基于DNAzyme及HCR信号放大的新方法研究.pdf

学校代号：1 0 5 3 2学号：$ 1 0 1 1 1 0 8 0密级：内部湖南大学硕士学位论文基于D N A z y m e 及H C R 信号放大的新方法研究学位申请人姓名：胡垩垩一导师姓名及职称：扬苤堡熬援一培养单位：他堂他王堂院专业名称：盆逝化堂论文提交日期：2 Q ! 三生量月三! 旦论文答辩日期：2 Q ! 呈生鱼旦垒旦答辩委员会主席：睦金堡教援 N e w S t r a t e g i e so fS i g n a lA m p l i f i c a t i o nB a s e d o nD N A z y m e a n dH C R H uY a p i n g B S ( H e n a nN o r m a lU n i v e r s i t y ) 2 0 10 At h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no f t h e r e q u i r e m e n t sf o rt h eD e g r e eo f M a s t e ro fS c i e n c e A n a l y t i c a lC h e m i s t r y t h eG r a d u a t eS c h o o l o f H u n a nU n i v e r s i t y S u p e r v i s o r D r Y a n gR o n g h u a M a y , 2 0 1 3 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体已经发表 或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：专同彩午 日期：矽房年月罗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖 南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保彬 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：调亚聋 翩嬲：I 黼川”V 。1 日期：驯年6 月歹日 日期：2 口房年5 月，日 硕士学位论文 摘要 核酸探针具有信号转换机制灵活、稳定性好、容易合成等优势，结合核酸探 针信号放大技术，可实现目标物质的灵敏检测。其中，D N A z y m e 和h e m i n 结合后， 具有生物催化活性，可以实现多倍信号放大。杂交链式反应( H C R ) 利用引发链 引发，形成有缺口的核酸长链，可作为信号放大的平台。两种信号放大技术都可 以在恒温无酶条件下进行，简单易操作，可实现目标物的放大检测。基于此，本 文着眼于利用D N A z y m e 及H C R 放大技术，利用比色与表面增强拉曼散射( S E R S ) 信 号转导技术，实现目标物质的灵敏检测。包括如下三个方面的工作： ( 1 ) 利用G 四聚体和h e m i n 结合产生生物催化活性及A T P 对显色反应的积极 促进作用，发展了基于h e m i r d G 四聚体A T PD N A z y m e ( H G A D ) 免标记的可视化 放大检测A T P 的方法。设计合成了一条在茎部固定G 四聚体序列的可激活的发夹结 构，当目标物A T P 存在时，A T P 可引发发夹结构发生改变，形成具有催化活性的 H G A D 复合物，同时A T P 还可以使过氧化氢氧化A B T S 2 。生成氧化产物A B T S 。的趋势 增加，进一步信号放大。本方法可有效降低背景信号，高灵敏、高选择、可视化 检测生物小分子A T P 。 ( 2 ) 基于杂交链式放大技术( H C R ) J 受表面增强拉曼散射( S E R S ) 信号转导技术， 发展了高灵敏检测D N A 的方法。本体系利用目标D N A 存在时释放出引发单链， 引发H C R 杂交链式反应，并通过亲和素和生物素的特异性作用，将标记有亲和素 和拉曼信号分子的金纳米颗粒连接到H C R 长链，形成H C R A u 探针，使拉曼信号 探针靠近，拉曼信号增强，从而实现目标核酸链的灵敏检测。引入第三个将引发 链固定在结构茎部的发夹结构，可以增加体系的通用性，只需改变此发夹结构的 部分序列就可以实现对不同的目标物质的检测。本方法稳定性好、灵敏度高、通 用性好。 ( 3 ) 在上一章的基础之上，本章发展了一种基于H C R 放大的S E R S 单细胞 水平检测急性白血病淋巴细胞( C E M ) 细胞的方法。本体系利用与核酸适体连接的引 发链引发H C R 杂交链式反应，形成H C R A u 探针。H C R A u 探针与细胞孵育后， 可以靶向实现C E M 细胞在单细胞水平的检测。本方法综合利用了H C R 无酶恒温 信号放大、核酸适体的高特异性及S E R S 灵敏度高、分辨率高、稳定性好等优势 实现对C E M 细胞在单细胞水平的检测。 关键词：核酸探针；D N A z y m e ；杂交链式反应；比色；表面增强拉曼散射；A = r P ； D N A ；急性白血病淋巴细胞细胞；生物传感 I I A b s t r a c t N u c l e i ca c i dp r o b e sc o m b i n e dw i t ht h ea m p l i f i c a t i o nt e c h n o l o g i e sh a v e b e e n i n c r e a s i n g l ya p p l i e di ns e n s i t i v ed e t e c t i o no ft a r g e t ，d u et ot h e i rs i m p l ed e s i g n ，f l e x i b l e s i g n a lm e c h a n i s m ，g o o ds t a b i l i t y ，a n de a s ys y n t h e s i s W h e r e i n ，t h ec a t a l y t i ca b i l i t yo f D N A z y m e h e m i nc o m p l e x e s ，w h i c h a c ta sh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( H R P ) ，c a l lb e a m p l i f i e d2 5 0t i m e st h a nh e m i n T h el o n gn i c k e dd u p l e xf o r m e db yh y b r i d i z a t i o nc h a i n r e a c t i o n ( n C R ) c a na l s ob eu s e da sp l a t f o r mo fs i g n a la m p l i f i c a t i o n B o t ho f t h e ma r e e a s yt oo p e r a t e ， a n ds e n s i t i v ed e t e c t i o no ft a r g e tw i t hs i g n a la m p l i f i c a t i o ni n a c o n s t a n tt e m p e r a t u r ew i t h o u te n z y m e a s s i s t e d I nt h i st h e s i s ，c o m b i n i n gn u c l e i ca c i d m o l e e u l a rp r o b e sa n da m p l i f i c a t i o no fD N A z y m ea n dH C R ，w e a c h i e v et od e t e c tt a r g e t w i t hc o l o r i m e t r i ca n dS E R Sm e a n s T h ec o n t e n t so f t h et h e s i sa r ea sf o l l o w e d ： ( 1 ) C o m b i n i n gt h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fD N A z y m ea n de n h e n c e m e n to fA T P ，a n e wc a t a l y t i cs e n s i n ga p p r o a c hf o ru l t r a s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ed e t e c t i o no fA T P b a s e d o nh e m i n G q u a d r u p l e x A T PD N A z y m e ( H G A D ) i sp r o p o s e d T h es i m p l eh a i r p i n s t r u c t u r et h a ti n c l u d e dt h eH R P - m i m i c k i n gD N A z y m ei nc a g e dw a sd e s i g n e d U p o n A T Pa d d i t i o n ，i tc a nt r i g g e rt h eh a i r p i nc o n f o r m a t i o nc h a n g e sa n df o r mH G A D c o m p l e x e st oc a t a l y z e t h eH 2 0 2o x i d a t i o no fA B T S 2 。t oA B T S ，w h i c hc a nb e e n h e n e e db yA T P T h es t r a t e g yh a sl o wb a c k g r o u n d - s i g n a la n dC a na c h i e v es e n s i t i v e a n ds e l e c t i v ed e t e c t i o no fs m a l lm o l e c u l a rw i t hv i s i b l ec o l o rc h a n g e s ( 2 ) An e Wa p p r o a e hf o rd e t e c t i o no fD N A h a sb e e nd e v e l o p e dc o m b i n i n gH C R a n dS E R Se n h a n c e m e n t U p o nt h et a r g e tD N At r i g g e r sH C R ， al o n gn i c k e dd u p l e x w i l lb ep r o d u e c d ，a l l o w l i n gt h ef o r m a t i o no fH C R A ut h r o u g hl i g a t o no f b i o t i na n d a v i d i n ，w h i c hr e s u l ti n as i g n i f i c a n tR a m a ns i g n a le n h a n c e m e n td u et ot h ec l o s e p r o x i m i t y T h i sa s s a yi m p l e m e n t e dh i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ed e t e c t i o no fD N A a n dt h eu n i v e r s a l i t yo ft h ea p p r o a c hi sa c h i e v e db yv i r t u eo fa l t e r i n gt h es e q u e n c eo f H A p tp r o b ew i t h o u tc h a n g eo f i ll ，H 2 ( 3 ) Aa p p r o a c hf o rd e t e c t i o no f c a n c e rc e l l sh a sb e e nd e v e l o p e dc o m b i n i n gH C R a n dS E R Se n h a n c e m e mo nt h eb a s e so ft h el a s tc h a p t e r T h ei n i t i a t o rD N A t r i g g e r s H C Ra n df o r mH C R A ut h r o u g hl i g a t o no f b i o t i na n da v i d i n ，w h i c hr e s u l ti na s i g n i f i c a n tR a m a ns i g n a le n h a n c e m e n td u et o t h ec l o s ep r o x i m i t y W h e nH C R A u i n c u b a t ew i t hC E Mc e l l s ，t h ed e t e c t i o no ft h es i n g l eC E M c e l ll e v e lc a l lb et a r g e t e dt o a c h i e v ew i t ht h ea d v a n t a g eo fh i g hs p e c i f i c i t y ，h i g hs e n s i t i v i t y ，h i g h - r e s o l u t i o na n d g o o ds t a b i l i t ya n dS Oo n i i i 硕士学位论文K e y w o r d s ：N u c l e i ca c i dp r o b e ；D N A z y m e ；H C R ；c o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n ；S u r f a c e - e n h a n c e dR a m a ns e a t t e r i n g ( S E R S ) ；A T P ；D N A ；C E Mc e l l s ；B i o s e n s i n gI V 基于D N A z y m e 及H C R 信号放大的新方法研究 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书I 摘要I I A b s t r a c t I I I 本文所用英文缩略词表V I I I 第1 章绪论1 1 1 核酸探针的主要转导方法1 1 1 1 基于核酸探针的荧光检测方法一2 1 1 2 基于核酸探针的比色检测方法一4 1 1 3 基于核酸探针的电化学检测方法5 1 1 4 基于核酸探针的表面增强拉曼散射( S E R S ) 检测一6 1 2 核酸探针信号放大技术1 0 1 2 1 聚合酶链式( P C R ) 放大技术1 0 1 2 2 滚环( R C A ) 放大技术1 1 1 2 3 链置换( S D A ) 放大技术1 2 1 2 4 杂交链反应( H C R ) 放大技术1 4 1 2 5D N A z y m e 催化放大技术1 6 第2 章利用D N A z y m e 信号放大比色法检测A T P 2 1 2 1 前言2 1 2 2 实验部分2 2 2 2 1 主要试剂2 2 2 2 2 主要仪器2 3 2 2 3 实验方法2 3 2 3 结果与讨论2 4 2 3 1 设计机理2 4 2 3 2 探针热力学稳定性2 5 2 3 3 探针茎部长度优化2 6 2 3 4 离子强度及p H 值优化2 7 2 3 5 验证构型变化2 8 2 3 6 定量检测2 8 2 3 7 选择性2 9 2 3 8 实际样品的检测3 0 V 硕士学位论文 2 4 小结3 1 第3 章基于H C R 放大技术的S E R S 探针用于D N A 检测3 2 3 1 前言3 2 3 2 实验部分3 2 3 2 1 主要试剂3 2 3 2 2 主要仪器3 3 3 2 34 0n i n 的金纳米颗粒( A u N P s ) 的制备3 4 3 2 4 拉曼探针的制备3 4 3 2 5H C R 放大平台的制备3 4 3 2 6H C R A u 的形成3 4 3 2 7 体系S E R S 信号的检测3 4 3 3 实验结果与讨论一3 4 3 3 1 设计机理3 4 3 3 2 拉曼信号探针的性质表征3 5 3 。3 3 杂交链式反应的表征3 7 3 3 4H C R A u 的形成3 8 3 3 5 实验的可行性验证3 8 3 3 6 定量检测3 9 3 4 小结4 l 第4 章基于H C R 及S E R S 探针用于C E M 细胞检测4 2 4 1 引言4 2 4 2 实验部分4 3 4 2 1 主要试剂一4 3 4 2 2 主要仪器4 4 4 2 3T E M 样品的制备4 4 4 2 4 细胞的培养及处理4 4 4 2 5 细胞流式测定4 4 4 2 6C E M 单细胞水平S E R S 信号放大检测4 4 4 3 实验结果与讨论一4 5 4 3 1 设计机理4 5 4 3 2 琼脂糖电泳验证H C R 的发生一4 5 4 3 3H C R A u 探针的形成4 6 4 3 4 核酸适体与C E M 细胞的特异性结合4 8 4 3 5C E M 细胞单细胞水平S E R S 信号放大检测4 8 4 4 小结5 0 V 1 基于D N A z y m e 及H C R 信号放大的新方法研究 结 论一5l 参考文献一5 2 附录A 攻读学位期间发表的学术论文6 5 致 射6 6 I 硬士学位论文 本文所用英文缩略词表 缩略词 4 A B T A p t a m e r A T P A u N P C E M C T P D N A D N A z y m e d A T P d T T P d C T P d G T P G T P H C R H E P E S H G A D L O D P C R R C A S P R S B S E R S T m 1 r i s H C l U T P 中文名称 4 氨基苯硫酚 核酸适体 三磷酸核苷 金纳米颗粒 急性白血病淋巴细胞 三磷酸胞苷 脱氧核糖核酸 脱氧核酶 三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 三磷酸脱氧胸苷 三磷酸脱氧胞苷 三磷酸脱氧鸟苷 三磷酸鸟苷 杂交链反应 羟甲基哌嗪乙硫磺酸 h e m i n G q u a d r u p l e x - A T PD N A z y m e 最低检测限 聚合酶链式反应 滚环放大 表面等离子共振 信噪比 表面增强拉曼散射 解链温度 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐盐酸缓冲液 三磷酸尿苷 V I ! I 硕士学位论文 第1 章绪论 从1 8 6 9 年瑞士生物学家米歇尔( F r i e d r i e hM i e s e h e r ) 首次发现核酸，拉开研究 遗传物质的大序幕，到1 9 5 3 年W a t s o n 和C r i c k 提t p , D N A 的双螺旋结构模型【卜3 1 ，一个 全新的研究核酸生物分子时代的到来。今天的分子遗传学、分子生物学和基因治 疗学的迅猛发展，标志着核酸研究工作的活跃，蛋白组学研究的启动以及人类基 因组计划的完成，功能基因组学研究和蛋白组学研究及核酸序列倍受生命科学家 的关注1 4 1 。经典传统的相关生命物质检测的方法往往具有操作过程繁琐、仪器昂贵、 耗时长以及实时的动力学过程信息很难获取等缺点，在很大程度上限制了人们对 生命过程的了解。但是，由于核酸分子具有独特的A T ( U ) 、C - G 碱基配对特性， 易于合成、便于设计、稳定性良好、信号机制转导灵活等诸多优势【5 击】，近年来， 科学家通过分子工程手段，依据特定的需求，在分子水平上设计、合成各种核酸 分子探针，研究核酸与核酸、核酸与金属离子、核酸与生物大分子、小分子以及 整个细胞甚至活体，已经被广泛应用到生物医学、化学和生物分析等领域中，进 行生命体系的研究、疾病的诊断和治疗、环境污染中重金属离子的检测等。 迄今，核酸探针类型已被开发出很多种，如传统的克隆探针，包括e D N A 分子 探针【7 - 1 3 】、基因组D N A 探针【1 4 - 1 6 1R N A 分子探针【1 7 也1 1 ，还有近年来发展的新型核 酸探针，如：T a q M a M 粲t t 2 2 2 5 1 、M a g i 探针t 2 6 1 、相邻探针【2 7 。2 9 1 、L U X 探针【3 0 - 3 1 1 、 B r e a kl i g h t 拿+ t 32 1 、阴阳探针i 3 3 1 、P a d l o c k 探针【3 4 3 7 】和分子信标【3 8 4 4 l 等。除此，为 了满足分析检测中高灵敏、高精确、更便捷的要求，科研工作者发展了很多核酸 探针信号放大方法，本章将从核酸探针的主要信号转导方法及主要信号放大技术 进行简要介绍。 1 1 核酸探针的主要转导方法 近年来，由于核酸探针具有的独特的A T ( U ) 、C G 碱基配对特性，易于合 成、便于设计、稳定性良好、信号机制转导灵活等诸多优势，已经被广泛应用到 生物医学、化学和生物分析等领域中，进行生命体系的研究、疾病的诊断和治疗、 环境污染中重金属离子的检测等。核酸探针检测目标物时，核酸探针本身并不能 产生可以检测的光、电等信号。因此，为了产生可检测的信号，需要将核酸探针 与目标物特异性识别的作用转导为可检测到的化学或物理信号。依据信号转导原 理的不同，可以将核酸探针的信号转导方法分为荧光检测方法、比色检测方法、 电化学检测方法、S E R S 检测方法等。 1 1 1 基于核酸探针的荧光检测方法 荧光检测技术操作比较简单，易与信号放大技术相结合，且核酸碱基和特定 基于D N A z y m e 及H C R 信号放大的新方法研究有机荧光物质可结合或者可在核酸探针上进行荧光标记，荧光信号稳定，灵敏度较高，因此，被研究人员广泛应用。目前，荧光检测方法主要包括非标记核酸探针和荧光基团标记核酸探针两种。( 1 ) 非标记核酸探针有机荧光染料如E B ( e t h i d i u mb r o m i d e ，) 、S Y B RG o l d 、S Y B RG r e e n 等可以与D N A 或者R N A 特异性结合，嵌入到杂交的核酸双链碱基对中从而改变发光特性，使荧光信号增强；对于单链的寡核苷酸链，这些荧光染料与其作用非常微小，荧光信号很弱。基于这种有机荧光嵌入染料在核酸单双链中荧光强度的明显差异，目前，已经设计并发展了许多非标记的核酸探针体系，用于对目标物的定性、定量分析。D o n g 组【4 5 】以E B 为荧光嵌入染料，基于竞争机制，提出一种非标记的核酸适体分子开关，用于生物蛋白凝血酶( t h r o m b i n ) 的检测。E B 嵌入到核酸适体与其完全匹配的D N A 序列形成的双链时，在激发光照射下，产生很强的荧光。当目标物凝血酶存在时，核酸适体与凝血酶高特异性结合，将互补D N A 序列竞争下来，破坏了D N A 双链结构，E B 嵌入剂被释放出来，使荧光降低，从而实现非标记荧光法检测凝血酶。K l e n e r m a n 等【4 6 】利用量子点和E B 嵌入剂间发生荧光共振能量转移，实现非标记特异性核酸的定量检测。L i u 等【4 7 】( 如图1 1 所示) 设计了一条功能化的富T 的序列形成水凝胶，利用T碱基可与重金属汞离子H 9 2 + 形成T H 9 2 + - T 结构及荧光染料S Y B RG r e e nI 荧光的不同，实现H 矿+ 的检测，并可从水中有效移除H 9 2 + 。当H 9 2 + 存在时，S Y B RG r e e nI嵌f l , 到T - H 9 2 + - T 双链形成的的水凝胶中，在4 8 0n n l 激发光照射下，发出绿色荧光；而当无H 9 2 + 存在时，S Y B RG r e e nI 和水凝胶中发出黄色荧光，实现环境中试剂水样中H 9 2 + 的检测和移除。本组O u y a n g 等【4 8 】设计了基于碳纳米颗粒与D N A 自组装相结合的免标记法检测甲基化酶。利用与荧光嵌入染料S Y B RG r e e nI 作用的单双链和碳纳米颗粒静电吸附能力不同，实现了复杂样品中的甲基化酶的低背景、高特异性检测。5 H 9 2 *c = T c r ? 譬c ：窖e 。、AC T 翟C T T T C r T C C C C T T G T T T G T T G 一IS Go = T i ：T T o ? 1 1 c 夏图1 1 利用水凝胶和荧光嵌入染料检测重金属离子H 9 2 + 【4 7 】除了上述一系列荧光嵌入染料应用于非标记核酸探针的荧光法检测，其他材料如孔雀石绿m a l a c h i t eg r e e n ( M G ) 【4 9 1 、阳离子共聚物5 们、A Ps i t e ( 位点缺失) 5 H 、 R u ( p h e n ) 2 ( d p p z ) 2 + 【5 2 1 等，通过与核酸探针间的静电作用与其优良特性，也被 硕士学位论文广泛应用到非标记荧光检测中。( 2 ) 荧光基团标记核酸探针在核酸探针上修饰荧光染料是常用的荧光标记方法，标记有荧光基团的核酸探针通过与目标物质特异性结合，利用结合前后荧光信号或者荧光各向异性强度产生变化，实现对目标物质的检测。核酸探针荧光基团的标记包括单标记和多标记：单一标记一种荧光基团时，主要依靠核酸探针和目标物结合前后微环境的改变来实现荧光信号转导【5 3 】；当核酸探针双标记或者多标记不同荧光基团时，主要依靠核酸探针和目标物结合前后核酸探针构型改变，从而导致不同的基团间发生F R E T ( 荧光共振能量转移，f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) 效率的不同或者形成荧光基团二聚体等，实现荧光信号转导。T a n g 等【5 4 】利用两端分别标记荧光基团和猝灭基团的分子信标，通过将核酸连接信息转导为荧光信号的变化，从而实现核酸连接的实时监测。之后，T a n g 等【5 5 】利用相同的方法实现了5 端磷酸化和3 端去磷酸化以及限制性内切酶催化的核酸酶酶切反应等的实时监测。同样利用分子信标的机理，本娥 J t Z h e n g 等【5 6 】( 如图1 2 所示) 利用芘二聚体与环糊精( C D )的包络作用及其荧光寿命长的特点，设计了两端芘标记的核酸适体对凝血酶( t h r o m b i n ) 进行检测。环糊精和双芘分子的包络作用，使体系信背比显著增强，同时结合时间分辨技术，利用芘二聚体的长荧光寿命，实现了在复杂样品中对凝血酶的高灵敏、高选择性检测。L i u 等”7 】则将荧光基团和猝灭基团分别用不同尺寸量子点和金纳米颗粒代替，作为能量给体的量子点与作为能量受体的金纳米颗粒发生F R E T ，目标分子与核酸适体结合时，F R E T 效率降低，从而量子点发射荧光，实现了腺苷和可卡因的同时检测。图1 2 荧光标记的核酸探针实时监测核酸链接及凝血酶【5 6 】1 1 2 基于核酸探针的比色检测方法比色法通过核酸探针结合目标物前后颜色的变化达到检测目标物的目的，具有可视化、仪器简单、造价低等优点，广泛应用于D N A 、小分子、蛋白质、金属离子等一系列的检测中。核酸探针比色法主要包括基于金纳米颗粒聚集分散的比色法和基于脱氧核酶比色法两种。 基于D N A z y m e 及H C R 信号放大的新方法研究( 1 ) 基于金纳米颗粒的核酸比色检测方法金纳米颗粒作为一种新型纳米材料，与单链D N A 在溶液中作用时，纳米颗粒分散性好，溶液呈红色；当与D N A 双链在溶液中作用时，分散性较差，纳米颗粒发生聚集现象，溶液呈蓝色，引起吸收信号的强度降低并使最大吸收峰红移。W a n g等【5 8 】( 如图1 3 A 所示) 利用目标物诱导核酸适体构型变化及金纳米颗粒与单双链识别作用不同，设计了比色法检测小分子A T P 。不存在A T P 时，核酸适体与其互补序列形成双链，和金纳米颗粒作用较弱，金纳米颗粒发生聚集，呈蓝色；当目标物A T P 存在时，A T P 和核酸适体高特异性结合，竞争使双链解离，释放出单链D N A ，吸附在金纳米颗粒表面，使金纳米颗粒分散性良好，溶液呈红色。基于单双链与金纳米颗粒作用力不同的原理，W e i 等【5 9 】( 如图1 3 B 所示) 同样设计了一种比色检测凝血酶的体系，凝血酶和核酸适体的特异性结合使核酸适配子序列发生折叠，刚性增强，不能在纳米金表面有效吸附，导致纳米金聚集，溶液呈蓝色，从而实现对目标物凝血酶的可视化检测。A 蠹一薹：棼季Bo 卜o I s 出嚼曼善螂寸紫扯；I l l1 3 基于金纳米颗粒的核酸比色法检测A T P ( A ) 【5 8 】和凝血酶( B ) i s 9 ( 2 )基于D N A z y m e 的核酸比色检测方法在后面章节中，我们将会讨论D N A z y m c 催化信号放大技术，其中有一种富寡聚鸟嘌呤序列，即G 四聚体，和h e m i n 结合后，具有类似过氧化物酶活性，可以放大催化H 2 0 2 A B T S 显绿色。G 四聚体催化显色的底物一般包括A B T S 和T M B( 3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺) 1 3 8 两种，T M B 显色时，颜色由无色首先变为蓝色，然后在酸终止反应时变为黄色，其颜色变化没有A B T S 直接由淡绿色变为深绿色直接，且T M B 摩尔吸光系数较小，反应时间比A B T S 要长，故应用较少，主要使用A B T S 显色。关于D N A z y m c 催化A B T S 显色，后面章节有具体讨论，此处不再赘述。其中，还有另外一种D N A z y m e 可以特异性识别金属离子，如P b 2 + 【6 0 币1 1 、C u 2 + 【6 2 6 3 1 、Z n 2 + 【6 4 - 6 5 】等。L i u 等【6 6 】( 如图1 4 所示) 利用识别铅离子P b 2 + 的D N A z y m e调控金纳米颗粒颜色变化，设计了比色法检测铅离子。当铅离子不存在时，底物链与酶链及金纳米颗粒上的功能化D N A 分别杂交，拉近金纳米颗粒间的距离，使颗粒聚集，溶液呈蓝色；当目标铅离子存在时，酶链具有催化反应，促使铅离子特异性识别并切断底物链上的易裂开的脱氧核糖核酸腺苷( r A ) 位点，溶液呈红色，将底物链和酶链识别铅离子的作用转导为金纳米颗粒颜色的变化，实现铅离 硕士学位论文子的有效检测。 知叩函柚蛐猫t，1 一f a n fe C tC 。3 l l I I ； ；l ；2 I I l 。ri4 J o ；。fc 。憎柙k - 刚7 b 。铲卫茅铲一谚。一嘲乌扩。难一。蠢总淼篙黑Y s 。仪“惦 G m S t ：蚺C 8 T S一一毋囱够斟麓恭“产-、, - S t图1 4 基- 于D N A z y m e 和金纳米颗粒的核酸比色法检测P b 2 + L o o J1 1 3 基于核酸探针的电化学检测方法1 9 0 6 年克里默( C r e m e r ) 第一次发现玻璃膜电极对氢离子具有选择性响应现象，此后，电化学检测方法成为化学传感器中的一个重要组成部分，广泛应用于环境、农业和临床等领域，并已达到了商业化生产阶段【6 1 7 1 。基于核酸探针的电化学检测方法是将电化学信号作为转导方式，主要是将核酸探针修饰到电极表面上作为敏感层，将标记或者嵌入到核酸探针的电化学活性物质作为信号单元来实现信号转导。当存在待检测目标物质时，核酸探针与目标物高特异性作用，从而导致电极表面作为敏感层的核酸探针构型发生变化，将探针对目标物的识别转导为电极表面的电活性识别物质的电信号检测，通过可读的电信号达到对目标物质的识别和定量检测【6 8 】。该方法一般有两个主要部分：第一是识别元件，包括单链D N A 、R N A 、锁核酸、肽核酸等固定在电极表面，其长度一般介于十几到几百个核苷酸；第二是信号转换元件，核酸探针与待测物高选择性结合后，导致电极表面的电学参数的改变，然后通过适当的装置将变化的电学参数转换为可输出的电信号，电信号的强弱反映待测物质的浓度大小。2 0 0 3 年，F a n 等【6 9 1 ( 如图1 5 A 所示) 设计了一条同时包含捕获探针和信号识别探针的发夹结构的核酸探针，一端标记巯基S H 用于固定到金电极表面，另一端标记电化学活性物质二茂铁用于信号转导。当无待测目标物质存在时，探针的发夹结构导致二茂铁靠近金电极表面，此时二茂铁与电极表面的电子转移效率很高，电流较大；当待测目标物质存在时，目标D N A 与发夹结构环部结合，使发夹结构打开形成双链，由于双链具有较强的刚性，使电化学信号物质远离电极表面，二者之间的电子转移效率降低，电流降低。根据电流的减小程度来实现对目标D N A 的检测。基于目标物质引起探针构型变化导致电活性物质与电极间电子转移效率改变的机理，J o h a n f i 等【7 0 1 ( 如图1 5 B 所示) 等设计了一条发夹结构的核酸捕获探针，一端标记巯基，另一端标记电化学活性物质。当无待测物质存在时，发夹结构可以 基于D l q A z y m e 及H C R 信号放大的新方法研究与A T P 的核酸适体相互杂交形成刚性的D N A 双链，使电活性物质远离电极表面，电信号很弱；当待测物质A T P 存在时，A T P 可与核酸适体高特异性结合，核酸适体脱离金电极表面，使捕获探针重新形成发夹结构，此时，电活性物质接近电极表面，电化学信号增强，从而实现小分子A T P 的检测。为了适应高灵敏度检测需求，在上述方法的基础上，Z h a n g 等【| 7 1 】通过在探针上标记辣根过氧化物酶H R P ，通过“三明治”杂交的方式，实现人血清中核酸的高灵敏检测。当待测D N A 存在时，捕获探针将血清中的目标D N A 链拉近电极表面，结合上H R P 标记的D N A 信号分子，此时，辣根过氧化物酶催化T M B 发生氧化还原反应，从而实现对人血清样品中目标D N A的高灵敏检测。该方法检测低至1p M 的D N A 。基于核酸探针的电化学检测方法也可以用于蛋白质和金属离子的检测。W u 等【7 2 】基于叶酸受体蛋白的酶切保护作用及碳纳米管的催化作用，使电化学信号放大，从而实现叶酸受体的高灵敏检测。L i u 等【7 3 】设计了二茂铁标记的核酸探针，利用H 9 2 + 能和T 碱基( 胸腺嘧啶) g f 缄T - H 9 2 + - T 结构的特点，实现对重金属H 矿+ 的检测。K o n g 等【7 4 】引入金纳米颗粒用于信号放大，发展了一种汞离子电化学检测方法。该方法通过将电活性基团亚甲基蓝嵌入到D N A 链中，具有免标记的优势。AB图1 5 基于核酸探针的电化学方法用于D N A ( A ) 1 6 9 、小分子( B ) 检测1 7 0 】1 1 4 基于核酸探针的表面增强拉曼散射( S E R S ) 检测首次报道S E R S ( 表面增强拉曼散射) 现象的是M F l e i s h m a n n 等研究人员【7 5 1 。他们偶然发现将在粗糙的银电极表面上吸附的吡啶分子的拉曼信号增强了1 0 6 倍，他们认为该现象是由于粗糙的电极的表面积增加，从而导致吸附能力增加。M F l e i s h m a n n 发现单吡啶分子的拉曼散射信号在粗糙电极表面比在溶液中强很多。V a nD u y n e 小组【7 6 1 以及C r e i g h t o n 小组【7 7 】于1 9 7 7 年通过计算证明，相同数量的吡啶分子在电极表面的增强因子比在溶液中增强了约1 0 6 倍，并认为该增强效应与表面的粗糙度有关，把此现象称为表面增强拉曼散射( S u r f a c e e n h a n c e dR a m a nS c a t t e r i n g ，S E R S ) 。与荧光方法相比，表面增强拉曼散射具有背景信号低、抗光漂白性、可提供拉曼活性分子微小结构变化、高探测灵敏度及水干扰性小等特点，在材料、分析化学、生化、医学、传感器、电化学、防腐、催化等科学领域广泛应用。盖至盖 硕士学位论文S E R S 现象是复杂的物理化学现象，影响S E R S 增强因子和峰形的因素有很多，例如分子浓度、电极电压、激光频率、胶体形貌及温度、粒径、p H 值等。迄今，人们对于S E R S 的增强机理还存在很大的争议，未能建立可以解释所有现象的统一的理论模型。研究者们根据不同的S E R S 现象建立了不同的理论模型，主要建立了基于物理增强效应( C M ) 和化学增强效应( E M ) 两种模型【7 8 。7 9 】。物理增强模型( C M ) 认为表面增强拉曼散射是由于激光照射粗糙金属表面时，激发到高能级的局域表面等离子体( 1 0 c a l i z e dS u r f a c eP l a s m o n ，L S P ) 与光波电场发生共振耦合，导致粗糙金属表面局域电场增强而使拉曼散射增强。K e r k e r 等人【s o J在M i e 散射的基础上计算并提出了S P R 模型及单个球形金属粒子的表面分子吸附情况，得到了不同波长激光照射、不同大小的金属离子下的拉曼增强图谱( 如图】6 ) 。图1 6s P R 理论模型的计算结果【8 0 1根据K