大豆过敏原β-伴大豆球蛋白提取纯化工艺研究.pdf

134 食品安全导刊 2017年8月 T echnology 科技 科技文苑 大豆蛋白质是高品质植物蛋白质 来源，营养价值非常高 1-2。而大豆蛋 白却是一种主要的过敏原，其能引起 人体严重的过敏反应 3-4。大豆中约有 35%40%的蛋白， 以不同的沉降系数， 可分为 2S 球蛋白、7S 球蛋白、11S 球 蛋白和 15S 球蛋白 5-8。其中，7S 球 蛋白和 11S 球蛋白约占大豆蛋白质总 量的 70%9-10。 本实验以大豆中的 7S 球蛋白为研 究对象，设置不同的提取条件，通过 对目标蛋白的分离纯化，进行 SDS- PAGE 电泳分析。用电泳成像仪对结果 进行对比鉴定，建立快速高效提取大 豆过敏原蛋白的方法，为大豆过敏蛋 白的检测以及大豆过敏蛋白标准品的 制备，提供一定的基础性研究。 1 材料与方法 1.1 材料 实验材料与试剂：优质黄大豆、 丙酮、10% 过硫酸铵溶液、Tris-HCl 缓 冲液、十二烷基硫酸钠 (SDS)、- 巯 基乙醇和电泳凝胶制备试剂盒试剂等。 实验仪器：HJ-4A 型磁力搅拌器、 台式高速冷冻离心机、微型垂直电泳系 统、 凝胶电泳成像仪和多功能酶标仪等。 1.2 方法 1.2.1 大豆脱脂 粉碎机将大豆粉碎成粉末，过 60 目筛，收集过筛的大豆粉，4 保存。 大豆粉与丙酮溶液按15混合 （m/v） ， 磁力搅拌 1 h 后进行抽滤，收集固体， 重复上述步骤数次，直至上层液体无 色，4 离心取沉淀，-4 保存。 1.2.2 大豆蛋白浸提 控制浸提液浓度为 0.05 mol/L、 pH9.0、料液比 1 10，设置不同种类 提取液 ： PBS缓冲液和Tris-HCl缓冲液 ； 设置不同 pH：pH7.0、pH8.0、pH9.0、 pH10.0；设置不同浓度提取液：0.03、 0.05、0.10 mol/L 和 0.20 mol/L；设置 不同的料液比：1 10、1 15、1 18、1 20。提取率计算方法为：提 取率 = 大豆提取蛋白质量 / 脱脂大豆 蛋白粉质量 100%。 1.2.3 SDS-PAGE 分析 建立蛋白浓度标准曲线，检测样 品中的蛋白浓度，并将大豆蛋白样品 于 PBS 溶液中进行聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE）分析。 1.2.4 大豆致敏蛋白纯化和分析 将样品封装于透析袋（36 mm）中， 透析 24 h 后 , 浓缩干燥，进行 SDS- PAGE 分析。采用考马斯亮蓝 G250 法测 定目标蛋白浓度。 2 结果分析 2.1 单因素对大豆致敏蛋白浸提的影响 由图 1（A）可知，Tris-HCl 缓冲 液的提取率都高于 PBS 缓冲液的提取 率，故选用 Tris-HCl 缓冲液为提取液； 由图1 （B） 可知， 料液比为118时， 能够提取大部分的球蛋白，故选取料 液比 1 18 作为最佳提取料液比；由 图 1（C）可知，当 Tris-HCl 提取液浓 度为 0.1 mol/L 时，7S 伴大豆球蛋白的 提取率最高，最终选取 0.1 mol/L 为最 佳提取浓度；由图 1（D）可知，pH9.0 时提取率最高。最终选取 pH9.0 为最佳 提取 pH。 2.2 大豆蛋白的纯化 由图 2 可以发现，与 Marker 相对 大豆过敏原 - 伴大豆球蛋白提取纯化工艺研究 蒋栋磊 葛攀玮 俞程凯 郭 伟 葛庆丰 方维明 扬州大学 食品科学与工程学院 摘 要：大豆蛋白具有丰富的营养价值，而其致敏性却给大豆敏感人 群带来了极大的危害。其中 7S 伴大豆球蛋白是一种主要过敏原。本实验采 用碱溶酸沉法从大豆中分离纯化出 - 伴大豆球蛋白（7S 伴大豆球蛋白）。 通过设置浓度、料液比、pH、提取液的单因素对比实验，研究对大豆球蛋 白提取的影响，并用十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 对提取的 7S 伴大豆球蛋白进行了纯度分析。结果显示，使用 pH9.0、浓度 为 0.10 mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液在料液比 1 18 的条件下，7S 伴大豆球 蛋白提取率为 47%。 关键词：大豆蛋白；分离纯化；正交试验 Aug. 2017 CHINA FOOD SAFETY 135 科技文苑 比较，7S 球蛋白经纯化后，杂蛋白被 除去，只留下 7S 球蛋白的主要蛋白含 量 Gly m Bd 30K，可知纯化成功。 2.3 大豆致敏蛋白含量测定结果 建 立 蛋 白 标 准 曲 线：y=0.020 5x+0.147 6，其中，R2=0.991 8。经纯 化透析后的 7S 球蛋白约 16 mL，并测 定其 OD 值为 0.17，计算得纯化后的蛋 白含量为 1.1 mg/mL，获得 7S 球蛋白 总量为 17.6 mg。 3 结论 依据单因素对比实验及正交试验， 最终确定提取大豆致敏蛋白的最佳条 件，并经过 SDS-PAGE 验证鉴定。最佳 提取条件为：提取液浓度 pH9.0、提取 液浓度 0.10 mol/L、Tris-HCl 缓冲液、 料液比 1 18。通过最佳工艺提取出 来的蛋白样品，此条件下可获得含量 为 1.1 mg/mL 的 7S 球蛋白。 参考文献 1 乔娟 . 中国大豆国际竞争力研 究 D. 北京 : 中国农业科学院 ,2004. 2 朱婷 . 大豆过敏原的生物去除 D. 无锡 : 江南大学 ,2013. 3Lehrer S B, Horner W E, Reese G. When are proteins allergic Implications for biotechnologyJ. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1996(6):553-564. 4李姣,张施敬,佘之蕴,等.乳 铁蛋白纯化和检测方法研究进展 J. 广东化工 ,2014(14):123-124. 5 杨伟强 , 李鹏 , 袁涛 , 等 . 从 花生蛋白粉中提取花生分离蛋白的条 件优化 J. 中国油脂 ,2009(1):34-37. 6 张宇昊 , 王强 . 花生蛋白的开 发与利用 J. 花生学报 ,2005(4):12- 16. 7 S a m p s o n H A . U p d a t e on food allergyJ.J Allergy Clin Immunol,2004(5):805-819. 8周大寨,朱玉昌,周毅锋,等.芸 豆蛋白质的提取及超滤分离研究 J. 食品科学 ,2008(8):386-390. 9 马丽 , 潘宁玲 , 马亚群 . 手术 中严重药物过敏反应的诊断和处理 J. 医学综述 ,2014(24):4608-4609. 10Thanh V H, Shibasaki K. Beta- conglycinin from soybean proteins. Isolation and immunological and physicochemical properties of the monomeric formsJ. Biochimica et biophysica acta,1977(2):370. 基金项目：国家自然科学基金面上 科学基金项目（编号：31271945）； 国家自然科学基金青年科学基金项目 （编号：31601535）；江苏省自然科 学基金青年基金项目（编号：BK20 160459）；江苏省高校自然科学研究 面上项目（编号：16KJB550008）；扬 州市社会发展前瞻性研究项目（编号： YZ2014177）。 作者简介：蒋栋磊（1986），男， 江苏无锡人，博士，讲师。研究方向： 食品安全检测