大学生创业大赛科技创新演示终.ppt

京尼平的制备、纯化及应用Preparationofgenipin,purificationandapplication,项目成员：陈贺徐尤智贺玉兰张巍指导老师：梁华正李媛,2,主要内容,1.项目背景2.实验仪器与材料3.实验原理与方法4.实验结果分析,3,1.1京尼平的特性及应用,京尼平（genipin）来源于茜草科植物栀子，它是一种环烯醚萜类的白色化合物。京尼平能与壳聚糖发生交联反应产生稳定的结构，且京尼平交联壳聚糖水凝胶已广泛用于制作生物医学材料。京尼平作为水溶性天然交联剂，能与蛋白质或氨基酸发生反应，产生深蓝色物质。京尼平能与氨基酸反应，可以用于生产栀子蓝色素。,京尼平,4,京尼平是一种天然生物交联剂。大量研究表明，京尼平可以用于组织工程领域制备人工血管、人工神经导管、人工黏合骨组织颗粒、人造生物瓣膜、生物补片等，临床实验表明，京尼平有优良的生物相容性，效果显著优于传统的合成交联剂，并且对原组织的功能恢复有促进作用。京尼平在医药生产方面也具有很高的价值，特别是在治疗II型糖尿病方面，相比其它合成药物更加天然、有效，且对身体副作用小。,5,2仪器与材料,实验仪器LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津）、UV1600紫外/可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)、酸度计（上海雷磁）、电子天平（梅特勒托利多）、LRH-150-Z恒温振荡培养箱（广东医疗器械厂）、旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）、OlympusCX41显微摄像系统（厦门叁诺西努电子科技有限公司）。,UV751GD紫外可分光光度计,层析柱,高效液相色谱仪,6,实验材料,黑曲霉（中科院）、98%栀子苷（临川之信生物科技有限公司）、98%京尼平（临川之信生物科技有限公司）、黑曲霉（中科院）、pda培养基、海藻酸钠（上海国药试剂）、戊二醛、明胶、乙酸、氢氧化钠、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等大孔树脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD700（沧州宝恩化工）；大孔树脂HZ201、HZ801、802、803（上海华震科技贸易公司）氨基酸:Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val（上海源聚生物科技有限公司）,7,3实验原理与方法,实验原理：京尼平（Genipin）是栀子苷经-葡萄糖苷酶水解后的产物。因此，我们以高纯度栀子苷为原料，采用-葡萄糖苷酶对其进行水解（原理见图）。,8,由于京尼平分子中隐含有独特的戊二醛结构，可以与伯氨基化合物发生反应生成蓝色化合物（反应机理见图),所以可以利用氨基酸与京尼平在特定条件反应制备栀子蓝色素。,9,实验方法：1.采用液体发酵法培养黑曲霉，再利用包埋法制备固定化酶2.采用酶水解法制得京尼平3.采用柱层析和结晶纯化京尼平4.采用京尼平与氨基酸反应制备栀子蓝色素5.采用京尼平交联制备固定化酶,10,4实验内容,1.共固定化-葡萄糖苷酶的制备条件及酶学性质研的究2.固定化酶制备京尼平及其条件的优化实验；3.京尼平纯化条件优化实验；4.京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素的条件探索实验；5.栀子蓝色素稳定性实验；6.京尼平与戊二醛作为交联剂制备固定化酶的对比实验；,11,4.1共固定化-葡萄糖苷酶的制备条件及酶学性质研的究,-葡萄糖苷酶和菌丝共固定化条件的优化明胶戊二醛交联、海藻酸钠包埋法固定化酶实验中，对酶活性回收率影响较大的因素主要有戊二醛质量分数、交联温度以及交联时间3个方面，本实验对上述3个因素进行了优化共固定化-葡萄糖苷酶和菌丝的酶学性质1、共固定化酶的最适温度在30-70范围内，按1.2.4分别测定不同温度下溶液酶和共固定化酶的酶活。2、共固定化酶的最适pH按方法1.2.3，将溶液酶和共固条定化酶分别在pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的乙酸-乙酸钠缓冲液中测定酶活力.,12,4.2固定化酶制备京尼平及其条件的探索及优化实验,1、取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml，pH调到7，分别在25、35、45、55、65、80水解，反应2h取样稀释适当的倍数检测转化率。2、取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml，由3.3.1的最佳条温度，pH分别为4、5、6、7、8、9，反应2h取样稀释适当的倍数检测转化率。3、取共固定化酶10g加入1%的栀子苷溶液30ml，在2.32的最佳pH和3.3.1的最佳条温度的条件下水解，每隔一个小时取一次样，取样稀释适当的倍数检测转化率。,13,4.3京尼平纯化条件探索及优化实验,选取8种树脂，分别称取10g，用无水乙醇处理一个小时，取9个锥形瓶，编号19，将处理好的树脂分别加到18号锥形瓶中，9号做空白参照，每个瓶子分别量取20ml转化液，在200r/min摇床中吸附2个小时后，在238nm处检测吸附液的吸光度。转化液经树脂吸附洗脱后在50下利用旋转蒸发进行浓缩。将得到的京尼平粉末分别溶解到甲醇、乙醇、丙酮、乙醚中直到饱和，观察出晶体的时间及晶体的量。,14,4.4京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素的条件探索实验,用pH7.0的乙酸-氢氧化钠溶液配置0.1mol/L的京尼平溶液300mL。再分别用pH7.0的乙酸-氢氧化钠溶液配置0.1mol/L的各种氨基酸溶液各10mL。分别取10mL0.1mol/L的京尼平溶液与10mL0.1mol/L的氨基酸溶液混合，80水浴反应，每隔1hr取样用紫外可见分光光度计扫描最大吸收波长及吸光度值，直到吸光度值不再增大，即停止反应。按文献方法测定色价。,15,京尼平与氨基酸反应生成栀子蓝色素,16,4.5栀子蓝色素稳定性实验,1.栀子蓝色素色价光照稳定性实验将实验所制得的三种栀子蓝色素粉末各取1.0g平铺成1cm2，分别用自然太阳光暴晒、日光灯照射或紫外线照射，每隔一定时间后取样50mg，配制成溶液并测其吸光度值，计算色素残存率。2.栀子蓝色素色价温度稳定性实验将赖氨酸与京尼平反应后的栀子蓝色素粉末，取1.0g平铺成1cm2，置于30、60、90的恒温箱中保存，每隔一定时间后取样50mg，配制成溶液并测其吸光度值，计算色素残存率。,17,4.6京尼平作为交联剂制备固定化酶条件的优化实验,发酵液过滤后，滤液用DNS法检测-葡萄糖苷酶酶活。取50ml滤液加入终浓度为1%的京尼平交联12h，再与50ml浓度为6%的海藻酸钠溶液混匀，然后用注射器缓慢滴到3%氯化钙溶液中，硬化30min后分离固定化酶和氯化钙溶液，分别测定两者酶活。以1%戊二醛为对照组，按同样方法交联后，分别测定固定化酶和氯化钙溶液的酶活。,18,5结果分析,5.1京尼平的制备实验结果与分析5.2京尼平纯化实验结果与分析5.3京尼平与氨基酸制备栀子蓝色素及稳定性实验结果与分析5.4京尼平作为交联剂实验的结果与分析,19,5.1京尼平的制备优化实验结果与分析,20,21,22,5.2京尼平纯化实验结果与分析,5.2.1树脂吸附京尼平效果分析表2树脂吸附京尼平试验数据,23,5.2.2京尼平结晶,京尼平晶体（使用东华理工大学生物系显微摄像系统拍摄）,京尼平粉末在甲醇中和乙醇中结晶效果差不多，出晶体的时间在3个小时左右，晶体量多，在丙酮中出的晶体最好，但是晶体量不多而且一天才能出晶体，乙醚效果最差。由于甲醇不安全，丙酮的出晶体时间长和量不多，所以乙醇用作京尼平的结晶最好。,玻璃棒上的京尼平晶体,24,5.2.3京尼平纯度检测色谱图,