SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离大肠杆菌全蛋白,实验六,LOGO,Yoursitehere,实验目的,学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理；掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的操作技术（基础性很强，使用范围广泛）；学习蛋白质的考马斯亮蓝染色鉴定。,LOGO,Yoursitehere,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶:是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行。,LOGO,Yoursitehere,实验原理,（聚丙烯酰胺）,LOGO,Yoursitehere,实验原理,LOGO,Yoursitehere,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：,凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用；样品用量少，灵敏度可达10-6g;凝胶孔径可调节；分辨率高。,LOGO,Yoursitehere,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）；蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。,LOGO,Yoursitehere,由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了原蛋白质分子的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒。因此在进行电泳时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此，可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,LOGO,Yoursitehere,凝胶系统的分类,连续性凝胶电泳,不连续凝胶电泳,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。,不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。,LOGO,Yoursitehere,实验原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应,浓缩效应电荷效应分子筛效应,LOGO,Yoursitehere,浓缩效应,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成:浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HC1;分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8的Tris-HC1;电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。,LOGO,Yoursitehere,浓缩效应-1（凝胶孔径的不连续性）,浓缩胶的凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间而被浓缩至一个狭窄的区带，大大提高了电泳的灵敏度。,LOGO,Yoursitehere,在pH6.8的凝胶缓冲体系中：前导离子或快离子：HCl(解离）Cl，Cl泳动速度最快;尾随离子(trailingion)或慢离子：CH2(NH2)COOHCH2(NH2)COO，泳动速度最慢;蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间；电泳时，Cl超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区较高电位梯度P和慢离子加速移动P压缩成层；mclclmppmGG(Cl代表氯离子，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根离子)，有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度。当进入pH8.8的分离胶时甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质时，不再形成高电压。,浓缩效应-2（缓冲体系离子成分及pH值的不连续性）,LOGO,Yoursitehere,实验原理,考马斯亮蓝是一种染料，和蛋白质结合呈蓝色。G250用来测定蛋白质含量；R250用来对电泳条带染色。,LOGO,Yoursitehere,SDS-PAGE,LOGO,Yoursitehere,实验方法,分离胶的制备,浓缩胶的制备,加样,待分离样品的准备,电泳,染色,脱色,LOGO,Yoursitehere,分离胶的制备,置小烧杯中,混匀,迅速用移液器滴入二块玻璃板之间(短玻璃朝外),凝胶加至横板的2/3；用滴管加少许水，在室温中聚合20-30分钟。注意：acr/bis有神经毒/制胶时避免产生气泡,LOGO,Yoursitehere,浓缩胶的制备,将分离胶上层的水倒去，并用滤纸擦干置小烧杯中，混匀，迅速加入配制好的浓缩胶溶液至接近短玻璃的顶端，插入加样梳,聚合30分钟；,LOGO,Yoursitehere,加样,样品制备：取大肠杆菌培养物1ml，6000rpm离心5分钟，弃上清，用100ul蒸馏水重悬，加25ulloadingbuffer沸水煮沸5分钟，10000rpm离心5min；聚合后，将凝胶板取出，置于电泳槽中，短玻璃朝内，加入电泳缓冲液，小心拔去加样梳，用微量进样器吸取10ul样品，加入凝胶的每个凹槽中。注意：加样前先倒入电泳缓冲液，没过短玻璃；上样时不要扎破加样孔，也要避免样品溢出。,LOGO,Yoursitehere,电泳,在电泳槽中注入Tris-甘氨酸缓冲液，样品端接负极(短玻璃的一边)，电压控制在180V，电泳约11.5小时,溴酚蓝距离分离胶底端1cm。,LOGO,Yoursitehere,染色和脱色,染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色30min；脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色20min，更换脱色液过夜。剥胶时要小心，保持胶完