蛋白质的研究历史与方法SHL.ppt

基因(gene)基因组(genome)基因组学(genomics),蛋白质(protein)蛋白质组(proteome)蛋白质组学(proteomics),1937年，A.W.k.Tiselius建立了研究蛋白质的移动界面电泳(electrophoresis)方法,于1948年获诺贝尔化学奖,1941年，A.J.P.Martin和R.L.M.Synge建立了分配层析(partitionchromatography)技术，被授予1952年的诺贝尔化学奖,1953年，F.Sanger利用纸层析和纸电泳技术第一次揭示出牛胰岛素的一级结构，开创了以后数千种蛋白质序列分析的先声，被授予1958年的诺贝尔化学奖,TheNobelPrizeinChemistry1958,forhisworkonthestructureofproteins,especiallythatofinsulin,FrederickSanger,UniversityofCambridgeCambridge,UnitedKingdom,1918-,TheNobelPrizeinChemistry1954,LinusPauling量子化学家（1901-1994）,40年代中期以后提出纤维状蛋白质的螺旋结构，及蛋白质是具有多肽链结构的物质，打开了通往蛋白质与DNA分子奥秘的大门。,两次荣获诺贝尔奖金（1954年化学奖，1962年和平奖）,J.C.Kendrew(1958)及M.F.Perutz(1960)利用X射线技术解析了肌红蛋白(myoglobin)和血红蛋白(hemoglobin)的三维结构，使人们第一次能够洞察生物大分子的空间结构，他们共同赢得了1962年的诺贝尔化学奖,伦琴Rntgen劳厄Laue布拉格父子Bragg.,20世纪50年代末，E.H.Fischer和E.G.Krebs在研究糖原磷酸化酶作用机制的时候，发现可逆磷酸化修饰是一种广泛存在的蛋白质分子活性调节机制，获得1992年的诺贝尔生理医学奖,20世纪70年代中后期，GunterBlobel利用体外蛋白质翻译系统发现动物细胞中很多分泌蛋白的跨膜方式，提出“信号假说”(signalhypothesis)，获得了1998年的诺贝尔生理医学奖,20世纪50年代后期，E.W.Sutherland发现细胞内cAMP的存在，1971年被授予诺贝尔生理医学奖70年代末80年代初，A.G.Gilman和M.Rodbell独立发现G蛋白的存在，因此二人在1994年获得诺贝尔生理医学奖,“信号转导”(signaltransduction),Summary(1),分离纯化蛋白质,测定蛋白质分子质量,蛋白质结构分析,蛋白质生物学活性分析,探索结构与功能的关系,Summary(2),学科交叉,生物化学与分子生物学是一门实践性、应用性强的学科,生化方法学是在不断发展的,第二节蛋白质样品的提取,目的蛋白的获取,直接从生物体内获取,基因工程表达重组蛋白,采用免疫学方法获取相关抗体,获取蛋白质的编码序列(cDNA),基因组测序,基因组测序进行推导,获取部分肽段氨基酸序列,经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成：,清洗组织或细胞,裂解细胞,离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质,离心、层析、电泳等进一步纯化,获取产物蛋白,一、细胞的破碎,各种组织和细胞的常用破碎方法,细胞破碎方法组织种类,旋刀式匀浆大多数动、植物组织手动式匀浆柔软的动物组织高压匀浆细菌、酵母、植物细胞研磨细菌、植物细胞高速珠磨细胞混悬液酶溶细菌、酵母去垢剂渗透组织培养细胞有机溶剂渗透细菌、酵母超声破碎细胞混悬液低渗裂解红细胞、细菌冻融裂解培养细胞,有时细胞破碎后，某些蛋白质并不能被释放进入溶液，在细菌中形成包涵体(inclusionbody)蛋白,包涵体的成份：,包涵体的形成原因：,表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度聚集在一起形成的不溶物,表达蛋白非天然形式的混合物,分离纯化细菌包涵体蛋白的基本步骤：,破碎细胞,分离包涵体,溶解包涵体,蛋白质产物的构型复原,防止包涵体形成：,降低细胞生长温度,共表达分子伴侣,改变渗透压,融合蛋白,二、去污剂处理溶解膜蛋白,去污剂为双极性(amphipathic)脂类分子，可在水中溶解。通常由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成,SDS,TritonX-100,NP-40,Tween-20,三、蛋白质分子的稳定,在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解,PMSF(35ug/ml),EDTA(0.3mg/ml),Pepstatin(0.7ug/ml),Leupeptin(0.5ug/ml),Aprotinin,目的：保证蛋白质的生物活性,细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活性，如巯基蛋白,常用的还原剂抗坏血酸巯基乙醇(mercaptoethanol)二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),蛋白质的环境因素,表面效应,温度,储存,四、离心去除细胞碎片,五、目标蛋白的纯化,1.盐析(saltingout),2.离子交换层析,3.凝胶过滤层析,4.亲和层析,第三节蛋白质的检测和鉴定,光谱学特性,190200nm,230300nm,电泳检测,SDS-PAGE,IEF,分子量测定,排阻层析,沉降平衡超速离心,动态弹性光散射,孔径梯度电泳,质谱,氨基酸序列测定,用抗体检测蛋白质,Westernblotting,免疫共