番茄microRNA Sly-mir156a和Sly-mir169c的功能鉴定-硕士论文

分类号： 番茄m i c F u n c t i o n a la n a l y s i so fm i c r o R N A S l y - m i r l 5 6 aa n dS l y - m i r l 6 9 c i nt o m a t o 研究生：邹哲 指导教师：叶志彪教授 指导小组：叶志彪教授 李汉霞教授 张俊红副教授 张余洋副教授 王涛涛副教授 专业：蔬菜学研究方向：蔬菜分子生物学及生物技术 获得学位名称：农学硕士学位授予日期：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学园艺林学学院 作物遗传改良国家重点实验室园艺植物生物学教育部重点实验室 二。一。年六月 _ 1 I 删JJfIfJIfIfJIIJJf|fI舢 Y 17 9 9 7 9 8 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 不 如需保密，解密时间年 月日 是否保密 占 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生张帮哲 帆加年6 月 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 靴做储样：铲 翩摊：彬 签名日期：如p 年6 月f o 日 签名日期：庐盯。年 歹月f 口日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 1 3 2 植物与动物m i c r o R N A 的区别5 1 3 3 植物m i c r o R N A 的特点6 1 4 有关m i c r o R N A 的研究方法6 1 4 1 直接克隆的方法6 1 4 2 正向遗传筛选法6 1 4 3 生物信息学7 1 4 4 其他方法7 1 5 植物m i c r o R N A 的生物学功能8 1 5 1 植物m i c r o R N A 与生长发育的关系8 1 5 2 植物m i c r o R N A 与逆境的关系1 0 1 6 本研究的内容和目的1 l 2 材料与方法13 2 1 植物材料13 2 2 菌株、质粒及试剂1 3 2 2 1 菌株及质粒13 2 2 2 相关试剂13 2 3 引物序列及相关信息1 3 2 4 目的基因的扩增1 4 2 4 1S l y - m i r l 5 6 a 片段的获得1 4 2 4 2S l y m i r l 6 9 c 片段的获得1 5 2 5P C R 产物的回收及纯化15 2 6T A 克隆l6 2 6 1 纯化目的片段与p M D l 8 T 载体的重组连接1 6 2 6 2 重组体的转化与筛选。1 6 2 6 3 重组质粒转化鉴定与测序分析1 6 2 7 植物表达载体的构建1 7 2 7 1 目的片段的双酶切( S a cI 和S a l ，) 1 7 2 7 2p M V 表达载体的双酶切( S a c ，和X h o ，) l8 l y - m i r l 5 6 a 和s l y - m i r l 6 9 c 的功能鉴定 的连接18 2 7 4 连接产物转化大肠杆菌18 2 8 遗传转化1 9 2 9 番茄转化再生植株的P C R 阳性检测。2 0 2 1 0 番茄转化再生植株的S o u t h e r n 杂交检测。2 0 2 10 1 酶切2 0 2 1O 2 凝胶处理2 0 2 1 0 3 印迹2 0 2 10 4 杂交2 l 2 1 0 5 洗膜及检测2 1 2 1 1 目的基因表达量的检测2 2 2 1 2m i c r o R N A 预测靶基因组织表达量的检测2 2 2 1 3 转基因植株功能鉴定2 3 2 1 3 1 转S l y - m i r l 5 6 a 基因植株表型观察2 3 2 1 3 2 转S l y m i r l 6 9 c 基因植株苗期抗逆性实验2 3 2 1 3 2 1 耐旱性实验2 3 2 1 3 2 2 耐盐性实验2 3 2 1 3 2 3 气孔开度及气孔导度测定。2 3 3 结果与分析2 4 3 1S l y m i r l 5 6 a 及S l y m i r l 6 9 c 的克隆。2 4 3 2 表达载体的构建2 6 3 3 转基因植株的获得2 7 3 4 转基因植株的P C R 检测2 7 3 5 转基因植株的S o u t h e r n 杂交检测2 8 3 6 目的基因表达量的检测3 0 3 7m i c r o R N A 靶基因组织表达量的检测。3 1 3 8S l y - m i r l 5 6 a 转基因植株T l 代植株表型观察。3 4 3 9S l y m i r l 6 9 c 转基因植株抗逆性检测。3 6 3 9 1 耐旱性检测3 6 3 9 2 耐盐性检测3 7 3 9 3 气孔观察。3 9 4 讨论4 1 4 1 超量表达m i c r o R N A 研究其功能4 l 4 2m i R l5 6 与番茄生长发育的关系4 2 4 3m i R l 6 9 与番茄非生物逆境应答的关系4 3 参考文献4 5 致谢5 3 附录5 4 摘要 番茄是重要的蔬菜作物，其遗传改良的重要途径就是寻找并利用能够调节植物发 育，包括株高、叶片数等重要园艺性状的基因和对环境适应，包括干旱、低温等非生 物逆境适应的基因，m i c r o R N A 就属于这类基因。 m i c r o R N A 是广泛存在于真核生物中的重要的调节因子，在植物和动物中的研究 发现其功能是多样的，且在生物体内有着很重要的调节功能，包括生长发育、逆境应 答、激素反应和病毒诱导等众多方面。 本研究以番茄作为材料，根据前人研究从m i c r o R N A 数据库中选取了番茄 m i c r o R N A 家族中S l y - m i r l 5 6 a 和S l y m i r l 6 9 c 这两个m i R N A ，分别构建其超量表达载 体并转入番茄中，分析它们在番茄中的功能，并借助生物信息学的手段预测它们在番 茄中的靶基因，分析了预测所得靶基因在相应条件下的表达情况，期望能够获得有应 用价值的m i c r o R N A 信息。研究获得的主要结果如下： 1 克隆了从数据库中选取的番茄两个m i c r o R N A 前体基因，并构建了相应的超 量表达载体； 2 通过农杆菌介导的转基因技术，将上述构建的两个表达载体转入番茄中，获 得转基因番茄植株，并通过了P C R 及S o u t h e r n 杂交验证，证实目的基因整合 到番茄基因组； 3 利用R T - P C R 技术验证了目的基因的超量表达； 4 通过对S l y - m i r l 5 6 a 转基因T l 代株系的观察，得到区别于对照的相应表型， 转基因植株表现出矮小、叶片变多变小、节间缩短等特征，利用r e a l t i m eP C R 技术分析了其不同靶基因在不同组织中的表达情况，为番茄园艺性状特别是 形态建成的遗传改良提供了依据； 5 将S l y m i r l 6 9 c 转基因T l 代株系进行干旱及盐逆境的胁迫处理，转基因株系 与对照表现出不同反应，前者表现出对上述非生物逆境良好的抵抗能力。对 转基因和对照植株的气孔进行了观察，发现转基因株系的气孔大小和气孔导 度相比对照有显著降低，说明S l y - m i r l 6 9 c 通过调控气孔的开关降低水分的蒸 腾从而提高植物的抗旱能力。同样也利用r e a l t i m eP C R 技术分析了其不同靶 基因在不同组织中及相关逆境下的表达情况，为S l y - m i r l 6 9 c 在逆境下的分子 调控网络研究提供了初步的证据。 关键词：m i c r o R N A ，m i r l 5 6 ，m i r l 6 9 ，发育，非生物逆境，番茄 A b s t r a c t T o m a t oi sa ni m p o r t a n t c r o p c u l t i v a t e d w i d e l yi nt h ew o r l d E x p l o i t a t i o no f a g r o n o m i c a l l yi m p o r t a n tg e n e sw h i c hr e g u l a t et r a i t s ，s u c h2 u sp l a n t h e i g h t ，l e a fn u m b e r , a n d a d a p tt oe n v i r o n m e n t a ls t r e s ss u c h 硒d r o u g h t ，s a l ta n dc o l ds t r e s si s c r u c i a lf o rt o m a t o g e n e t i ci m p r o v e m e n t M i c r o R N A i ss u c hac a s e M i c r o R N Ai sw i d e l yf o u n di ne u k a r y o t i co r g a n i s m s I tp l a y si m p o r t a n tr o l e si n v a r i o u sb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gd e v e l o p m e n t ，s t r e s sa n dh o r m o n er e s p o n s e ，e t c I nt h i ss t u d y , S l y - m i r l5 6 aa n dS l y - m i r l6 9 cf r o mm i R B a s e ，w h i c hr e p r e s e n tt w o d i f f e r e n tm e m b e r so ft o m a t om i R N A sf a m i l y , w e r es e l e c t e da n dc l o n e d O v e r e x p r e s s i n g v e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e da n di n t r o d u c e di n t ot o m a t og e n o m e T h i ss t u d ya i m st o c h a r a c t e r i z et h e i rf u n c t i o ni nt o m a t o P u t a t i v et a r g e t so ft h em i c r o R N A sw e r ep r e d i c t e d u s i n gb i o i n f o r m a t i ct o o la n dt h e i rt i s s u ee x p r e s s i o np r o f i l ea s w e l l 嬲t h e i re x p r e s s i o n p a t t e r nu n d e rd r o u g h ta n ds a l tt r e a t m e n t sw e r ei n v e s t i g a t e d T h em a i nr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 T h em i c r o R N Ap r e c u r s o rg e n e so fS l y - m i r l5 6 aa n dS l y - m i r l6 9 cw e r ec l o n e d f r o mt o m a t og e n o m ea n dt h e i ro v e r e x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e da n d i n t r o d u c e di n t ot o m a t ov i aA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 2 T h et r a n s g e n i ct o m a t op l a n t sw e r eo b t a i n e d P C Ra n dS o u t h e r nb l o ta n a l y s i s s h o w e dt h a tt h et r a n s g e n e sw e r ei n t e g r a t e di n t ot h et o m a t og e n o m e 3 R T - P C Ra n a l y s i ss h o w e dt h et r a n s g e n e sw e r eo v e r e x p r e s s e di nt r a n s g e n i cp l a n t s 4 O v e r e x p r e s s i o no fS l y m i r l5 6 ai nt r a n s g e n i ct o m a t op l a n t sr e s u l t e di nd w a r f i s m ， s h o r t e ri n t e r n o d e ，s m a l l e ra n dm o r el e a v e s ，s u g g e s t i n gi t se n r o l l m e n ti nv a r i o u s d e v e l o p m e n t a lp r o c e s s e s Q u a n t i t a t i v eR T - P C RW a Sc o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t et h e t i s s u ee x p r e s s i o no ft h ep u t a t i v et a r g e tg e n e s T h er e s u l t sp r o v i d e de v i d e n c e so f t h er o l eo fS l y - m i r l5 6 ai nt o m a t op l a n ta r c h i t e c t u r e 5 T r a n s g e n i cp l a n t so v e r - e x p r e s s i n gS l y m i r l6 9 cw e r em o r er e s i s t a n tt od r o u g h ta n d s a l ts t r e s st h a nw i l d - t y p ep l a n t s T h es t o m a t a la p e r t u r ea n ds t o m a t ac o n d u c t a n c e w e r es i g n i f i c a n t l yr e d u c e di nt r a n s g e n i cp l a n t s ，w h i c hw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h e d r o u g h tt o l e r a n c ep e r f o r m a n c e T i s s u ee x p r e s s i o no fp u t a t i v et a r g e tg e n e sW a S m o n i t e r e du s i n gQ u a n t i t a t i v eR T - P C R T h er e s u l t sp r o v i d e de v i d e n c e so ft h er o l e o fS l y - m i r l6 9 ci ns t r e s st o l e r a n c eo ft o m a t o K e yw o r d s ：m i c r o R N A , m i r l5 6 ，m i r l6 9 ，d e v e l o p m e n t , a b i o t i cs t r e s s ，t o m a t o 1 前言 1 1 课题的提出 生物体内小分子R N A 自上世纪8 0 年代末被科学家们发现以来，人们相继在许多 真核模式生物中找到一系列有功能的非编码小分子R N A ，这些小分子R N A 的发现极 大地拓展了人们对分子生物学的认识和了解，同时也为人们的研究提供了一个新的方 法和途径。近些年来，人们还相继在生物体内发现了l s i R N A ( 1 0 n gs h o r ti n t e r f e r e n c e R N A ) 、p i R N A ( P I W I i m e r a c t i n gR N A ) 、N A T - s i R N A ( n a t u r a la n t i s e n s e t r a n s c r i p ts i R N A ) 和t a s i R N A ( t r a n s a c t i n gs i R N A ) 等众多具有不同调节功能的小分子R N A ，在调节不 同生物的环境应答和生长发育等过程中发挥着不可忽视的关键作用。m i c r o R N A s ( m i R N A s ) 是一类在进化上高度保守的内源非编码小分子R N A ，长度大约为2 1 个 核苷酸( A m b r o s ，2 0 0 1 ) 。它们通过与目标靶基因互补配对使转录受到抑制或靶基因 降解等的方式在转录后的调节方面起着重要的作用( B a r t e l ，2 0 0 4 ) 。 随着m i c r o R N A s 的发现和研究的不断深入，m i c r o R N A s 在生物体内的功能和作 用逐渐被人们所了解。虽然m i c r o R N A s 在进化上具有高度的保守性，但其在不同物 种中的功能仍有所不同，其在功能和基因组织形式等多方面存在着多样性。对m i R N A 的研究为进一步认识生物中遗传信息表达的R N A 调控网络及其分子机制奠定基础。 目前在植物上研究较多的物种主要是拟南芥和水稻，同时也为其他物种的研究提供了 重要的参考价值。 番茄是在世界上广为栽培的园艺作物，同时也是我国重要的蔬菜栽培作物，在农 业生产和人民生活中都占有极其重要的地位。数据资料显示，2 0 0 7 年我国番茄的产 量达到约3 3 5 9 百万吨，排名世界第一，美国与印度分别排名第二和第三，产量分别 为1 4 1 8 百万吨和1 0 0 5 百万吨( h t t p ：f a o s t a t f a o o r g ) 。同时番茄也是植物基因组研究 的重要模式生物之一。随着分子生物学技术和基因组学技术的发展，现代生物技术也 开始广泛应用于番茄等园艺作物的遗传改良。在这场利用现代生物技术进行植物遗传 改良的革命中，发掘、寻找并利用新的遗传资源是关键。 作为植物生长发育重要的调节因子，m i c r o R N A 自从被发现以来，就是科学家们 的研究热点。通过对番茄m i R N A 的研究，一方面可以丰富现有植物m i R N A 研究的 深度和广度，另一方面也为我们在番茄上寻找新的遗传资源提供了一条新的途径，拓 宽番茄生物研究的领域，从而将新的遗传资源应用于遗传改良实践中。因而对番茄 m i c r o R N A 的研究有着非常重要的生物学理论意义和生产实践意义。 5 6 a 和s l y - m i r l 6 9 c 的功能鉴定 1 2 1m i c r o R N A 的发现 r n i c r o R N A 最早是在线虫中发现的。上世纪的9 0 年代，人们利用遗传筛选的方 法在线虫中发现了一个2 2 n t 的非编码的小分子R N A m l i n - 4 ( L e ee ta 1 ，1 9 9 3 ；M o s se t a 1 。1 9 9 7 ) 。L n 一4 是控制线虫幼虫发育时期的关键调节因子，f i n - 4 基因突变后，线虫 只能停留在幼虫的L 1 期，而不能发育为成虫。随后，在发现l i n 4 的7 年之后，人们 又在线虫中发现了类似于l i n 4 的基因l e t - 7 ( R e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ) ，同样也是利用遗传 筛选的方法。L e t - 7 编码一个临时性的2 I n t 的小分子R N A ，控制线虫从幼虫的L 4 期 向成虫期的过渡发育。这两个基因的R N A 与平常意义上编码蛋白的m R N A 有所不同， 后者具备蛋白编码区，而这两个基因的R N A 不具备蛋白编码区，转录得到的分子产 物衍生为8 0 l O O n t t 及2 0 n t 长的两个R N A 小分子。这个转录产物含有一段可以折叠的 二级结构，2 0 n t 的小R N A 分子就位于该区域。 2 0 0 1 年，世界上不同的3 个研究小组分别在线虫、果蝇及人类中发现了大量的 类似于l i n 4 和l e t - 7 的小R N A 分子( L a g o s - Q u i n t a n ae ta 1 ，2 0 0 1 ；L a ue ta 1 ，2 0 0 1 ；L e e a n dA m b r o s ，2 0 0 1 ) ，这类小分子R N A 除了在生物体的发育时期起调节作用，同时还 在不同的组织器官中表达，起着调节生物体生理代谢等方面的作用。科学家们由此判 断，这些小分子R N A 可能是高等生物中普遍存在的一类具有调节功能的分子，并将 这类小分子命名为m i c r o R N A ，也就是m i R N A 。 自第一个m i R N A 发现后的第十年，植物上的m i R N A s 才第一次被发现。2 0 0 2 年， 科学家们通过在拟南芥中克隆小分子R N A s 发现植物中也存在m i R N A s ( R e i n h a r te ta 1 ， 2 0 0 2 ；L l a v ee ta 1 ，2 0 0 2 ；P a r ke ta 1 ，2 0 0 2 ) 。m i R N A s 同时存在于植物和动物界，这表明 这一类非编码小分子R N A s 广泛存在于真核生物中，且极可能出现在真核生物进化的 早期阶段。 1 2 2m i c r o R N A 的命名 2 0 0 3 年，A m b r o s 等人推出了一个m i c r o R N A s 注册数据库，即m i R b a s e ( h t t p ：m i c r o r n a s a n g e r a c u k 一之后更名为h t t p ：w w w m i r b a s e o r g ) ( A m b r o s e ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。该数据库包含已发表的m i c r o R N A 基因及其家族成员的序列、前体等相关信 息( G r i t i i t h s J o n e s ，2 0 0 4 ) 。由于大量的m i c r o R N A 被发现，为统一其命名及管理，科 学家们给m i R N A 的命名制定了统一详细的规贝l J ( A m b r o se ta 1 ，2 0 0 3 ；G r i f f i t h s - J o n e se t a 1 ，2 0 0 4 ；Z h a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 2 番茄m i c r o R N As l y - m i r l 5 6 a 和s l y - m i r l 6 9 c 的功能鉴定 ( 1 ) m i c r o R N A 前体简写为m i r - N o ，而成熟的m i c r o R N A 则用m i R - N o 表示。例如， 线虫的m i R - 2 ，拟南芥的m i R l 6 9 ( 注：植物的m i R N A 不用连字符号) 。同时相 对应的基因则根据传统习惯用斜体表示，例如m R 2 ，m i R l 6 9 。 ( 2 ) 不同物种中序列相同或者几乎相同的直系同源的m i R N A 用相同的数字来给 其命名。例如番茄和水稻的m i R l 5 6 ，虽然存在两个核苷酸的差异，但是两者均 用m i R l 5 6 表示。其后面的数字由m i R B a s e 根据文章被接收发表后，按顺序指派。 ( 3 ) 不同物种间相同的m i c r o R N A 则采用在该m i c r o R N A 名称之前加上该物种名 称的办法加以区别。例如番茄和水稻的m i R l 5 6 分别用s l y - m i R l 5 6 和o s a - m i R l 5 6 来表示。 ( 4 ) 如果发现相同物种中同一基因家族成员的成熟m i c r o R N A 序列完全相同或是 存在1 2 个少数碱基的差异，则通过在数字后面加上字母等后缀的方法区分。例 如番茄的m i R l 5 6 基因家族中有三个成员，则分别记为s l y m i R l 5 6 a 、s l y m i R l 5 6 b 和s l y m i R l 5 6 e 。而如果m i c r o R N A 为多基因拷贝，则在其后面加上数字后缀。 ( 5 ) 针对相同的一个m i c r o R N A 前体的两条臂分别产生同一个m i c r o R N A 的情况， 是根据克隆实验的结果加以判断，在次要的成熟产物后面用”来区分主要的 成熟产物和次要的成熟产物；若无法区分主要的和次要的成熟产物，则在名称后 面a n 上“3 p ”或“5 p ”的后缀。3 p 表示成熟产物位于前体的3 端，5 p 表示成熟 产物位于前体的5 端。 根据最新的数据库显示( 截止于2 0 1 0 年4 月3 日) ，拟南芥中已注册了1 9 0 个 m i R N A ，水稻中有4 1 4 个，玉米中有1 0 9 个，番茄中有3 0 个，其余还有甘蓝、芜菁、 番木瓜等植物m i R N A 的相关信息( h t t p ：w w w m i r b a s e o r g c g i - b i n b r o w s e p 1 ) 。 1 3m i c r o R N A 的生物合成与特点 1 3 1m i c r o R N A 的生物合成 了解m i c r o R N A 生物合成的过程对研究这一类对生物体起着重要调控作用的小 分子物质有着十分重要的意义。 m i c r o R N A 在植物和动物中的合成途径是不同的。动物m i c r o R N A 生物合成需要 两个步骤。首先，初级m i c r o R N A 转录本( p r i m i R N A ) 在细胞核中被R N A s e I I ID r o s h a 剪切生成短的茎环结构的R N A ( p r e m i R N A ) ( L e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这一剪切确定了 m i R N A m i R N A 复合体一端的位置。然后E x p o r t i n - 5 转运载体将p r e m i R N A 从细胞核 运到细胞质中( B o h n s a c ke ta 1 ，2 0 0 4 ；Y ie ta 1 ，2 0 0 3 ；L u n de ta 1 ，2 0 0 3 ) ，在D i c e r 酶的 功能鉴定 该复合体包含成熟的m i I A 作用下产生成熟的m i P 啉A 单 体，然后其进入R I S C 复合体( R N A i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，I U S C ) ，即R N A 介导 的沉默复合体。成熟m i R N A 通过与靶基因3 - U T R 的碱基互补配对而发挥基因表达 调控作用。 王n m u e c t h 。一y l l l t i o 婶n 。& n p r i - m i R N A p r e _ m i R N A m i R N A m i R N A d u p l e ： l C l e m m g eo rt r a n s l a t i o n a li n h i b i t i o no f N A 广弋 m p m e md i l l o m l i t r l 图l 植物中m i c r o R N A 的形成过程( Z h ue ta 1 ，2 0 0 8 ) F i g 1P l a n tm i R N Ab i o g e n e s i s ( Z h ue ta 1 ，2 0 0 8 ) 植物m i c r o R N A 的生物合成最早是从对拟南芥突变体一系列功能特征的研究中 了解的。事实上，每一个受到m i R N A 生物合成和功能影响的突变体最初都是通过正 向遗传学的方法得到确认的，而这些又是基于突变体出现了形态异常的表现。 植物m i R N A 的前体与动物的有所不同，动物前体的二级结构区别不大，而植物 前体在长度和次级结构上都表现出比较大的差异。这些差异可能反映出这些m i R N A 前体与动物相比存在被识别和加工的不同分子机制。R N A 聚合酶I I 将m i R N A 基因转 录形成长度为几百个核昔酸的p r i m i R N A ，其具备和m R N A 一样的结构( L e ee t a 1 ， 4 番茄m i c r o R N A s l y - m i r l 5 6 a 和s l y - m i r l 6 9 c 的功能鉴定 2 0 0 4 ) 。然后p r i m i R N A 被D C L I 酶( D i c e r L i k e l ) 切割成为p r e m i R N A ，p r e m i R N A 具有茎环结构，且其5 端含有磷酸基，3 端含有二核苷酸突出( o v e r h a n g ) ( Z h a n g e t a 1 ，2 0 0 6 ；B a r t e le ta 1 ，2 0 0 4 ) 。随后，在细胞核内，D C L I 酶将p r e m i R N A 切割成为 m i R N A m i R N A 复合体结构。该复合体在细胞内稳定性很低，需要甲基转移酶H E N l ( H U A E N 乩州C E R l ) 将这个复合体进行5 端的甲基化处理，防止R N A 尿嘧啶化而 降解( Y ue ta 1 ，2 0 0 5 ) ，同时这个处理也是为了便于后面的识别。转运蛋白H A S T Y 和R A N l 复合体识别m i R N A m i R N A * 复合体上的甲基化信号和3 端二核苷酸突出 ( o v e r h a n g ) 信号，将复合体从细胞核转运进入细胞质。在细胞质中，m i R N A m i R N A * 复合体在解旋酶的作用下形成成熟的单链m i R N A ，m i R N A 与A G 0 1 ( A R G o N A U T E l ) 等蛋白组装成为m i R N A - R I S C 复合体。细胞质中m i R N A 的浓度远远高于m i R N A * ， 这表明R I S C 具有保护m i R N A 的作用，m i R N A R I S C 复合体可对靶基因进行调控， 而m i R N A * 则在细胞质中被降解了。 1 3 2 植物与动物m i c r o R N A 的区别 植物与动物m i c r o R N A 生成过程有所不同，导致其结构功能等方面也存在着区 别。 ( 1 ) 植物m i c r o R N A 没有动物保守。通常情况下，植物中只有成熟m i R N A 较为保 守，而动物中m i R N A 的前体也较为保守( B a r t e le ta 1 ，2 0 0 4 ) ： ( 2 ) D i c e r - l i k e l ( D C L l ) 蛋白剪切植物中的初级m i R N A ，生成6 0 3 0 0 n t 的m i R N A 前体( K u r i h a r ae ta 1 ，2 0 0 4 ；X i ee ta 1 ，2 0 0 4 ) ，动物中的初级m i R N A 的剪切是由 D I C E R 家族的成员D r o s h a 完成的，生成6 0 7 0 n t 的m i R N A 前体( L e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ； ( 3 ) D C L l 在细胞核中将植物m i R N A 前体剪切成为m i R N A m i R N A * 复合体( P a p p e t a 1 ，2 0 0 3 ) ，而动物中，则是D i c e r 在细胞质中将m i R N A 前体剪切成m i R N A m i R N A * 复合体( B e m s t e i ne ta 1 ，2 0 0 1 ) ； ( 4 ) 动物中m i R N A m i R N A 复合体是由E x p o r t i n 5 运送出细胞核( Y i e ta 1 ，2 0 0 3 ) ， 而植物中是由E x p o r t i n 5 同源物H A S T Y ( H S T ) 来完成这一任务的( L u n de ta 1 ， 2 0 0 4 ) ： ( 5 ) 动物中的m i R N A s 通常通过与3 非翻译区的不完全互补配对识别靶基因，从 而达到抑制基因表达的作用。但在植物中，大多数目的基因只在开放读码框含有 单个m i R N A 互补位点，所以大多数m i R N A s 是与靶基因完全配对从而达到剪切 目标基因的作用( B a r t e le ta 1 ，2 0 0 4 ；C a r r i n g t o ne la 1 ，2 0 0 3 ) 。 番茄m i c r o R N A s l y - m i r l 5 6 a 和s l y - m i r l 6 9 c 的功能鉴定 1 3 3 植物m i c r o R N A 的特点 根据对植物m i c r o R N A 的深入研究和了解，人们发现植物m i R N A s 有一些明显的 特征：( 1 ) m i R N A s 是长度大约为2 0 2 4 n t 的单链非编码R N A s ；( 2 ) m i R N A s 前体都 具有茎环或发卡结构，且这个茎环结构的自由能很低；( 3 ) 成熟m i R N A s 的5 磷酸 末端和3 羟基末端的构造是它们与大多数寡聚核苷酸和功能R N A s 的降解片段的区 别；( 4 ) 大多数m i R N A s 具有保守性、时序性和组织特异性。 1 4 有关m i c r o R N A 的研究方法 m i c r o R N A s 的发现是通过直接克隆、正向遗传学和生物信息学预测及后续的实验 验证这三种基础的方法，随着生物技术的发展很多新的方法和技术手段也被应用在 m i c r o R N A 研究中。 1 4 1 直接克隆的方法 发现m i R N A 最直接的方法就是从生物样品中分离和克隆小R N A 分子。富集 m i c r o R N A 一般是通过一些普通的分级分离的方法，例如P E G 沉淀和凝胶过滤，这些 方法可以把分子量低的R N A 从总R N A 中分离富集。得到分离出来的小分子R N A 后， 在它们的5 磷酸末端和3 羟基末端分别连接一个接头引物，然后利用P C R 扩增的方 法克隆到载体中去。 1 4 2 正向遗传筛选法 尽管第一个m i c r o R N A 是在线虫中通过正向遗传筛选的方法发现的( L e ee ta 1 ， 1 9 9 3 ；R e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 0 ) ，但是还没有用这种方法在植物中发现m i R N A 基因家族， 而且与植物突变表型相关的m i R N A 直到克隆实验之后才被发现，随后发现植物基因 组中存在大量的m i R N A ( P a r i z o t t oe ta 1 ，2 0 0 4 ；R h o a d e se ta 1 ，2 0 0 2 ；S c h a u e re ta 1 。 2 0 0 2 ) 。利用正向遗传的方法找到缺失功能的m i R N A 突变体频率是很低的。几乎进 化上保守的所有植物m i R N A 都是由基因家族来编码的，功能相似的家族成员可能弥 补任何单一位点发生缺失的m i R N A 的功能。超量表达筛选的方法可以克服这些难题， 通过超表达m i c r o R N A 的前体，使其组成型表达，这是植物m i R N A 研究的一个重要 方法，有三个具有发育畸形的显性突变体就是通过这种方法筛选出来的，它们分别是 m i R 3 1 9 、m i R l7 2 和m i R l 6 6 ( A u k e r m a ne ta 1 ，2 0 0 3 ；K i me ta 1 ，2 0 0 5 ；P a l a t n i ke ta 1 ，2 0 0 3 ； W i l l i a m se ta 1 ，2 0 0 5 ) 。m i R N A 靶基因位点的突变能够防止m i R N A 的整个家族抑制一 个靶基因的表达，即得到不受m i c r o R N A 调节的基因转入植物，用来研究其对靶基因 6 番茄m i c r o R N A s l y - m i r l 5 6 a 和s l y - m i r l 6 9 c 的功能鉴定 的调控，同时也可以避免m i R N A 家族的众多功能。 1 4 3 生物信息学 直接克隆的方法是研究大片段m i R N A