医学电子显微学的研究方法PPT课件.ppt

医学电子显微学研究方法,第一节TEM样品制备技术细胞是生物体结构和功能单位，细胞小而且复杂,若不借助适当的手段，难以观察其结构，更难发现细胞内各种成份的分子组成和功能，因此各种研究细胞的技术决定了我们对细胞的认识。许多细胞生物学的重要进展及新概念的形成来自新技术的应用。,超薄切片技术（UltrathinSectionTechniques）是最基本的常规制备技术。它是通过一系列化学方法把组织和细胞制备成树脂包埋块来进行超薄切片。观察细胞内的微细结构。这种切片具有以下性能：1.最大限度保持组织、细胞在生活状态下的结构及形态，保持抗原和酶的活性.2.切片厚度50100nm，透光度好，耐电子束轰击3.电子染色后具有良好的反差，图像清晰。电镜图像的分辨率，取决于电镜的分辨率和样品的结构与反差，而样品的结构和反差在很大程度上受到样品制备技术的限制。电镜分辨率0.2nm，生物样品最佳制备仅达到2030nm，这样远远不能发挥电镜的高分辨性能，这种差距说明许多更小的结构细节没有被发现和认识,超薄切片制备程序取材细切预固定冲洗后固定冲洗脱水浸透包埋聚合包埋块修整半薄切片复红和次甲基蓝染色光镜定位超薄切片电子染色TEM观察,一取材从动植物机体上，细胞及微生物的培养物中，取得所需材料的过程叫取材。生物材料在离开机体或正常的生长环境后在自溶酶的作用下易发生死后变化。为保持其原生活状态应遵守以下原则：1.准确根据研究目的和要求，准确确定取材的位置2.快速为了保持生物材料的活体状态，取材速度要快，最好在12分钟之内，将所取样品放入固定液中。3.样品体积要小为了保证固定剂能均匀的渗入到样品内，要求样品体积不超过2mm。(固定液的渗透能力弱，戊二醛的渗透深度为0.5mm，四氧化锇的渗透深度为0.25mm)。标本与戊二醛固定液的体积比约为1：20,4.低温取材细胞离体后，细胞内的各种水解酶释放到组织中使组织的蛋白质、核酸降解自溶，为了降低酶的活性，要在0-4低温条件下取材保存。5.防止损伤取材前要作好准备工作，用铅笔写好标签。取材器具要锋利，动作轻巧防止挤压造成细胞的损伤。,取材的具体方法1.准备好用具，包括剪刀、镊子、双面刀片、有编号放有固定液的小瓶、蜡板。2.将双面刀片断成两半，每一半的一端不要离开板面，两半交叉滑动将组织切成条索状,样品取材示意图,3.各种组织的取材实验动物、手术样品、血液、骨组织、培养细胞和活检材料等。实验动物材料将动物用乙醚麻醉后处死，取出所需材料切成长片状3.04.01.0mm放入固定液中固定30分钟，然后细切成条状在改刀为12mm的小块继续固定24小时，4存放。人体组织材料包括病理活检和尸检材料，这种组织往往带有血液和组织液成份，取材时应用生理盐水反复冲洗后在固定。尸检材料一般在低温下保存的组织，争取在死后312小时内取材，最长不超过24小时，否则造成细胞膜结构的损伤。,体外培养细胞材料对生长在培养瓶中的细胞，去掉培养液，用刮刀刮下贴壁细胞或消化液消化下细胞，离心15003000r/min，15分钟使细胞沉淀聚团。然后放入适量的固定液固定。血液材料取外周血35ml，放入加有抗凝剂的试管内，1ml血加抗凝剂0.15ml，离心沉淀1500转15分钟至分层。血清血小板白细胞红细胞，根据需要取不同的沉积物，加入戊二醛离心固定。,骨组织材料骨组织比较坚硬，取材尽可能小，放入固定液中固定2小时后放入脱钙剂中，不同部位的骨，采用不同的脱钙时间。一般脱钙时间为13周，室温存放，每周更换一次脱钙剂，待骨组织能被针刺进，即为脱钙已好可以进行常规制样。脱钙剂的配制（PH7.2)EDTA5g0.2M磷酸缓冲液50ml蔗糖双蒸水加至100ml(6)需要定向取材的组织胃肠、血管、气管、食道和分层的组织，皮肤、角膜、子宫等在取材时需定位切剪铺片,（7）骨髓样品的取材A分离骨髓细胞将骨髓用培养液稀释1：4加入2-4ml淋巴细胞分离液，离心2000r/min，20分钟，血浆层、骨髓细胞层、分离液、红细胞层。B固定戊二醛（8）眼球样品的制备主要考虑两方面:一是注意组织层次；二是在样品制作过程中视网膜易于脱落采用的方法:先将实验动物麻醉后，用注射器把固定液注入眼球内固定5-15分钟，然后在取出眼球切取所需部位。,二固定(Fixation)用化学和物理的方法快速杀死细胞，使其结构尽可能地保存在生活时的状态。1.固定目的在分子水平上把细胞可动的动态系统，转变成不可动的，稳定的胶体。使其微细结构完好无损。2.固定剂的作用能快速均匀进入细胞内，稳定细胞内各种化学成份。提供细胞骨架作用。能快速杀死细胞，与细胞内的大分子物质、蛋白质发生化学结合形成交联，使蛋白成份凝固，保存糖类和脂肪生活时的状态和位置。,避免有机溶剂对脂类物质的抽提，对细胞不产生收缩和膨胀作用，不产生人工假象和变形。保存酶的活性和抗原性,3.固定剂的种类和特点理想固定剂不但能完整的保存细胞微细结构，还具有良好的电子反差，目前已知固定剂主要作用于蛋白质、脂肪和糖类。作用原理尚不清楚，没有一种全能的固定剂对物质很好固定，各种固定剂对细胞成份的固定是有选择性的。电镜生物样品固定采用双重固定法。,常用固定剂：戊二醛（gluteraldehyde）优点：与组织细胞反应迅速，渗透深度大于0.5mm对蛋白质、糖原有较好的固定效果对细胞内膜性结构保存良好能较好的固定植物组织缺点：无电子染色作用，单独用戊二醛固定反差不好，不显示膜结构对脂肪保存效果不好,戊二醛配制：2.5%戊二醛磷酸固定液（PH7.2）0.1M磷酸缓冲液50ml25%戊二醛12ml双蒸水加至100ml电镜生物样品常用戊二醛浓度为2.5-3%，PH7.2弱酸。4保存备用。,四氧化锇（Osmiamtetroxide）四氧化锇俗称锇酸oSo4，是一种淡黄色具有强烈刺激气味的晶体，水溶液为中性，是一种强氧化剂,与氮原子有很强的亲和力。常用浓度为1%，4保存。优点：对蛋白质、氨基酸有非常好的固定作用，唯一能保存脂类的固定剂。对样品有很强的电子染色作用提高反差。缺点：对糖类、DNA、RNA保存作用差，穿透能力弱，反应缓慢。不保存抗原和酶的活性不能用于细胞化学剧毒，气体对粘膜组织有损伤,四氧化锇配制：1%四氧化锇固定液四氧化锇1g0.1M磷酸缓冲液99ml,4.常用的固定方法单固定法对单个细胞，固定液易于渗透的组织，一般用1%四氧化锇固定12小时即可。双重固定法戊二醛预固定2小时，样品呈淡黄色，1%四氧化锇后固定2小时，样品呈黑色。戊二醛和四氧化锇之间可以产生沉淀反应，要充分洗涤。,原位固定法用于解剖关系复杂和对缺氧比较敏感的组织，在保持器官血液供应的情况下，边解剖边将固定液滴加到器官上至到组织变硬后在取材固定。灌流固定法用于脑垂体、甲状腺、甲状旁腺等，通过血液循环的途径将固定液灌注到组织中，待组织硬化后取材作双重固定。,三脱水（Dehydration）用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水分。因为水的存在会使组织细胞的结构在电镜高真空状态下急聚收缩而破坏。常用的包埋剂是非水溶性的，细胞中游离水影响包埋剂的浸透，造成切片和观察的困难。常用的脱水剂为丙酮和乙醇，为了防止样品的剧烈收缩，脱水采用梯度脱水法。,梯度脱水法温度乙醇或丙酮时间450%15分钟470%15分钟490%15分钟室温100%x310分钟注意事项脱水剂在70%时是组织细胞变化最小的状态，可以延长时间。,四浸透（Penetration)经过脱水处理的样品，用包埋剂浸透目的:用包埋剂取代样品中的脱水剂，使细胞的内外空隙都被包埋剂充填。浸透时间最好为912小时或过夜后进行包埋。,五包埋与聚合(EmbedingandPolymeriztion)样品和包埋剂放入药用胶囊内在热作用下聚合成固体包埋块的过程。特点包埋剂易溶于脱水剂，粘稠度低、聚合均匀、耐电子束轰击、能良好的保存微细结构、高倍放大不显示自身结构。种类环氧树脂618：国产为淡黄色粘稠度较大的液体，对组织损伤较小，对细胞的微细结构尤其是膜结构保存完好。粘稠度大，对组织浸透不均匀。Epon812：国际上普遍使用优良包埋剂。淡黄色粘稠度低的树脂渗入组织快均匀。价格昂贵。,聚合温度时间3712小时4512小时6024小时,包埋膜具,六.包埋块的修整将聚合好的包埋块用70热水洗去胶囊，用修块机把组织修成45角立体梯形。,七.半薄切片把修整好的包埋块切成0.5-1um厚片，最大切片面积为2mm，目的为定位制备超薄切片。半薄切片的片子用碱性复红将细胞器染成红色，用次甲基兰天青II将细胞核染成蓝色。在光镜下定位，可以准确的选择切片位置提高观察效率。半薄切片有三个特点：1.细胞各种成份保存良好。2.可以在光镜下清晰的观察单层细胞3.为超薄切片准确定位。,八超薄切片(UltrathinSection)超薄切片是用超薄切片机以厚度为单位进行的切片。厚度在50-80nm,九载网与支持膜(coppergridasupportfilm）1.载网载网和支持膜用来支撑切片的样品，有金属载网、铜网和镍网，直径在2-3mm，网格为100-300目。(1)大孔载网，电子束透过率高，支持性差，适用于低倍大视野观察(2)小孔载网，电子束透过率低，支持性好，适用于高倍高分辨观察(3)镍网适用于免疫电镜。,铜网的类型：13150目46200目7300目8-9单孔1012多缝,2支持膜生物样品对电子轰击的耐受力弱，要在铜网上覆盖一层支持膜。支持膜没有结构，薄透明易被电子束穿透A3、机械强度大,耐电子束轰击，与样品不发生化学反应。厚度在150。formva膜：化学名称是聚乙烯醇缩甲基机械强度高。,formva膜的制备,十电子染色(positivestaining)1.电子染色的概念用重金属盐与细胞内成份结合，在电子束的照射下，形成不同的散射能力达到染色的目的。2.电子染色的原理：细胞和重金属盐结合，不同结构吸附重金属原子数量的能力不同，结合较多的区域具有大的电子散射能力,反差强.结合少的或没有结合的区域为透明区。通过电子染色提高图像的清晰度。,3.染色剂醋酸双氧铀显示蛋白质、核酸和胶原纤维。具有放射性和化学毒性。染色7分钟，35枸橼酸铅对膜结构和脂肪染色好。容易和空气中的二氧化碳结合产生碳酸铅，污染样品。染色10分钟,第二节SEM生物样品制备技术1.生物样品的特点生物样品含水量大质地软、干燥脱水易变形、机械强度低，不能耐受电子束轰击、生物组织是由原子序数较低的元素组成，二次电子发生率低。2.SEM生物样品制备程序取材-清洗-固定-脱水-干燥-镀膜-SEM,3取材取材的要求：准备好药品和器材取材部位要准，大小要合适。器材要锋利几种特殊组织取材培养细胞取材、有金属材料组织取材、菌类的取材、血液材料取材。,4样品的清洗一般的组织用生理盐水（如血液、粘液、分泌物）胃肠道的粘液，用蛋白水解酶。培养细胞清洗用培养液内耳螺旋器的胶质膜用盐酸浸泡。乳腺组织用乙醇和甘油处理。5清洗的方法一般把样品放入小瓶，加入足量清洗液，按一定方向轻轻摇动小瓶。表面粘液多可用注射器加压冲洗。超声清洗法灌流清洗法,6样品固定采用戊二醛、锇酸双重固定法。7脱水利用乙醇梯度脱水。8样品干燥处理空气干燥法：样品在空气中自然干燥。真空干燥法：样品在真空喷镀仪中抽真空干燥。冷冻干燥法：样品用液氮冷冻后，在真空喷镀仪中抽真空干燥。临界点干燥法：样品在临界状态下无表面张力，干燥样品型变最小。,9叔丁醇冷冻干燥法T-Buthano叔丁醇是一种有机溶剂，它的溶点为25.5。将样品入放于温度在5-50的干燥仪内使用T-Buthano增强渗透和冷冻样品。T-Buthano冷冻降温至10左右变为固态，然后加温并使叔丁醇逐渐升华变成气态，达到干燥的目的。,10.样品的粘胶目的：保证样品不移动，防止脱落，尤其在倾斜和旋转时，增强样品的导电性。方法：防止涂胶过多而掩盖要观察的结构粘贴样品前，确认观察面向上。经干燥处理后的样品，脆而易碎，粘贴时动作轻柔，防止反复夹持样品样品粘贴后，待导电胶干后再金属镀膜。,11.样品导电离子镀膜法（离子溅射Ioncoating）其工作原理是在镀膜机真空罩的顶部和底部分别装有阴极和阳极，阴极的表面有一金属靶，样品放在阳极上。当罩内真空度达到110-2托低真空时在两极间加以10003000V直流电压，在电场的作用下气体分子被电离为阳离子和电子并飞向阳极和阴极，阳离子又可轰击阴极上的金属靶使金属原子溅射出来，溅射的金属原子在电场的加速作用和气体分子的碰击下，以不同的方向和角度呈漫散射的方式覆盖在样品的表面，形成一层连续而均匀的金属膜。,IB3型离子镀膜仪工作原理,12生物样品制备的要求处理过程中应防止样品的污染和损伤，保持样品原有的形貌和微细结构。去除样品内的水分，干燥过程中尽量减少样品体积的变化和人工损伤。增强样品的导电性，提高二次电子发射率。注意保护样品的观察面和清洗。样品表面的血液和组织液，用生理盐水和缓冲液冲洗。对空腔器官表面的粘液，用不同浓度的蛋白水解酶处理。特殊的组织用特殊方法清洗。,二甲基亚砜冷冻割断法1%锇酸固4小时。12%、25%、50%二甲基亚砜分别放入30分钟。50%二甲基亚砜冷冻割断。0.1%锇酸过夜，1%锇酸60分钟。1%单宁酸60分钟。脱水、干燥、镀膜。,管道铸型样品制备法灌流固定用1%戊二醛灌流。树脂加硬化剂、灌铸10分钟硬化。50-60度水浸泡6小时，利于树肢进一步硬化。样品腐蚀处理，用15%氢氧化钠或30%盐酸腐蚀一周。清洗、干燥、镀膜。,第三节生物样品特殊制备技术一镜酶细胞化学（electronmicroscopiccytochemistryofenzyme）60年代在组织化学的基础上发展起来的一门技术，到目前为止，在电镜下能定位的酶还不到100种，只能作定性观察即通过酶的活性作用间接地证明酶的存在。,1.研究的目的特点在TEM下观察细胞内酶的化学反应产物，根据这些反应产物来研究相关的酶在组织细胞内存在部位功能及其动态变化，将特定的反应产物，形成高电子密度不溶性沉淀物，借助电镜做原位分析。酶细胞化学是以孵育为主，孵育液里有酶的反应底物和捕捉剂。,2.反应的基本原理酶反应分二个阶段。第一阶段，细胞内的酶与底物作用产生初级反应产物，第二阶段，初级反应产物和捕获剂作用形成不溶性沉淀即终反应产物。酶捕获剂底物-初级反应产物-终反应产物（可溶性）（不溶性）例酸性磷酸酶反应过程酸性磷酸酶柠檬酸铅-甘油磷酸钠-无机磷酸-磷酸铅,3.方法常规制样的基础上添加孵育反应步骤取材固定2%多聚甲醛0.5%戊二醛24h振动切片3040um孵育反应3730分钟后固定1%OsO460分钟脱水、浸透、包埋、超切,肝细胞内质网核膜，可见G6P酶阳性反应产物。,大鼠心肌细胞线粒体上细胞色素氧化酶反应阳性,二免疫电镜技术（immuneelectronmicroscopy）是免疫学与电镜技术的结合.将免疫学中抗原抗体反应的特异性与组织化学中形态的可见性结合起来。在电镜高分辨率和高放大倍率下，从细胞水平上观察形态与功能的结合及细胞内抗原的定性定位研究。免疫胶体金的标记作用抗原抗体抗抗体（细胞）（一抗）（金标体）,免疫金标方法1.取材12mm2.固定1%戊二醛，3%多聚甲醛固定34h3.乙醇梯度脱水。4.K4M低温包埋剂包埋，-20低温包埋机中紫外线下聚合24h室温紫外线下聚合48h5.5070nm超薄切片捞到镊网上6.3%H2O2蚀刻510分钟，用于软化树脂增强抗体穿透性。7.山羊血清孵育30分钟，防止一抗非特异性吸附8.加一抗2830孵育23小时。,9.0.01MPB