b i t i l y p r o t e i n ，i ta l s oh a v et w os t e pa s t r i d es t r u c t u r er e g i o n ，n os i n g a lp e p t i d es i t e ， i sau n s e c r e t o r yp r o t e i n ，f o o rt r a n s m e m b r a n ed o m a i n ，O t h e rr e s u l t so fF A D 6 h a sa C y t b 5 s t r u c t u r e r e g i o n ，a n d a l s oh a v em a n yc A M P - a n d e G M P d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t ea n dP r o t e i nk i n a s eC p h o s p h o r y l a t i o ns i t ea n dN m y r i s t o y l a t i o ns i t e K e yw o r d s ：C a m e l l i ao l e i f e r a ；A A C T ；F a t t yA c i dB i o s y n t h e s i s ；F A D 6 ； e D N Ac l o n e ；R A C E ；P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n V 硕+ 学位论文油茶A A C T 基冈和F A D 6 基冈的e D N A 克隆及原核表达 目录 摘要I I I A B S T R A C T I I l l 绪言1 1 1 油茶概述1 1 2 油茶的分子生物学研究2 1 2 1 油茶的c D N A 文库和E S T 文库的构建2 1 2 2 油茶的分子标记研究3 1 3 脂肪酸的种类与作用4 1 3 1 脂肪酸的种类4 1 3 2 脂肪酸的作用5 1 4 饱和脂肪酸的合成途径及各种催化酶7 1 4 1 脂肪酸的生物合成7 1 4 2 乙酰C o A 羧化酶8 1 4 3 脂肪酸合酶系统8 1 4 4 脂酰基酰基载体蛋白硫脂酶12 1 5 不脂肪酸的生物合成及脂肪酸脱饱和酶13 1 5 1 不饱和脂肪酸的生物合成13 1 5 2 脂肪酸脱饱和酶13 1 6 脂肪酸合成的调节18 1 7 本项研究的意义和技术路线18 2 油茶A A C T 基因克隆及原核表达2 l 2 1 材料2l 2 1 1 植物材料2l 2 1 2 菌株与质粒21 2 1 3 主要试剂2 1 2 1 4 主要仪器设备2 2 2 2 方法2 3 2 2 1 油茶E S T 文库中A A C T 基因的分离及鉴定2 3 2 2 2 油茶种子总R N A 提取2 4 V l 硕+ 学位论文 油茶A A C T 基因和F A D 6 基冈的e D N A 克隆及原核表达 2 2 35 R A C E 引物设计2 6 2 2 4m R N A 反转录获得单链e D N A 2 7 2 2 55 R A C E 扩增2 8 2 2 6 目的片段回收2 9 2 2 7D H 5 a 感受态细胞的制备3 0 2 2 85 R A C E 片断的克隆3l 2 2 9T 载体重组子的制备31 2 2 10P C R 鉴定R A C E 片断的蕈组子3 2 2 2 1 1 油茶A A C T 基因全长c D N A 克隆3 2 2 2 12 油茶A A C T 基因的生物信息学分析3 4 2 2 13 油茶A A C T 基因的原核表达3 4 2 3 结果与分析3 8 2 3 1 油茶A A C T 基因的鉴定3 8 2 3 2 油茶A A C T 基因5 端完整序列扩增4 0 2 3 3 油茶A A C T 基因全长e D N A 的克隆4 3 2 3 4 油茶A A C T 基因的生物信息学分析4 3 2 3 5 油茶A A C T 基因的原核表达5 2 3 油茶F A D 6 基因全长C D N A 克隆与生物信息学分析5 6 3 1 材料5 6 3 1 1 植物材料5 6 3 1 2 菌株与质粒5 6 3 1 3 主要试剂5 6 3 1 4 主要仪器和用品5 7 3 2 方法5 7 3 2 1 油茶种子胚乳总R N A 提取及电泳检测5 7 3 2 2m R N A 反转录获得单链5 7 3 2 3 简并引物设计5 7 3 2 4 简并引物P C R 扩增5 7 3 2 5 目的片段回收5 8 3 2 6 感受态细胞的制备5 8 3 2 7T 载体重组子的制备5 8 3 2 8P C R 鉴定重组子及测序5 8 V n 硕十学位论文 油茶A A C T 基冈和F A D 6 基冈的e D N A 克隆及原核表达 3 2 9 扩增C D S 引物设计5 9 3 2 10C D S 的扩增及回收5 9 3 2 11 重组子转化感受态细胞5 9 3 2 I2P C R 鉴定重组子及测序。5 9 3 3 结果与分析6 0 3 3 1 油茶种子总R N A 的提取质量6 0 3 3 2 简并R T P C R 产物电泳检测6 0 3 3 3 重组子鉴定结果6 0 3 3 4 油茶F A D 6 基因完整C D S 扩增电泳结果61 3 4 油茶F A D 6 基因的生物信息学分析6 2 3 4 1 核苷酸序列分析6 2 3 4 2 蛋白质序列分析6 6 4 小结与讨论一7 l 4 1 油茶文库建立7 1 4 2 油茶种子总R N A 的提取7l 4 3R A C E 合成7 2 4 4 扩增基因完整C D S 7 2 4 5 简并P C R 7 3 4 6 生物信息学分析7 3 4 7 原核表达7 4 5 结论与创新7 5 5 1 结论7 5 5 2 创新点7 6 参考文献7 7 附录A 实验药品8 6 附录B 缩略词8 9 附录CG e n e B a n k 提交序列信息9 l 附录D 硕士研究生阶段发表的学术论文9 3 致谢9 4 v I I I 硕十学位论文 油茶A A C T 基冈和F A D 6 基冈的c D N A 克隆及原核表达 1 绪言 1 1 油茶概述 油茶为( C a m e l l i ao l e i f e r a ) 山茶属多年生常绿乔木，虫媒异花授粉树 种。山茶属内有3 0 多个物种的油脂可供食用，如普通油茶( C a m e l l i a D ，P i f e r a A ) 、小果油茶( C M e i o c a r p aH u ) 等。油茶是是我困南方莺要的木 本油料树种，也是我国基本的木本食用油料树种，与油棕、油橄榄和椰 子并称为世界四大木本食用油料植物，广泛分稚于湖南、江西、广西等 l7 个省( 市、自治区) ，1 l0 0 多个县( 市) ，有着2 3 0 0 多年的栽培历史。 油茶分布区的北界在淮河一秦岭线；南界大致在北回归线附近；东界 为东南海岸和台湾；西界是云南的怒江流域和青藏高原的东缘。垂直分 布在东部地区一般在海拔8 0 0 米以下，西部地区可达海拔2 0 0 0 米 ! - 3 1 。 油茶种子大概在每年的10 月中下旬成熟，外面包有一层厚厚的果 皮，内有2 5 粒种子。种子由一层较硬的褐色种皮包裹着，种子内是种 仁，其主要成份是胚乳。当油茶果成熟后，果皮张开，种子自然脱落。 农户一般将成熟的油茶果摘下后，晒干，压榨而得到茶油，但产油率很 低。在工业上，茶油的生产一般经过清理、剥壳、轧胚、蒸炒、浸出、 精炼等：【序。也有研究者用超临界C 0 2 萃取茶油，工艺简单，茶油纯度 高，油的质量好，残油少，但成本较高。 油茶因其种子可榨油( 茶油) 以供食用，所提炼出来的优质食用油， 色清质纯，营养丰富，略带茶油特有的芬芳，茶油主要由油酸和亚油酸 等不饱和脂肪酸组成，总含量占9 0 左右，尤其是前者，一般在8 0 以 上；而饱和脂肪酸( 含量一般在l0 左右) 主要由棕榈酸( 占7 9 ) 和 硬脂酸( 占l 3 ) 组成；同时还含有微量的棕榈油酸和肉豆蔻酸1 4 J 。 茶油中不含有难以消化的芥酸和山俞酸，因此长期食用茶油能补充人体 内缺少的不饱和脂肪酸，有益人体健康是优质食用油，可以和橄榄油媲 美【”。油茶不仅具有较高的食用价值，而且具有较好的药用价值，茶油 具有预防，I i , 血管硬化、降血压、降血脂等药用功效，还可用作化妆品或 原料。油茶果除榨取食用油外，还能制取多种工业原料，具有较高的综 合开发价值。茶油还是重要的工业和医药原料，它是肥皂、凡士林、机 械润滑油、机械防锈油。此外，油茶耐瘠薄能力特别强，是我国南方丘 陵红壤地区的先锋树种，对该地区的造林绿化和生态保护起着非常重要 的作用【6 1 。 硕卜学位论文 油茶A A C T 基闪和F A D 6 基冈的c D N A 克隆及原核表达 1 2 油茶的分子生物学研究 我国已经开展了几十年的油茶育种和研究，主要集中在良种选育、 优质丰产栽培、油茶生物学特性和油脂加工利用研究，并且在实际生产 中得到了应用，取得了很好的经济效益、社会效益和生态效益。随着国 内外生物技术及分子生物学的迅速发展，传统的研究及应用方法已经不 能满足现今人们充分利用油茶这一巨大资源的需求，从8 0 年代开始我国 对油茶的遗传基础进行了分子水平上的初步研究。 1 2 1 油茶的c D N A 文库和E S T 文库的构建 c D N A 文库是指从植物活细胞中提取到的所有的m R N A 经过反转录， 并采用体外克隆技术得到的一个重组c D N A ( c o m p l e m e n t a r yD N A ) 分子群 体【7J 。c D N A 文库是以真核生物的m R N A 为材料，利用m R N A 具有p o l y A 尾巴的特性，首先反转录c D N A 第一链，然后将m R N A 与D N A 杂交形 成双链c