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免疫组化,1,一、原理与方法,免疫组织与细胞化学检查（Immunohistochemistryandimmunocytochemistryexamination）是利用免疫学原理，将抗原抗体反应应用与组织细胞化学而进一步通过级连放大，增加敏感性。最后用辣根过氧化物酶显色。从而定位组织细胞中抗原（蛋白多肽、酶）等多种基因产物的特异方法。在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊和鉴别诊断。其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。,2,EsophagealcarcinomaE-cad+inmembraneWuMing-Yaoetal.,GFAP+incytoplasmofneurogliacell.TianDong-Ping,SuMinetal.,Fos+innucleus,Immunohistochemistry,3,尖锐湿疣HPVIHC200郭煜2007,4,原位癌IHC400胡彬2007,MCM2,Ki67,PCNA,5,左）Ii（200/400）,右）HLA-DR（200/400）,双标染色结果,6,双标染色,Ii（400）,DR（400）,7,二、免疫组织化学技术的主要步骤与常用标记物,（一）主要步骤1提取抗原(免疫原Immuno-gen);2用免疫原免疫动物(兔)制备抗血清(多克隆抗体)或免疫动物(鼠)后，用杂交瘤技术制备单克隆抗体；3纯化抗体；4抗体标记组织切片；5染色反应；6观察结果。,8,（二）常用标记物1酶为最常用的标记物。作为标记的酶应具有以下条件：底物是特异性的，且易于显示；酶反应产物稳定，不易扩散；容易获得纯酶分子且较稳定；酶标记抗体后，不影响两者的活性；被检组织中不应存在内源性相同的酶或其底物。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）、硷性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。2荧光素指在高能量光波的激发下能产生荧光的物质。常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）。3生物素其与卵白素的亲和力明显高于抗原抗体的结合力。4金属标记物如铁蛋白和胶体金。多用于免疫电镜。,9,三常用免疫组织化学染色方法,（一）直接法将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一抗体上，以检查相应的抗原。直接法具有特异性强的优点，但敏感性差，耗费抗体多。,10,（二）间接法先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体，二抗仅有种族特异性。特点:预先标好二抗，较方便；比直接法敏感，但仍差。,11,（三）PAP法与双PAP法：既过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法(PerixidaseAntiperoxidaseComplexMethod,PAP)先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗；然后再与结合，形成一个稳定的多角形结构（PAP）。特点：敏感性较高；背景染色低（相对）；双PAP敏感性更高，但背景相对较重。,12,（四）ABC法：1981年美籍华人许世明发明了ABC法Vector既卵白素生物素过氧化物酶复合物法(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)利用卵白素与生物素特有的高度亲和力，先将生物素与酶结合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物；同时先将二抗生物素化。,13,如将卵白素换成链霉亲和素，则为：法：(StreptAvidinBiotin-peroxidaseComplex)将链霉亲和素和生物素先连结起来，则称：法：labelledStreptAvidin-Biotin用链霉素抗生物素蛋白连结辣根过氧化物酶，则为：法：(StreptAvidinPeroxidaseconjugataedmethod)特点:敏感性高，（比高倍）；背景淡，链霉亲和素更好；方法较简便，时间较短；应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。,14,。,15,16,免疫组化阳性结果色度,弱阳性：淡黄色中等阳性：棕黄色强阳性：棕黑色取决于：抗原量分布密度方法灵敏度,17,免疫细胞化学阳性结果定位分布,1.细胞膜阳性,E-cad+inmembraneEsophagealcarcinoma,18,免疫细胞化学阳性结果定位分布,2.细胞浆阳性：,GFAP+incytoplasmofneurogliacell.,19,免疫细胞化学阳性结果定位分布,3.细胞核阳性,C-fos+innucleus,20,免疫细胞化学阳性结果定位分布,4.复合型：核+胞浆阳性注意：固定不及时，前处理过度可以造成假阳性,21,免疫细胞化学阳性结果定位分布,5.微绒毛型甲状腺、胃肠、胆管、卵巢腺癌的微绒毛如上皮膜抗原,22,免疫组化阳性结果定位分布,1.局灶型2.片块型3.弥漫型4.网状型5.腺管型6.腔缘型7.菊团型,23,免疫组化阳性结果强度,75%,24,四免疫组织化学染色过程中需注意的有关事项,正确设置免疫组织化学的对照对照原则：首先对照第一抗体；替代对照要注意相同的原则；阳性结果阴性对照，阴性结果阳性对照；染色清晰，定位准确。阴性对照：（）空白对照：用置换第一抗体；（）血清替代对照：用同种动物的正常血清代替第一抗体；（）抑制对照：用未标记的抗体先和相应的抗原结合；（）吸收对照：用纯化的抗原对抗体先行吸收；阳性对照：用已知或已被实验证明为阳性的组织；自身对照：利用组织切片内的各种不同的组织成分作对照。,25,2假阳性反应：1）Non-specificreaction(非特异性反应)：边缘现象、皱折和刀痕、出血和坏死等2）Endogenousperoxidase(内源性过氧化物酶：红细胞、炎细胞、退变坏死细胞皮分泌物，以及某些富含过氧化物酶的组织，如脑、肝等；3）Cross-reactive(交叉反应)：抗体本身含有与人体组织发生交叉反应的成分；4）Reagentconcentrationistoohighorinvalid试剂浓度过高或失效。,26,27,28,未封闭内源性过氧化物酶,29,30,胃固有膜腺体,31,3假阴性反应：组织固定不当或固定时间过长；抗体效价过低或久置失效；组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔；DAB或H2O2的浓度不当。,32,五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断中的应用,（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因：在常规病理活检中,通常有的疑难病例不能明确诊断。形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性淋巴瘤）因而难于识别，给治疗带来困难。一些转移性肿瘤常常缺乏特有的组织学特征，因而无法确定其原发病灶（如甲状腺癌和前列腺癌）。通过一些反映细胞增殖和与肿瘤恶性程度有关的标记物协助识别肿瘤的良恶性。,33,（二）各种不同组织及其肿瘤常见的标记物：1上皮组织及其肿瘤标记物：（）存在于所有上皮细胞内的标记物：桥粒蛋白（desmoplakin）细胞角蛋白（Cytokeratin,）：一种中间丝蛋白（）存在于大部分上皮细胞内的标记物：角蛋白多肽（如）；组织多肽抗原（tissuepolypeptideantigen,）；上皮细胞膜抗原（epithelialmembraneantigen,）。（）选择性存在于某些上皮细胞内的标记物：角蛋白多肽（），癌胚抗原（）；甲胎蛋白（），乳铁蛋白（lecroferrin）；前列腺特异性抗原（）及激素类等。,34,2间叶组织（软组织）及其肿瘤标记物：（）间叶源性肿瘤：波形蛋白（Vimentin）；（）纤维组织源性肿瘤：纤维瘤、肉瘤，恶纤组。抗胰蛋白酶（1，）；抗胰糜蛋白酶（，）；溶菌酶（Lysozyme）。,35,3肌细胞及肌上皮肿瘤及其标记物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记；肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，种亚型分别存在于不同的肌细胞、肌上皮细胞肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分型（慢）和型（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白，存在于分化成熟的横纹肌中。,36,内皮细胞肿瘤及其标记物：血管内皮肉瘤第因子相关抗原（Factor-relatedAntigen,）荆豆凝集素（UlexEuropaeus1Lectin,）；、等。,37,骨、软骨和脂肪组织肿瘤及其标记物：，Vimentin阳性；Lysozyme少数阳性。,38,滑膜及间皮肿瘤及其标记物：双向分化，无特异性标记物。Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等均有可能阳性。,39,周围神经肿瘤及其标记物：S-100：神经纤维肿瘤，神经鞘肿瘤。髓性缄性蛋白（Myelinbasicprotein,MBA）；髓鞘相关蛋白（MAG）；层粘连蛋白（Laminin）。,40,8淋巴造血组织肿瘤及其标记物：()LCA（LeucocyteCommonAntigen，白细胞共同抗原）；()、标记淋巴细胞；()、标记淋巴细胞；()、标记组织细胞；()、（Ki-antigen）标记细胞；()标记单核细胞、粒细胞。,41,9神经及神经内分泌肿瘤及其标记物：（）胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein,）：胶质细胞、室管膜细胞；（）髓鞘碱性蛋白（）：少枝细胞；（）神经细胞烯醇化酶（Neurunspecificenolosa,）：神经细胞；（）神经微丝（Neurofilaments,）神经细胞、嗜铬细胞、副节细胞、瘤；（）嗜铬素（Chromogranin）：神经内分泌肿瘤。（）其它：、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin、Serotonin等。,42,免疫组织化学最突出的优点是能在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分由于其方法简便且可重复性强，目前已得到广泛的应用，并正继续向着更微细、更精确的原位分子杂交和免疫电镜方向发展，向着分子病理学的领域推进。,43,44,45,46,47,48,49,50,51,细胞角蛋白,胃腺癌,52,53,54,55,56,57,送检（肉眼）：“胃体”部分胃壁切除标本，1565cm，切开见1个圆形肿物，大小10.565cm，切面灰白、质地稍硬。,图8,图9,图10免疫组化结果：肿瘤细胞Vimentin（+）,图11免疫组化结果：肿瘤细胞（CD117+）,58,59,60,61,62,63,64,抗原修复,从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定术就像一把双刃剑：福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。,65,抗原修复,福尔马林固定甲醛反应导致组织蛋白质发生的一系列反应，最终导致蛋白质交联这种特殊的蛋白质交联依赖于氨基酸侧链的参与这种蛋白质交联可导致蛋白质变性，降低或丢失免疫活性反应。,66,抗原修复,纵观历史，福尔马林固定并不适合于蛋白质免疫组化检测，只有极少例外。但这个问题已被Shietal.等人所解决，当他们发现煮沸组织（“抗原修复”）可以恢复许多抗体的免疫反应。综合了其他组织病理学抗原修复技术，极大地促进了免疫组化在临床应用。目前绝大多数经过福尔马林固定处理过的组织样本通过抗原修复的方法都可以恢复抗原免疫活性而被检测。,67,抗原修复,从概念上讲，福尔马林固定后的热修复免疫反应的这一发现是惊人的、反常态的。就像煮一个鸡蛋，蛋白质暴露于高温下发生了不可逆转的变性，其蛋白免疫活性也会随之减弱。有学者解释沸腾也可以从相反的各种机制包括反转由福尔马林所介导的蛋白质交联，从而解释了为什么沸腾的组织切片可以恢复免疫反应活性。虽然福尔马林介导的蛋白质交联可以在抗原修复中被打开，还并不清楚在如此剧烈的处理后蛋白质如何恢复其天然构象并恢复其免疫活性的。,68,抗原修复,以前的研究揭示甲醛能够与蛋白质发生多种化学反应。然而，从应用诊断实验室的角度，我们重点关注甲醛固定导致抗原丢失，修复如何使抗原活性重新展现的化学反应机理。因此重点阐述肽抗原表位的模型系统研究如何固定和抗原修复影响抗体与他们表位结合的能力很重要此研究的独特的方面是使用肽链抗原表位，而不是细胞、部分组织或整个蛋白，聚焦研究破译抗原修复机制的还原途径。,69,抗原表位-定义,抗原表位，又称抗原决定簇(antigenicdeterminant，AD)，是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的。抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。,70,抗原分子以其B细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合A.抗原-抗体复合物的立体构象；B.采用电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生在抗原分子的B细胞表位和抗体分子的抗原结合部位之间，两者呈现结构互补。C.抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图,C,71,一般情况下，一个多肽表位含56个氨基酸残基；一个多糖表位含57个单糖；一个核酸半抗原的表位含68个核苷酸。抗原表位的大小与相应抗体的抗原结合部位相适合。一个抗原表位的特异性由组成它的所有残基共同决定，但其中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用，这些残基被称为免疫显性基团。,72,抗原表位-分类,覆盖型和非覆盖型表位某些抗原分子表面，不同表位之间相对分离，各自结合特异性抗体，互不影响，这类表位被称为非覆盖型表位。若某一表位与相应抗体结合会影响另一表位与抗体的结合，此类表位称为覆盖型表位。功能性和隐蔽表位位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别，即具有易接近性，可直接启动免疫应答，故称为功能性表位。存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能，称为隐蔽表位。若通过理化因素处理抗原，使其结构发生改变，内部的隐蔽表位被暴露，可能成为新的有功能的表位。,73,按表位结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。连续性表位又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成通常这种结合比较弱，因为小肽并不含完整天然蛋白的构象，在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。对其研究依赖于多肽固相化学合成技术。后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续的氨基酸组成。,分类,74,按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。,分类,75,研究意义,表位是蛋白质抗原性的基础，研究蛋白质抗原表位，对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。应用：多在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特异性诊断试剂盒中更为重要。,76,77,主要参考文献,王伯沄李玉松黄高昇张远强。病理学技术。人民卫生出版社2000年。ISBN7-117-03644-3/R3645田东萍吴名耀.组织芯片技术在肿瘤分子病理学研究中的应用，中国肿瘤2002，11（1）：52-53李青周晓军苏敏主编临床病理学人民卫生出版社2009年。ISBN978-7-117-10844-7/R1084512-26苏敏田东萍牛恕淼.AMeX包埋法简介及在FISH中的应用。中华病理学杂志1995；4：265苏敏田东萍.福尔马林固定石蜡包埋标本细胞单离涂片FISH技术。西安医科大学学报1997；18（3）：399苏敏黄天华.实体瘤染色体分子病理学。癌变突变畸变杂志1999；11（6）：282,78,主要参考文献,1.ShiS-R,GuJ,TurrensJ,etal.:”Developmentoftheantigenretrievaltechnique:philosophicalandtheoreticalbases.”InAntigenRetrievalTechniques:ImmunohistochemistryMolecularMorphology.pp.17-40,S.-R.Shi,J.GuandC.R.Taylor(eds.),Natick,MA:EatonPublishing,2000.2.Fraenkel-ConratH,BrandonB,OlcottH:Thereactionofformaldehydewithproteins.IV.Participationofindolegroups.Gramicidin.J.Biol.Chem.1947;168:99-118.3.Fraenkel-ConratH,OlcottH:Reactionofformaldehydewithproteins.VI.Crosslinkingofaminogroupswithphenol,imidazole,orindolegroups.J.Biol.Chem.1948;174:827-843.4.Fraenkel-ConratH,OlcottH:Thereactionofformaldehydewithproteins.V.Crosslinkingbetweenaminoandprimaryamideorguanidylgroups.J.Am.Chem.Soc.1948;70:2673-2684.5.ShiS,KeyM,KalraK:Antigenretrievalinformalin-fixed,paraf