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第 6 卷 第 9 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol. 6 No. 9 2015 年 9 月 Journal of Food Safety and Quality Sep. , 2015 *通讯作者: 钱蔚, 科技中心总监, 高级工程师, 主要研究方向为保健食品、药品研发与注册、行业政策法规研究及生产工艺和质量管理。 E-mail: qianweiby- *Corresponding author: QIAN Wei, Senior Engineer, By-Health Co., Ltd., Zhuhai 519040, China. E-mail: qianweiby- 多种蜂胶中总黄酮检测方法的适用性研究 杨亚飞 1, 胡烨敏2, 钱 蔚1*, 曾燕媚2, 游景水1, 杨祖伟1 (1. 汤臣倍健股份有限公司, 珠海 519040; 2. 广州市宜健医学技术发展有限公司, 广州 510663) 摘摘 要要: 目的目的 通过 3种分光光度法之间差异的比较和适用性考量, 筛选出适合检测蜂胶中总黄酮含量的分光 光度法。方法方法 采用同批次样品, 对蜂胶(国产蜂胶和巴西绿蜂胶)中总黄酮检测方法进行回收率和含量测定, 并对结果进行分析。结果结果 巴西绿蜂胶粉 3 种方法的检测结果为 4.999.34 g/100 g; 国产蜂胶粉 3 种方法的检 测结果为 7.8217.97 g/100 g, 其 RSD 为 24.2%31.2%; 可见 3 种方法测定结果偏差较大。结论结论 GB/T 20574-2006 的方法最适合蜂胶中总黄酮的检测。 关键词关键词: 蜂胶; 总黄酮; 分光光度法; 含量测定 Applicability of methods for detection of total flavone in multiple propolis YANG Ya-Fei1, HU Ye-Min2, QIAN Wei1*, ZENG Yan-Mei2, YOU Jing-Shui1, YANG Zu-Wei1 (1. By-Health Co., Ltd., Zhuhai 519040, China; 2. Guangzhou Yi-Jian Biomedical Technology Development Co., Ltd., Guangzhou 510663, China) ABSTRACT: Objective To choose the best method for detection of the total flavone content in propolis by comparing the differences of 3 spectrophotometry methods. Methods The content of total flavone in the samples (domestic propolis and Brazilian green propolis) from the same batch was determined by the 3 different methods respectively and the results were analyzed. Results By different methods, the content of total flavone was 4.999.34 g/100 g in green propolis, and 7.8217.97 g/100 g in domestic propolis, with the RSD of 24.2%31.2%. There was a big deviation among the 3 methods. Conclusion The method from GB/T 20574-2006 is the best one to determine the total flavone content in propolis. KEY WORDS: propolis; total flavone; spectrophotometry; content determination 1 引 言 蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干破皮伤处采集来 的树脂(树胶), 并混入蜜蜂上颚腺的分泌物, 与蜂 蜡、 花粉等加工而成的一种具有芳香气味和黏性的胶 状固体物质1。蜂胶的化学成分取决于蜜蜂采集树脂 的地区和植物, 不同地区的蜂胶化学成分差异很大 2-6。 根据蜂胶的植物来源, 已发现的蜂胶主要分为 5 种类型: 杨树属、酒神菊属、克鲁西属、血桐属和地 中海东部地区型。目前国内市场较常见的蜂胶, 主要 为杨树属型和酒神菊属型。 杨树属蜂胶的主要成分为 类黄酮类物质, 酒神菊属蜂胶以巴西东南部分布较 多, 俗称巴西绿蜂胶, 主要成分为异戊烯苯丙类, 如 阿替匹林 C 和咖啡酰奎尼酸。总黄酮类物质作为蜂 胶的主要有效成分, 发挥着重要的功效7-10。普通的 总黄酮测定方法, 不一定适用于蜂胶, 因此, 研究蜂 胶中总黄酮的最适宜的测定方法是非常必要的。 目前蜂胶中总黄酮的检测方法, 主要有分光光 第 9 期 杨亚飞, 等: 多种蜂胶中总黄酮检测方法的适用性研究 3709 度法和高效液相色谱法11-13。 高效液相色谱法检测的 是8种具体的黄酮类物质的含量, 由于蜂胶中黄酮类 物质组成复杂, 因此所检测结果并不代表总黄酮含 量。目前常用的总黄酮的检测方法为分光光度法, 共 有 3 种, 分别为 GB/T 20574-2006蜂胶中总黄酮含 量的测定方法 分光光度比色法 、 保健食品检验与 评价技术规范 2014 年版, 保健食品中总黄酮的测定 (征求意见稿方法)及 GB/T 24283-2014中华人民共 和国国家标准 蜂胶 (征求意见稿)中 5.3.3 蜂胶中总 黄酮含量测定。 但这3种方法之间检测结果差异较大, 故有必要对其进行分析验证, 确定出蜂胶中总黄酮 的最合适的检测方法。 2 材料与方法 2.1 方法及原理 本研究采用了目前测定总黄酮常用的 3 种方法, 分别为: 方法 1: GB/T 20574-2006蜂胶中总黄酮含量的 测定方法 分光光度比色法; 原理为样品中黄酮类 物质被乙醇溶解后, 同显色剂硝酸铝结合, 经滤纸过 滤后, 与芦丁标准系列直接比色。 方法 2: 保健食品检验与评价技术规范2014 年版, 保健食品中总黄酮的测定(征求意见稿方法); 原理为用热石油醚提取出杂质后, 以甲醇提取黄酮 类成分, 黄酮类成分可被亚硝酸钠还原, 与硝酸铝生 成络合物, 在氢氧化钠碱性条件下开环, 生成 2-羟基 查尔酮而使溶液显特征的橙红色, 采用分光光度法 在 510 nm 波长处测定吸光度。 方法 3: GB/T 24283-2014中华人民共和国国家 标准 蜂胶 (征求意见稿)中 5.3.3 蜂胶中总黄酮含量 测定。 原理为直接利用芦丁标准品的颜色进行比对定 量。不同来源、不同种类蜂胶中的总黄酮所构成的醇 类、酮类物质组成不相同, 会造成总黄酮显色与标准 系列芦丁的显色不一致。 2.2 仪器与试剂 高效液相色谱仪(1260, 美国安捷伦公司); 分光 光度计(UV-2450, 日本岛津公司)。 聚酰胺粉(100200 目, 国药集团); 无水乙醇、 95%乙醇、甲醇、硝酸铝、醋酸钾、氢氧化钠均为分 析纯, 国药生产; 芦丁标准品(中国药品生物制品检 定所生产, 含量测定用)。 2.3 试验样品 巴西绿蜂胶粉3个批次(141001、 141002、 140801), 巴西 Apis Flora Zndustrial e Comercial Leda 生产; 国 产蜂胶粉 3 个批次(141102、140402、140302), 杭州 天厨蜜源保健品有限公司生产。 2.4 参加验证单位 广州市宜健医学技术发展有限公司(LAB1)、中 国广州分析测试中心(LAB2)、汤臣倍健股份有限公 司(LAB3)。其中, 前两家单位已通过 CMAF 认证, LAB3 已通过 CNAS 认证。 2.5 研究方案 3 家实验室完全按照 3 种方法, 分别对国产蜂胶 粉和巴西绿蜂胶粉进行含量测定和回收率测定,对结 果进行比较和分析。结合原理考虑, 确定出蜂胶总黄 酮最适合的检测方法。 3 结果与讨论 3.1 方法 1 检测结果 方法 1 的检测结果见表 1。 表 1 方法 1 含量测定和回收率结果(n=3) Table 1 The result of the content determination and recovery by method 1 (n=3) 样品名称 批号 含量(g/100 g) 回收率(%) 巴西绿蜂胶粉 141001 9.14 99.7 141002 8.58 140801 9.34 国产蜂胶粉 141102 15.47 88.4 140402 15.54 140302 17.97 由表 1 可见, 巴西绿蜂胶粉的总黄酮回收率为 99.7%, 国产蜂胶粉的回收率为 88.4%, 巴西绿蜂胶 粉含量测定结果为 8.58%9.34%, 国产蜂胶粉含量 测定结果为 15.47%17.97%。 该方法对两种蜂胶粉回 收率都良好。 3.2 方法 2 检测结果 方法 2 的检测结果见表 2。 3710 食品安全质量检测学报 第 6 卷 表 2 方法 2 含量测定和回收率结果(n=3) Table 2 The result of the content determination and recovery by method 2 (n=3) 样品名称 批号 含量(g/100 g) 回收率(%) 巴西绿蜂胶粉 141001 6.52 84.9 141002 6.19 140801 5.85 国产蜂胶粉 141102 7.82 76.8 140402 10.03 140302 9.99 由表 2 可见, 巴西绿蜂胶粉的总黄酮回收率为 84.9%, 国产蜂胶粉的回收率为 76.8%, 巴西绿蜂胶 粉含量测定结果为 5.85%6.52%, 国产蜂胶粉含量 测定结果为 7.82%10.03%。该方法对国产蜂胶粉回 收率较方法 1 稍差。 3.3 方法 3 方法 3 的检测结果见表 3。 表 3 方法 3 含量测定和回收率结果(n=3) Table 3 The result of the content determination and recovery by method 3 (n=3) 样品名称 批号 含量(g/100 g) 回收率(%) 巴西绿蜂胶粉 141001 4.99 59.6 141002 5.18 140801 5.44 国产蜂胶粉 141102 14.39 90.7 140402 16.05 140302 16.15 由表 3 可见, 巴西绿蜂胶粉的总黄酮回收率为 59.6%, 对国产蜂胶粉的回收率为 90.7%, 巴西绿蜂 胶粉含量测定结果为 4.99%5.44%, 国产蜂胶粉含 量测定结果为 14.39%16.15%。 该方法对巴西绿蜂胶 粉的回收率很低, 表明该方法不适合于巴西绿蜂胶 粉的含量测定。 3.2 不同方法对同一样品检测结果对比与讨论 3.2.1 检测结果统计 由表 4 可见, 3 个实验室对 3 种方法的 RSD 在 0.9%12.5%, 说明 3 家实验室之间重复性均较好。 3 家 实验室对3种方法的含量测定结果趋势基本一致, 说明 3 种方法本身重复性较好。 但 3 种方法之间的结果差异 较大, RSD 为 24.2%31.2%, 说明这 3 种方法不能都准 确检测出蜂胶中总黄酮的含量。 因此, 有必要从 3 种方 法本身的原理、操作等方面去分析出产生偏差的原因, 并找出最适合蜂胶中总黄酮含量测定的方法。 3.2.2 讨 论 方法2从检验结果来看, 无论是对巴西绿蜂胶还 是国产蜂胶中的总黄酮, 检验结果总体较方法 1 偏 低。原因是方法 2 样品前处理时, 对样品需要用热石 油醚提取总黄酮中的醇类、酮类物质, 再将石油醚丢 弃。这样可能会使样品中的一些醇类、酮类物质溶解 到热石油醚中而被丢弃, 造成检测结果偏低。因此该 方法不适用于蜂胶中总黄酮的含量测定。 方法 3 对巴西绿蜂胶粉的回收率仅为 59.6%, 其 含量测定结果也明显低于其他2种方法; 国产蜂胶粉 回收率及含量测定结果, 均与方法 1 相近。从检验方 法分析, 其原理存在一定的问题。该方法是利用芦丁 标准系列的颜色进行比对定量的。不同来源、不同种 表 4 不同实验室对同一样品含量测定结果对比(n=3) Table 4 Comparison of results of the same sample in different laboratory (n=3) 样品名称 批号 含量(g/100 g) RSD(%) LAB1 LAB2 LAB3 方法 1 巴西绿蜂胶粉 8.12 9.17 9.02 6.5 国产蜂胶粉 13.30 16.37 16.33 11.5 方法 2 巴西绿蜂胶粉 4.73 -* 5.20 6.7 国产蜂胶粉 15.33 -* 15.53 0.9 方法 3 巴西绿蜂胶粉 7.81 6.53 6.19 12.5 国产蜂胶粉 10.69 8.47 9.28 11.9 * LAB2 因特殊原因没有参加方法 2 的含量测定。 第 9 期 杨亚飞, 等: 多种蜂胶中总黄酮检测方法的适用性研究 3711 类蜂胶中的总黄酮所构成的醇类、酮类物质组成不 相同, 会造成总黄酮显色与标准系列芦丁的显色不 一致。因此该方法检测蜂胶粉, 尤其是检测含芦丁 极少的巴西绿蜂胶粉中的总黄酮是不适用的。国产 蜂胶粉中, 芦丁含量较高, 因此国产蜂胶粉的回收 率和含量检测结果较高。可见, 该方法不适合于检 测所有的蜂胶总黄酮, 尤其是芦丁含量少的蜂胶, 如巴西绿蜂胶粉。 方法 1 原理是样品中黄酮类物质被乙醇溶解后, 同显色剂硝酸铝结合, 经滤纸过滤后, 与芦丁标准系 列直接比色。 该方法既避免了方法 3 直接与芦丁标准 系列比对, 又避免了方法 2 用热石油醚提取, 总黄酮 中的醇类、酮类物质随石油醚丢失的缺陷。该方法对 两种蜂胶的回收率都较高, 含量检测结果来看, 无论 是对巴西绿蜂胶粉和国产蜂胶粉, 该方法结果都较 为接近理论值。 该方法为国家标准化管理委员会颁布 的专门用于蜂胶中总黄酮含量测定的方法, 验证结 果也证明, 该方法最适合于检测所有的蜂胶总黄酮 的含量。 4 结 论 通过以上研究数据表明, 方法 2 和方法 3 的前处 理和原理上存在一定缺陷, 目前的方法使检验结果 偏低, 因此需要改进。方法 1 对样品的前处理方式更 加完善, 原理科学, 方法学验证结果表明回收率高, 对国产蜂胶粉和巴西绿蜂胶粉均适用。 该方法本身也 是国标, 因此建议蜂胶中总黄酮的测定方法, 首选 GB/T 20574-2006蜂胶中总黄酮含量的测定方法 分光光度法。 致谢: 本方法研究得到广东出入境检验检疫局 焦红教授的指导, 在此表示衷心感谢。 参考文献 1 郦金龙, 赵文婷, 王盼, 等. 蜂胶的研究应用进展J. 中国食 物与营养, 2011, 17(6): 2024. 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