海洋石油降解菌深海弯曲菌的种类多样性及地理分布特征分析.pdf

第3 6 卷第4 期 2 0 1 7 年1 1 月 应用海洋学学报 J o u r n a lo fA p p lie d O ce a n o g r a p h y V 0 1 3 6 N o 4 N o v 2 0 1 7 海洋石油降解茵深海弯曲茵的 种类多样性及地理分布特征分析 刘仁菊1 ，董纯明2 ，李登峰1 ，邵宗泽2 ( 1 宁波大学海洋学院，浙江宁波3 1 5 2 1 1 ；2 国家海洋局第三海洋研究所、海洋生物遗传资源 重点实验室，福建厦门3 6 1 0 0 5 ) 摘要：深海弯曲菌( T h a la s s o lit u u s ) 是一类海洋专属的石油降解菌为认识其多样性与地理分布、获取 石油降解菌资源，本研究对西太平洋和厦门近海的表层海水分别通过石油烃富集和直接涂布石油 烃平板，对获取的菌株进行了分离鉴定在此基础上，对G e n B a n k 数据库中该属的可培养和未培养 菌株信息，进行了系统进化与物种多样性分析结果表明，从西太富集菌群分离得到的3 2 个菌株 中，主要优势茵为假单孢茵( P s e u d o m o n a s ) 和海杆菌( M a r in o b a ct e r ) ；其次是食烷菌( A lca n iv o r a x ) 和 弧菌( V ib r io ) 深海弯曲菌仅有2 株，但它们代表1 个潜在的新种，它们与模式菌株rm a r in u sI M C C l8 2 6 1 的同源性仅为9 6 9 和9 7 O 从厦门表层海水中分离到1 株深海弯曲菌，与模式菌株 rm a r in u sI M C C l8 2 6 。的相似度为9 9 6 6 基于本研究分离菌株及G e n B a n k 可培养及未培养菌株 的1 6 Sr R N A 基因序列开展的系统发育分析表明，该属存在3 个明显的进化分支，即2 个模式种 ro le iv o r a n s 与rm a r in u s 分别代表的2 个分支和1 个独立分支；此外，不同分支呈现明显的地理 分布特征，即来自同一纬度范围的菌株或序列多聚类于同一分支中我们推测，深海弯曲菌在进化 过程中，可能因适应不同纬度海域的温度等环境因子，逐步进化出3 个不同环境适应性的分支本 研究加深了对深海弯曲菌在不同温度海洋环境中种类多样性分布特征的认识，为海洋石油污染生 物修复提供了新资源 关键词：海洋生物学；深海弯曲茵；种类多样性；地理分布特征；表层海水；石油烃；生物降解 D O I ：1 0 3 9 6 9 J I S S N 2 0 9 5 - 4 9 7 2 2 0 1 7 0 4 0 1 4 中图分类号：1 7 7 3 5文献标识码：A文章编号：2 0 9 5 - 4 9 7 2 ( 2 0 1 7 ) 0 4 - 0 5 6 5 1 0 石油成份复杂，但主要由烷烃、环烷烃和芳香烃 组成。1J 在开采和转运过程中发生的溢油事件，会 导致严重的环境污染，从而引起社会的极大关注，如 2 0 1 0 年墨西哥湾溢油事件。2 1 ，2 0 1 1 年渤海湾的康菲 公司溢油事件3 。等虽然理化方法能快速去除大部 分泄漏的石油，但残留的石油烃主要依赖微生物的 生物降解才能完全去除H 一 深海弯曲菌( T h a la s s o lit u u s ) 属于海洋螺菌目 ( O ce a n o s p ir illa le s ) ，是目前已知的海洋专属烃类降 解菌之一；它属于革兰氏阴性菌，有鞭毛，身体呈弯 曲状，好氧，且能够利用烷烃1 5o 目前，该属有2 个 模式种，ro le iv o r a n sM I L 一1 儿叫和Fm 尬F in lA S I M C C l8 2 6 。_ 7J 其中，菌株M I L 1 ”分离自意大利一个海 港海水的正十四烷2 0 富集菌群，而菌株I M C C l8 2 6 。分离自韩国近海的表层海水由于深海弯 曲菌是海洋专属的烃类降解菌，且属于典型的寡营 养细菌，难于获得纯培养蟑j ，因此截至目前，包含上 述2 个模式菌在内，G e n B a n k 数据库中该属可培养 菌株仅1 3 株，其中分离自北极地区表层海水的有3 株，海洋石油污染颗粒物的4 株( 分离地点不明 确) ，韩国近海、夏威夷和泰晤士河表层海水的各1 株，分离自文昌鱼养殖场沉积物的1 株，以及未标明 分离环境的1 株；该属未培养菌株的1 6 Sr R N A 基因 克隆共有3 7 个，它们多分离自石油富集物或石油污 收稿日期：2 0 1 7 - 0 3 2 8 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 4 1 2 0 6 1 5 8 ) ；中国大洋专项资助项目( D Y l3 5 1 5 一R - 0 1 ) ；国家微生物资源平台资助项目( N I M R - 2 0 1 7 - 9 ) 作者简介：刘仁菊( 1 9 8 7 ) ，女，硕士研究生；E m a il：liu r e n j u l2 1 0 1 6 3 co n 通讯作者：邵宗泽( 1 9 6 4 ) ，男，研究员；E m a il：s h a o z z 1 6 3 C O ll 应用海洋学学报 3 6 卷 染的环境样品，分离地点多在中高纬度海域前期研 究表明，深海弯曲菌往往是低温石油烃富集菌群中 的优势类群旧J ，或多分离自高纬度的低温环境1 0 。； 然而，越来越多的报道表明，该属菌株或1 6 Sr R N A 基因克隆也出现在低纬度的海洋环境中“因此， 不同海洋环境来源的深海弯曲菌在石油烃降解能力 及其它生理生化特性上是否存在差别? 以及深海弯 曲菌是否存在明显的地理分布特征? 目前均未知 为进一步认识深海弯曲菌的多样性与地理分 布，并获取石油降解菌资源，本研究对西太平洋和厦 门近海的表层海水，分别通过石油烃富集培养和直 接涂布石油烃平板的方式，分离鉴定了该属及其它 种属的石油烃降解菌；并结合公共数据库中该属所 有菌株信息，进行了综合分析 1 材料和方法 1 1 样品采集及富集茵群构建 西太平洋表层海水：9 个站位，于2 0 1 2 年2 9 月，在“海洋六号”科考船执行第2 7 次大洋科考期 间采集( 表1 ) 样品采集后，参照文献 1 2 中的方 法富集石油烃降解菌群，并置于室温下进行富集培 养厦门近海表层海水：采自福建厦门白城近海，用 于直接涂布石油烃平板( 表1 ) 表1西太平洋和厦门近海表层海水采样信息 T a b 1 S a m p lin gin f o r m a t io no ft h es u r f a ces e a w a t e r f r o mw e s t e r nP a cif icO ce a na n dX ia m e nco a s t a ls e a 1 2 培养基 O N R 7 a 培养基的制备参考文献 1 3 的方法，具 体配方如下，溶液一：N a C l2 2 7 9g ，N a 2 S 0 43 9 8g ， K C l0 7 2g ，N a B r8 3m g ，N a 2 C 0 3 1m g ，H 3 8 0 32 7m g ， N a F2 6m g ，N H 4C 10 2 7g ，N a 2 H P 0 4 7 H 2 08 9 m g T A P S O1 3g ，d d H ，O0 5d m 3 ，用N a O H 调节溶 液p H 值至7 6 ；溶液二：M g C l2 6 H 2O1 1 1 8g ， C a C l， 2 H ，O1 4 6g ，S r C l2 6 H ，O 2 4m g ，d d H ，O 0 5d m 3 ；溶液三：F e C l2 4 H 2O2 0m g d m 3 ( O 2 2 m 滤膜过滤除菌) 其中，溶液一和溶液二，1 2 1 灭菌2 0m in ，待冷却至5 0 。C 后，将3 个溶液混合均 匀如制备固体培养基平板，需在溶液一中加琼脂粉 1 5g d in 3 配制含烃的O N R 7 a 液体培养基，是在上述3 种 溶液混匀后，加入0 1 ( V V ) 的无菌石油烃( 油 ：V 柴油= 1 ：1 ) ；其中，原油来自中化泉州石化有限公 司进口自伊拉克的原油，柴油标号为0 号，购自厦门 市中国石化加油站) O N R 7 a 石油烃平板配制方法：灭菌后O N R T a 固体培养基，冷却至5 0 后，加入0 1 ( y ) 的无 菌石油烃与T w e e n8 0 的混合物( 体积比为3 ：1 ) ，摇 匀后制备平板 1 3 菌株分离与测序 西太表层海水富集菌群在实验室以1 0 ( y ) 的转接量，接种到新鲜的O N R 7 a 石油烃液体培养基 中，2 5 ，1 5 0r m in ，避光培养7d 后，按1 1 0 ，1 1 0 ，l1 0 。的梯度稀释富集培养液，并涂布 O N R 7 a 石油烃平板，置于2 5 培养7d 后，挑取平 板上单菌落，并划线纯化2 次厦门表层海水，直接 涂布O N R T a 石油烃平板，2 5 培养7d 后，挑取并 纯化单菌落随后，利用赛百盛硅胶膜型。M 细菌基因 组D N A 提取试剂盒，纯化各单菌基因组D N A ，并通 过P C R 扩增各菌株1 6 Sr R N A 基因全长序列P C R 扩增引物为：细菌通用引物E u b a c2 7 F ：5 A G A G ，I T I T G A T C C T G G C T C A G 一3 ，E u b a e l4 9 2 R ：5 一 A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T 一3 ；扩增条件为： 9 4 。C ，4m in ；9 4 cC ，1m in ，5 5 。C ，1m in ，7 2 q C ，1 5 r a in ，3 0 个循环；7 2 ，1 0r a in ；1 6 ，5m in ll4 P C R 产物经1 琼脂糖凝胶电泳检测后，送公司进行测 序分析 1 4 菌株鉴定及系统发育分析 将所有菌株1 6 Sr R N A 序列提交至N C B Ib la s t 网站( h t t p s ：b la s t n cb in lm n ih g o v B la s t cg i) 和 E z B io C lo u d 网站( h t t p ：w w w e z b io clo u d n e t ) 进行 比对分析，分别得到该菌株相似度最高的序列和模 式菌株信息使用M E G A ( v e r s io n5 0 ) 软件，将所有 菌株及其同源性最高模式菌株的1 6 Sr R N A 序列， 利用C lu s t a lW 进行比对，并利用M a x im u mL ik e ly h o o d 法( K im u r a2 - p a r a m e t e rm o d e l，10 0 0B o o t s t r a p R e p lica t io n s ) 构建系统进化树 4 期 刘仁菊，等：海洋石油降解菌深海弯曲菌的种类多样性及地理分布特征分析 1 5 公共数据库信息获取及系统进化分析 用于本研究分析用的深海弯曲菌的1 6 Sr R N A 基因序列共6 1 条，主要来自以下途径：( 1 ) N C B I G e n B a n k 数据库中目前所有已知的该属序列5 0 条； ( 2 ) 中国微生物菌种保藏库( h t t p ：w w w m ce co r g cn ) 数据库中的序列7 条；( 3 ) 本实验室已有的4 条将上述序列用C lu x t a lW 比对后，剔除相同序列 和长度在8 0 0 b p 以下的序列，用于后续系统进化分 析该属可培养与未培养菌株序列系统发育树的构 建方法参照“1 4 节”中的描述 1 6 核酸序列号与菌种保藏号 实验中分离到的菌株，通过菌落形态观察及测 序比对后，剔除相同菌株，其余所有菌株1 6 Sr R N A 基因序列均提交至N C B I ，获得G e n B a n k 接受号为： K Y 4 5 7 4 1 3 一K Y 4 5 7 4 5 6 对西太获得的3 2 株单菌，除 菌株E P 2 7 - 4 5 、E P - 4 8 和E P 2 7 - 1 3 1 外，其它均保藏 于中国微生物菌种保藏管理中心( M C C C ) 2 结果与讨论 2 1 西太平洋和厦门表层海水石油烃富集菌群中 可培养菌株分离与分析 从西太9 个表层海水石油烃富集菌群和厦门近 海表层海水中，分别分离获得3 2 个和5 个可培养菌 株( 表2 ) ，它们分别包含2 株和1 株深海弯曲菌 其中，分离自西太D Y 2 7 0 il- 4 站位富集菌群中的2 株深海弯曲菌，菌种编号为E P 2 7 - 4 3 1 与E P 2 7 - 4 3 2 ，与模式菌株rm a r in u sI M C C l8 2 6 1 1 6 Sr R N A 基因 的相似度分别为9 6 9 8 和9 7 0 4 ，2 株之间的相 似性为9 9 3 ，为该属1 个潜在的新种分离自厦 门表层海水的深海弯曲菌与模式菌株r m a r in u s I M C C l8 2 6 。相似度为9 9 6 6 对这2 个海域获得的 所有分离菌株进行系统发育分析后发现，它们归属于 叫和仅P r o t e o b a ct e r ia 纲1 0 个属中的2 2 个种，且多属 于常见的烷烃降解菌( 图1 ) 其中，1 一P r o t e o b a ct e r ia 纲 的菌株占总数的9 5 ，主要的优势菌是假单孢菌 ( P s e u d o m o n a s ，2 4 ) 和海杆菌( M a r in o b a ct e r ，1 9 ) 此外，还包括食烷菌( A lca n iv o r a x ) 、加利西亚单孢菌 ( G a lla e cim o n a s ) 、盐单孢菌( H a lo r n o n a s ) 、交替假单孢 菌( P s e u d o a lt e r o r n o n a s ) 、深海弯曲菌( T h a la s s o lit u u s ) 、 海旋菌( T h a la s s o s p ir a ) 和弧菌( V ib r io ) 等7 个属；O t P r o t e o b a ct e r ia 纲只包含海旋菌1 个属 前人研究表明，深海弯曲菌往往是石油烃富集 菌群中的优势类群15 I ，在低温条件下也是如此 M cK e w 等( 2 0 0 7 ) 将泰晤士河河口的海水( 原位温度 8 2 2 ) ，在4 、1 2 、2 0 用原油富集培养9 0d 后，发现深 海弯曲菌是菌群中的优势菌之一，特别是在2 0 2 2 富 集菌群中，其比例可达2 0 3 8 L 5 j 他们同样是 利用泰晤士河口的海水样品，在牢I D H 氮磷源和单独 烃类( C 1 0 一C 3 2 ，姥鲛烷和多环芳烃) 底物后，置于 2 0 2 2 富集培养5 2 5 d ，P C R D G G E 结果表明，深海 弯曲菌在链长C 1 0 一C 3 2 烷烃的富集菌群中均为优 势菌，且富集菌群的克隆文库结果表明，深海弯曲菌 属的克隆在十六烷、烷烃混合物和石油富集菌群中 的比例分别高达4 8 、4 5 和5 5 ；但最终仅有1 株深海弯曲菌ro le iv o r a n sS L H C l6 2 b 被分离。我 们前期对北冰洋表层海水的石油烃降解菌群进行了 研究，在4 2 2 和2 5 下富集后、4 5 4 焦磷酸测序后发 现，在2 4 万条有效序列中，深海弯曲菌占2 4 4 ， 并且几乎在所有富集菌群中都是优势菌，特别是在 4 2 2 菌群中，甚至占到9 0 以上( 未发表数据) 与 M cK e w 等人报道相似，深海弯曲菌难以获得纯培 养，我们仅从2 个富集菌群中分离获得了2 株深海 弯曲菌，ro le iv o r a n sR 6 1 5 。1 叫和r o le iv o r a n s 4 B N 0 6 1 3 有研究指出，深海弯曲菌为海洋专属的烃类降 解菌_ J ，具有寡营养的生理特性，导致其不易在常 规海洋细菌培养基平板上培养目前，G e n B a n k 数据 库中仅能检索到该属的1 3 个分离株，以及3 7 条 1 6 Sr R N A 基因克隆序列本研究以西太平洋和厦门 近海表层海水为材料，在常温2 5 培养条件下，利 用石油烃富集培养和海水直接涂布的方式，成功分 离获取了3 株深海弯曲菌，其中来自西太平洋的2 株代表1 个潜在新种它们可能与来自低温环境中 的其他菌株在生理生化特性上存在较大的区别，这 还有待进一步研究 表2西太平洋和厦门近海表层海水石油烃富集菌群中可培养细菌 T a b 2S t r a in sis o la t e df r o mcr u d eo il e n r ich e dco n s o r t iaf r o mw e s t e r nP a cif icO ce a na n dX ia m e nco a s t a ls e a 5 6 8 应用海洋学学报 3 6 卷 续表2 采样区域菌株 M C C C 保藏号进化关系最近的模式菌株信息 1 6 sr R N A 相似度 一 一 E P 2 7 1 - 5 M C C ClA 1 0 0 1 3M a r in 。b a ct e rh y d r o ca r b o n o cla s t icA T C C4 9 8 4 0 7 9 9 7 9 厦门近海 E P 2 7 1 - 7 M C C C1A 1 0 0 1 4P s P u d o m o n a 5 耵u t z e r iA T C C1 7 5 8 8 7 E P 2 7 2 1 M C C C1A 1 0 0 1 7H a lo r r t o r u ss h e n g lie n s isS L 0 1 4 B 一8 5 7 E P 2 7 3 2 M C C C1A 0 9 9 9 4V ib r ion e o co le d o n icN C 4 7 0 E P 2 7 ，3 - 5 M C C C1A 1 0 0 1 5P s e u o b L m o f u c“s lu t z e r iA T C C1 7 5 8 8 、 E P 2 7 3 _ 6 M C C C1A 1 0 0 0 3P E e H d o n I t e r o ln o r sn r 0 6 如肿如k 5 3 T E P 2 7 3 - 9M C C CIA 0 9 9 9 5M a r in o b a ct e rh y d r o ca r b o n o cla s t icu sA T C C4 9 8 4 0 7 E P 2 7 - 4 - 4M C C C1 A 1 0 0 1 6P s P u d o m o n a ss lu t z e r iA T C C1 7 5 8 8 7 E P 2 7 4 - 5P s e u d o n m r m ss t u L ；e A T C C17 5 8 8 1 E P 2 7 - 4 7M C C C1 A 1 0 0 0 5V ib r ioca m p b e lliiC A lM5 1 9 7 E P 2 7 4 8P s e u d o m o n n ss t u t z e r iA T C C1 7 5 8 8 1 E P 2 7 - 4 1 2M C C C1A 1 0 0 0 4M a r in o b a ct e rh y d r o ca r b o m w la s t icu sA T C C4 9 8 4 0 E P 2 7 5 1M C C C1A 1 0 0 0 6M a r in o b a ct e rh y d r o ca r b o n o cla s t icu sA T C C4 9 8 4 0 。 E P 2 7 5 2M C C C1A 0 9 9 9 7 ，? s e “如，n o ，ln ss f “t z e r iA T C C1 7 5 8 8 7 E P 2 7 ，8 3 E P 2 7 撂4 W P 2 7 - 9 2 M C C ClA 1 0 0 0 7P s e u d o m o n a ss o n g n e n e n s isN E A U S T 5 - 5 1 M C C CIA 1 0 0 0 8A lca n i o 九硝z e n o m u t n sJ C l0 9 。 M C C C1A 0 9 9 9 8M a r in o b a ct e rh y d r o ca r b o n o cla s t ict a sA T C C4 9 8 4 0 7 W P 2 7 - 9 - 4M C C C1A 1 0 0 0 0A lcn R m o r o u e R u s t e n s isI S 0 4 E E P 2 7 一l3 一l E P 2 7 一1 3 1 l E P 2 7 1 3 1 2 M a r in o b a ct e rh y d r o ca r b o n o cla s t icu sA T C C4 9 8 4 0 7 M C C C1 A 1 0 0 0 9 I ib r io f lu v ia lisN B R C1 0 3 1 5 0 + 。 M C C C1A 1 0 0 11M a r in o b a ct e rh y d r o ca r b o r u J cla s t icu sA T C C4 9 8 4 0 7 E P 2 7 1 3 - 7M C C C1 A 1 0 3 2 3P s e u d o n m n 8 ss t u t z e r iA T C C1 7 5 8 8 1 E P 2 7 1 3 - 8M C C C1A 1 0 0 0 1 T h a la s s o s p ir ax ia m e n e n s isM - 5 E P 2 7 1 3 - 9M C C C1A 0 9 9 9 0H a lo m o n a sd e n it r if ica n sM 2 9 1 E P 2 7 1 4 1 3M C C CIA 0 9 9 9 1 A ca r liv o r a xb o r k “m e n s isS K 2 o E P 2 7 1 4 2M C C C1 A 1 0 0 1 2 T h a la s s o s p ir ap e r m e n s isN B R C1 0 6 1 7 5 1 E P 2 7 1 4 4 5M C C C1A 0 9 9 9 24 h a M i，o F a xx e n o m u t a n sJ C l0 9 7 E P 2 7 1 4 - 7M C C C1A 0 9 9 9 3 d la e cim o n a sp e n t a r o r n a t iv o r a n sC E E 一1 3 1 1 1 I S 03 一 I S 0l I S 07 一 I S ( ) 9 一 I S ( ) 1 1 T lu t la s s o lit u mm a r in u sI M C C l8 2 6 + 。 P s e u 6 b 血h e r o m o n n sx h m n cR s hY 2 1 1 0 b r & h a w e y iN B R C1 5 6 3 4 7 O ce a n o b a ct e rk r ie g iiI F O1 5 4 6 7 7 M ( 1 r t m o m o n a sn r cL L cn3 2 8 1 9 9 9 3 9 9 8 6 9 9 9 3 9 9 9 3 1 0 0 0 0 9 9 9 3 9 9 7 9 9 9 8 6 9 9 7 9 9 9 8 6 9 9 9 3 9 9 9 3 9 9 8 6 9 92 5 9 9 9 3 1 0 0 0 0 9 8 0 8 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 9 9 7 9 9 9 5 1 9 8 2 9 1 0 0 0 0 9 9 2 2 9 9 9 3 9 9 3 5 9 9 6 6 9 9 4 3 9 9 8 9 9 9 7 7 9 8 0 7 2 2 深海弯曲菌生物多样性及地理环境分析 截至目前，G e n B a n k 数据库中共包含1 3 个深海 弯曲菌可培养和3 7 个未培养菌株此外，本实验室 前期从北冰洋和太平洋分离获得了8 个菌株，加上 本研究获取的3 个菌株，共2 4 个可培养和3 7 个未 培养菌株为分析其生物多样性，选取了所有可培养 菌株和部分未培养代表序列，构建系统发育树( 图 2 ) 结果表明，它们聚类在3 个明显不同的分支中， 4 期 刘仁菊，等：海洋石油降解菌深海弯曲菌的种类多样性及地理分布特征分析 5 6 9 - 图1 F ig 1 卜鼬 西太平洋石油烃富集菌群和厦门近海表层海水中可培养菌1 6 Sr R N A 基因系统发育树 P h y lo g e n e t ic t r e eb a s e dO il16 Sr R N Ag e n es e q u e n ce so ft h eis o la t e sf r o mt h ecr u d eo il e n r ich e d co n s o r t iaf r o mw e s t e t nP a cif icO ce a na n dX ia m e nco a s t a ls e aw a t e r 标注的菌株均是本次实验分离到的T h a la s s o lit u u s 菌株 5 7 0 应用海洋学学报 3 6 卷 而且每个分支中的菌株多来自同一个类型的环境区 域G r o u p1 包含模式菌ro le iv o r a n sM I L 一17 在内， 均来自于中高纬度海域或低温石油烃富集菌群； G r o u p2 包含模式菌Fm a r in u sI M C C l8 2 6 1 在内，来 自西太平洋及其边缘海，如青岛、厦门和韩国近海； G r o u p3 则来自于夏威夷岛附近海域和未知的分离 地点 h 叫 O 0 5 G r o u p1 中高纬度海域 或低温石油富 集菌群 G r o u p3 夏威夷海域及 未知地点 G r o u p2 西太平洋及其 边缘海 图2 可培养深海弯曲菌与部分未培养菌株克隆序列1 6 Sr R N A 基因系统发育树 F ig 2P h y lo g e n e t ict r e eb a s e dO ilt h e16 Sr R N Ag e n es e q u e n ce so fcu h u r a b lea n dp a r t ia lu n cu lt u r e dT t u d a s s o lit u u sis o la t e s f r o md if f e r e n te n v ir o n m e n t s 标注的菌株均已证明具有烃降解能力或分离自石油烃富集菌群 Y a k im o v 等( 2 0 1 0 ) 报道，深海弯曲菌多分布在 北半球的各种海洋环境中，如波罗的海、巴伦支海、 地中海、黑海、北海、鄂霍次克海等旧但由于其报 道中分离自黑海、巴伦支海和鄂霍次克海的1 3 个菌 株信息并未在公共数据库中提交，所以本研究无法 采用虽然目前所有已知的深海弯曲菌属的菌株或 1 6 Sr R N A 基因克隆序列并不多，但系统发育分析发 现它们具有明显的地理分布特征，即来自同一采样 区域的菌株或序列多聚类于同一分支中( 图2 、表 3 ) 并且，图2 中的G r o u p l，G r o u p 2 和G r o u p 3 中的 菌株或序列的分离生境，呈现出由高纬度向低纬度 过度的特征，即：以模式种ro le iv o r a n s 为代表的 4 期 刘仁菊，等：海洋石油降解菌深海弯曲菌的种类多样性及地理分布特征分析 G r o u p1 ，其中的菌株多来自北冰洋、巴伦支海、北海 和地中海等海域( 纬度范围：6 9 。8 1 。N ) ，比如本实 验室前期从北冰洋表层海水石油烃富集菌群中分离 的R 6 1 5 和4 B N 0 6 1 3 ，从北冰洋深海沉积物中分离 获得的菌株M S 0 1 D 2 、M S 0 1 D 4 和$ 2 5 8 1 5 ；分离自巴 伦支海的菌株K 1 8 8 ，分离自北海英国近海的菌株 S L H C l6 2 b 和D G l6 3 3 G r o u p2 则来自西太平洋及 其边缘海( 纬度范围：1 4 0 3 7 。N 及1 9 0 S ) ，如青岛、 厦门和韩国近海，它们以模式种rm a r in u s 为代表， 同时也包含了本研究从西太和厦门近海分离获取的 3 个菌株( E P 2 7 - 4 3 1 、E P 2 7 - 4 3 2 和I S O 一3 ) ，以及 本实验室前期从西太深海沉积物中分离获得的菌株 T 2 0 G G r o u p3 中的菌株分别来自夏威夷附近海域 ( 1 9 。N ) 表层海水( 序列号H 1 0 1 2 0 ) 和一个未知分离 信息的菌株C 3 9A j 上述结果表明，深海弯曲菌在进化过程中，可能 因适应不同纬度海域的温度或其它环境因子，逐步 进化出了3 个不同的分支未来有必要对更大地理 范围内进行研究，确认纬度或环境温度相关的地理 分布特征 表3 可培养与未培养深海弯曲菌菌株来源信息 T a b 3I s o la t io nin f o r m a t io no fa llcu h u r e da n du n cu lt u r e dT h a la s s o lit u u s 5 7 2 应用海洋学学报 3 6 卷 续表3 G m u p菌株( 克隆) 1 6 Sr R N A 采样地点经纬度 分离来源培养基参考文献 序列长度b p 3 结论 本研究通过对厦门近海和西太平洋表层海水的 直接涂布与富集培养，并对富集产物进行了细菌 1 6 Sr R N A 基因测序及系统发育分析结果表明，从 西太富集菌群分离得到的3 2 个菌株中，主要优势菌 为假单孢菌( P s e u d o m o n a s ) 和海杆菌( M a r in o b a ct e r ) ；其次是食烷菌( A lca n iv o r a x ) 和弧菌( V ib r io ) ；深 海弯曲菌仅有2 株，与模式菌株rm a r in u sI M C C l8 2 6 1 的同源性仅为9 6 9 和9 7 0 ，它们代表 1 个潜在的新种从厦门表层海水分离到1 株深海 弯曲菌，与模式菌株rm a r in u sI M C C l8 2 6 。的相似 度为9 9 6 6 基于对深海弯曲菌部分菌株的系统 发育分析表明，该属存在3 个明显的进化分支，即2 个模式种ro le iv o r a n s 与Fm a r in u s 分别代表的2 个分支和1 个独立分支；此外，不同分支呈现明显的 地理分布特征，即来自同一纬度范围的菌株或序列 多聚类于同一分支中 本研究不仅加深了对深海弯曲菌在不同温度海 洋环境中多样性分布特征的认识，而且为海洋石油 污染生物修复提供了新资源 参考文献： 1 L e a h yJG ，C o lw e llRR M icr o b ia ld e g r a d a t io no fh y d r o ca r b o n sint h ee n v ir o n m e n t J M icr o b io lo g ica lR e v ie w s ，1 9 9 0 ，5 4 ( 3 ) ：3 0 5 3 1 5 2 C r o n eTJ ，T o ls t o yM M a g n it u d eo ft h e2 0 1 0G u lfo fM e x icoo ille a k J S cie n ce ，2 0 1 0 ，3 3 0 ( 60 0 4 ) ：6 3 4 - 6 3 4 3 D uS ，V ie ir aT S t r iv in gf o rle g it im a cyt h r o u g hco r p o r a t es o cia lr e s p o n s ib ilit y ：I n s ig h t sf r o mo ilco m p a n ie s J J o u r n a lo fB u s i h e s sE t h ics ，2 0 1 2 ，11 0 ( 4 ) ：4 1 3 4 2 7 4 X u eJ ，Y uY ，B a iY ，e ta 1 M a r in eo il d e g r a d in gm icr o o r g a n is m sa n db io d e g r a d a t io np r o ce s so fp e t r o le u mh y d r o ca r b o ninm a r in e e n v ir o n m e n t s ：Ar e v ie w J C u r r e n tM icr o b io lo g y ，2 0 1 5 ，7 1 ( 2 ) ：2 2 0 2 2 8 5 M ck e wBA ，C o u lo nF ，O s b o r nAM ，e ta 1 D e t e r m in in gt h eid e n t it ya n dr o le so fo il m e t a b o liz in gm a r in eb a ct e r iaf r o mt h e T h a m e se s t u a r y ，U K J E n v ir o n m e n t a l M icr o b io lo g y ，2 0 0 7 ，9 ( 1 ) ：1 6 5 1 7 6 6 Y a k im o vMM ，G iu lia n oL ，D e n a r oR ，e ta 1 T h a la s s o lit u u so le iv o r a mg e n n o v ，s p n O V ，an o v e lm a r in eb a ct e r iu mt h a to b lig a t e lyu t iliz e sh y d r o ca r b o n s J I n t e r n a t io n a lJ o u r n a l o fS y s t e m a t ica n dE v o lu t io n a r yM icr o b io lo g y ，2 0 0 4 ，5 4 ( 1 ) ：1 4 1 1 4 8 7 C h o iA ，C h oJC 强n f 5 0 胁“Wm a r in w ss p n o v ，ah y d r o ca r b o n u t iliz in gm a r in eb a ct e r iu m J I n t e r n a t io n a lJ o u r n a lo fS y s t e m a t ica n dE v o lu t io n a r yM icr o b io lo g y ，2 0 1 3 ，6 3 ( 6 ) ：22 3 4 - 22 3 8 8 Y a k im o vMM ，G e n o v e s eM ，D e n a r oR T h a la s s o lit u u s M B e r lin ：S p r in g e r V e r la g ，2 0 1 0 ：17 6 5 17 7 2 9 C o u lo nF ，M ck e wBA ，O s b o r nAM ，e ta 1 E f f e ct so ft e m p e r a t u r ea n db io s t im u la t io no no il d e g r a d in gm icr o b ia lco m m u n it ie sin t e m p e r a t ee s t u a r in ew a t e r s J E n v ir o n m e n t a lM icr o b io lo g y ，2 0 0 7 ，9 ( 1 ) ：1 7 7 1 8 6 10 D o n gC ，C h e nX ，X ieY ，e ta 1 C o m p le t eg e n o m es e q u e n ceo fT h a la s s o lit u t a so le iv o r a n sR 6 15 a no b lig a t eh y d r o ca r b o n o cla s t ic n m r in eb a ct e r iu mf r o mt h eA r ct ic O ce a n J S t a n d a r d sinG e n o m icS cie n ce s ，2 0 1 4 ，9 ( 3 ) ：8 9 3 9 0 1 11 S o s aAO M icr o b ia l cy clin go fm a r in eh ig hm o le cu la rw e ig h td is s o lv e do r g a n icm a t t e r D U S A ：W o o d sH o le sO ce a n o g r a p h ic I n s t it u t io n 2 0 1 6 4 期 刘仁菊，等：海洋石油降解菌深海弯曲菌的种类多样性及地理分布特征分析 5 7 3 12 D o n gC ，B a iX ，S h e n gH ，e ta 1 D is t r ib u t io no fP A H sa n dt h eP A H d e g r a d in gb a ct e r iaint h ed e e p s e as e d im e n t so ft h eh ig h la t it u d eA r ct ic O ce a n J B io g e o s cie n ce s ，2 0 1 5 ，1 2 ( 7 ) ：21 6 3 2 1 7 7 13 D y k s t e r h o u s eSE ，G r a yJP ，H e r w igRP ，e ta 1 C y clo cla s t icu sp u g e t ii g e n n o v s p n o v ，a na r o m a t ich y d r o ca r b o n d e g r a d in gb a ct e r iu mf r o mm a r in es e d im e n t s J I n t e r n a t io n a lJ o u r n a lo fS y s t e m a t ica n dE v o lu t io n a r yM icr o b io lo g y ，19 9 5 ，4 5 ( 】) ： 1 1 6 1 2 3 1 4 张晓波，曾湘，董纯明，等南大西洋热液区盲虾虾鳃可培养附生菌多样性分析 J 应用海洋学报，2 0 1 3 ，3 2 ( 1 ) ：7 3 7 8 C r is a f iF ，G e n o v e s eM ，S m e d ileF ，e ta 1 B io r e m e d ia t io nt e ch n o lo g ie sf o rp o llu t e ds e a w a t e rs a m p le da f t e ra no il s p ill inT a r a n t oG u lf ( I t a ly ) ：Aco m p a r is o no fb io s t im u la t io n ，b io a u g m e n t a t io na n duseo faw a s h in ga g e n tinm icr o co s ms t u d ie s J M a r in e P o llu t io nB u lle t in ，2 0 1 6