食品微生物实验总结

1 / 50 食品微生物实验总结 心得体会 本次为期一周的实验课，让我更加深入的了解了酸乳中的各种微生物和丰富的微生物的世界。正如我们所知，微生物也有着不同的特征和生活方式，对人类的生活产生着或好或坏的影响。只有当我们能真正的了解这些微生物之后，我们才可以更好地与它们和谐共处。 这次酸乳中微生物检验实验给予了我许许多多的锻炼，从最开始实验课题的选取，实验材料的寻找，小组分工协作完成实验，到最后实验报告的完善，一切都是我们小组共同努力的结果，所以说这次大型实验给我们带来的益处是无法估量的。 当然在这次实验也暴露出了我们很多的问题。实验前我们准备的资料不充分， 导致了我们实验开始时就手忙脚乱，实验用的原料比例我们都没能很好的把握。不过随后经过我们的不懈努力，最终还是比较圆满的完成了任务。实验中我们先对培养基进行了制备，后来我们计量了菌落的总数并加以分2 / 50 析辨别。并对主要的菌种大肠杆菌、霉菌、酵母菌、致病菌，乳酸菌等进行了测定和研究。本次实验我们忙中有乐，十分的开心。 这次实验还增强了我们小组之间配合的默契程度，我们小组分工合作，有条不紊，通过大家共同的努力 ，我们的实验完成的很快。而且也使我们每个人的动手能力的都得到了较好的锻炼。实验中其他组做的实验也给予了我们很大的帮助，我们在思路比较阻塞的时候，大家相互帮助，给了我们很多恳切实用的建议。并且在不懂的地方老师也耐心细致的给予了我们指导，使我们受益匪浅。这段实验时光让我觉得大家就是一个完美的大家庭，很好的团结在了一起。可以说这次实验不光对于我自己，对于我们整个班级都是一个很好的契机。让我感觉我们的大家庭变得更加融合，更有凝聚力了。 总的来说我们这次实验是比较成功的，但是我们在实验中也存在着很多错误并且也走了不少弯路。这给我们的警示是，在科研过程中要秉着严谨认真的态度，在实验前做好周密的计划，预想到各种状况，避免错误的出现。这样才能更好完美的完成各自的任务。 对于这次实验我有一些建议，我觉得实验中应该进行多种产3 / 50 品的对比和比较，在进行活性检验时应当设置空白对照。这样实验会更加严谨，我们分析的数 据也会更准确，而且我觉得还可以放映一些相关的影视资料，让我们更加深入的了解现代食品行业并根据现阶段的发展情况确定实验的主流方向，使实验更接近现实工业生产。我觉得通过这些我们会更有针对性的完成实验，并且有可能发现不同的问题，并给出比较合理的处理手段和实现方式。 最后我还是很感谢这次实验，因为我们获得了这样一次机会，一个可以证明自己能力的机会。我们相信我们能行，相信自己会把实验任务完成的很出色。我希望这样的实验能不断开展下去，让更多的同学了解微生物，了解我们丰富多彩的食品世界。 食品微生物综合实验报告 项目一 :食品中细菌总数的测定 1 项目二： 革兰氏染色技术 5 项目三：饮用水中大肠菌群测定 7 4 / 50 指导老师：郭永 班级 :食品 1002班 学号： 2016040734 姓名：任冠华 项目一：食品中细菌总数的测定 1. 目的 本方法规定了食品中菌落总数的测定方法。 本方法适合于 各类食品中菌落总数的测定。 2. 设备和材料 温箱： 361 。恒温水浴： 461 。电炉 吸管。广口瓶或三角瓶：容量为 500ml 玻璃珠：直径约 5mm。平皿：直径为 90mm。试管。酒精灯。试管架。灭菌刀或剪子。灭菌镊子。 5 / 50 3.测定步骤 检样稀释及培养 以无菌操作，将检样 25g(或 mL)剪碎放于含有 225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠 )或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 110 的均匀稀释液。 用 1mL 灭菌吸管吸取 110 稀释液 1mL，沿管壁徐徐注入含有 9mL 灭菌生理盐水 或其他稀释液的试管内 (注意吸管尖端不要触及管内稀释液 )，振摇试管，混合均匀，做成 1100的稀释液。 另取 1mL 灭菌吸管，按上条操作顺序，做 10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用 1支 1mL火菌吸管。 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择 2 3个适宜稀释度，分别在做 10 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移 1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。 6 / 50 稀释液移入平皿后，应及时将凉至 46 营养琼脂培养基 (可放置于 461 水浴保温 )注入平皿约 15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营 养琼脂培养基倾入加有 1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照 待琼脂凝固后，翻转平板，置 361 温箱内培养 482h 。 菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 菌落计数的报告 平板菌落数的选择 选取菌落数在 30 300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个 稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个7 / 50 平板后乘 2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线 )，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。 稀释度的选择 应选择平均菌落数在 30 300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30 300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于 2，应报告其平均数；若大于 2则报告其中较小的数字。 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告之。 8 / 50 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30 300之间，其中一部分大于 300或小于 30时，则以最接近 30或 300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 菌落数的报告 菌落数在 100以内时，按其实有数报告，大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩 4.出现的问题 接种过程操作速度太慢，导致培养基与接种液无法充分混合。 平板划线不规律。 仪器使用不熟练，配合不够默契。 5.参照国标得出结论部分食品国标 短数字后面的零数，也可用 10的指数来表示。 瓶装饮用水菌落总数限量是 20CFUmL ， /总大肠菌群不得检出， 耐热大肠菌群 不得检出，大肠埃希氏菌不得检出常温液态奶 10cfu/ml 。 9 / 50 6.结论： 自来水的培养基均未培养出菌落，表示自来水中菌落总数合格。土壤的培养基中发现有大量菌落，则自来水和啤酒中无超标现象，符合卫生标准。 项目二 :细菌涂片制作及革兰氏染色技术 一目的 学习金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌涂片制作、干燥和固定技术。 掌握细菌的简单染色和革兰氏染色技术 二设备和材料 菌种 大肠杆菌 16h 牛肉膏蛋白胨 琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌 16h 牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。 溶液和试剂 10 / 50 草酸铵结晶紫染液，革兰氏碘液， 95%乙醇，番红复染液等。 仪器和其他用品 酒精灯，载玻片， 显微镜，双层瓶，擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。 三测定步骤 1、细菌涂片制作 涂片。用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央 涂成薄层即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面挑出少许 干燥。涂片后自然干燥，也可在酒精灯上略加热，使之迅速干燥。 固定。固定的方法主要取决于勇什么染色方法，常用的有火焰固定法和化学固定法，火焰固定法的主要操作要领是：手持载玻片一端，标本面向上，在灯的火焰外侧迅速来回移动34次，约 34s. 11 / 50 2、革兰氏染色法 涂片 干燥 草酸铵结晶紫 水洗 革兰氏碘液媒染 95%酒精脱色 水洗 番红 水洗 干燥 镜检。 脱色是革兰氏染色关键的一步，可直 接用 95%酒精冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色为止。然后，应立即用水冲洗，以避免脱色时间过长而影响最终染色结果。另外，挑菌量、固定温度、染色时间也是影响结果的重要因素，只有通过反复实践，才能获得满意的结果。 霉菌的培养与形态学观察 实验一真菌培养基的配制与灭菌 实验目的：了解培养基的配置原理和方法，掌握分离培养微生物的有关准备工作。 掌握高 压灭菌方法及原理 实验原理：培养基的制备原理： 12 / 50 1. 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。 2. 从营养角度分析： ?营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分和无机盐等； ?适宜的酸碱度 (pH值 )和一定缓冲能力； ?一定的氧化还原电位； ?合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在 98 100 下融化，于 45 以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反复融化，其凝固性降低。 湿热灭菌原理高压蒸汽灭菌 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温 度也随之增加。在的压力下，锅内温度达 121 。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 13 / 50 实验材料与方法 配制培养基所需器材 实验设备：高压蒸汽灭菌器。 实验器材： 500ml 三角烧瓶、蓝盖瓶、 5ml 刻度吸管、培养基、天平、砝码、 称量纸、药勺、 500ml、 100ml 量筒、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐、平皿、剪刀等。 培养基等集中放讲台前高压桶内，送到洗刷室统一高压 灭菌条件及注意事项 高压灭菌条件： ， 15min 。含糖培养基 113 ， 15min 。 倒平板电炉加热灭菌好的培养基打开平皿包装倒平板 注意事项：空气环境无菌。 a.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。 b.瓶口要过火焰。 c.左手掀开平皿小口。 14 / 50 d.倾注满皿底再多 一点，约 10ml。 e.推放一边要轻缓，不能晃起琼脂挂壁，易在培养过程中污染杂菌。 f.完全凝固再翻转平板放塑料筐内， 4 备用。 分析与讨论如何证明培养基灭菌是否彻底 ? 把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶 )，标上记号，置 25 30 培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现 杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。 经过几次检验都证明能彻底灭菌后 ,以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。 15 / 50 为什么说消毒与灭菌是微生物学和临床医学必不可少的基本知识 ? 由于病原生物广泛存在于 自然界，可通过不同途径和媒介进入人体，引起感染或造成疾病流行。因此，杀灭或清除存在于体外传播媒介上的病原生物，对于切断传播途径、预防和控制其感染具有重要意义。自古以来，人们就利用煮沸、火烧、日晒等方法杀灭或去除微生物，达到预防疾病的目的。实际上，除了在临床医疗实践中需要防止微生物的污染或感染外，在微生物学实验室、食物保存、饮水净化、药品与生物制品生产等过程中都需要避免微生物的污染。 实验二霉菌的接种与培养 实验目的与要求：掌握霉菌与酵母菌的接种与培养方法。 实验原理：接种是微生物实验及科学研究中一项基本操作技术。根据实验目的和要求， 选择合适的接种工具与接种方法，接种工具有接种环、接种针、接种铲、接种钩、吸管、滴管、棉签等。常用接种方法有：斜面接种，液体接种，穿刺接种，平板接种和固体接种。 接种的关键是无菌操作。 16 / 50 无菌操作的原则：在酒精灯火焰旁进 行，所有器皿均须严格消毒，培养基应事先做无菌试验， 接种工具使用前后须经火焰烧灼灭菌，棉塞不能乱放，始终夹在手指中。 在培养四大类微生物时应注意选择适宜的培养条件。多数细菌为专性需氧菌与兼性需氧菌，少数为厌氧菌。多数食品腐败菌和工业用菌种，以及人和动物病原菌的最适生长温度为 37 ，并且在近中性条件下生长良好。多数放线菌为好氧菌，少数为厌氧菌，最适生长温度为 28 30 ，多数适宜在偏碱性环境中生长 。 实验材料与方法 实验材料：实验设备：温箱。 实验器材：毛霉、曲霉、青霉、根霉、啤酒酵母、白假丝酵母、新生隐球酵母菌、细黄链霉菌、 PDA 平板、高盐察氏平板、高氏合成 I 号 平板、塑料筐、 20%甘油水溶液、镊子、接种铲、无菌盖玻片、无菌滤纸、无菌载玻片、石棉网、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐等。 17 / 50 实验方法：平板接种：毛霉 PDA 平板 啤酒酵母 PDA 平板 青霉、曲霉 PDA 平板 小室载玻片培养法： 1、取灭菌后小室平皿。 2、取无菌 PDA琼脂薄层平板，用镊子夹住盖玻片切割成 的琼脂块，并将其移至培养小室中的载玻片上，制作过程注意无菌。 3、用接种环取少量霉菌的孢子接种于培养基四周，用无菌镊子 将盖玻片覆盖在琼脂块上，并轻压使之与载玻片间留有极小缝隙，但不能紧贴载玻片，否则不透气。注意：接种量宜少，尽可能将孢子分散接种在琼脂块边缘，否则菌丝过于稠密，影响观察。先在平皿的滤纸上加 3 5ml 灭菌的 20%甘油，盖上皿盖，标记，置 28 30 培养 3 5d 粮食产品的平板接种： 18 / 50 1. 取粮食样品 20g,放入无菌烧杯，加无菌水洗涤， 反复 10 次，弃去水后，将粮粒倒于平皿内备用 2. 镊子取粮食种入 PDA琼脂内，每皿可接种 5-10粒。 放线菌的接种：取细黄链霉菌划线法 接种，在接种的划线处，无 菌操作斜插入盖玻片数张。 注意事项： 1.空气环境无菌。 2.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。 3.接种环使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金 属丝烧红即可。 4.接种环使用后，先在火焰周围把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。 5.金属杆快速通过火焰 2 3次，杀灭表面微生物 19 / 50 分析与讨论 1、粮食中产毒真菌的种类及产生毒素？ 青霉、毛霉、曲霉、根霉、酵母、白念、细黄链霉菌 青霉素、丝生毛霉素、黄曲霉素、根霉素、白念菌素。细黄链菌素 2、常用霉菌培养基有哪些？ 马铃薯蔗糖培养基 豆芽汁葡萄糖琼脂培养基 察氏培养基 3、霉菌的接种方法有何不同？为什么？ 连续划线法 青霉与曲霉为局限性生长的霉菌 。应采用连续划线接种法接种。 点植法 根霉与毛霉生长区域比较大，应采用点植法。 小室载玻片培养法 20 / 50 实验三霉菌的制片与形态观察 实验目的：学习并掌握观察霉菌形态的基本方法； 了解四类常见霉菌的基本形态特征。 了解放线菌的基本形态特征。 实验原理：霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多 ,常是细 菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉兰具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。 实验材料： 菌种：在马铃薯琼脂平板上培养 3 4天的青霉 (Penicillium sp.)、曲霉 (Aspergillus sp.)、毛霉、根霉； 21 / 50 器材及用具：镊子、载玻片、盖玻片、显微镜。 实验方法： 直接制片观察 于洁净载玻片上，用镊子取霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝，然后小心地盖上盖玻 片。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜 小室培养观察 将载玻片直接放低倍镜下观察，再换高倍镜观察。 观察原则： 毛霉：用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴 等。用高倍镜观察孢子囊孢子的形 状、大小。 根霉：菌丝、孢子同毛霉，注意观察有无假根。 22 / 50 曲霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位置，辨认分生孢 子梗、顶囊、小梗和分生孢子。 青霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生 孢子的形状等。 实验结果： 分析与讨论： 青霉和曲霉的形态有哪些异同？ 青霉常分布在霉腐变质的水果、蔬菜、粮食和皮革等物体上，菌体直立菌丝的顶端长有扫帚状的结构，结构的每一个分枝上，生有成串的孢子，成熟的孢子呈青绿色，进行孢子生殖。 曲霉广泛分布在谷物、空气和土壤中，曲霉直立菌丝的顶端膨大成球状，球状结构的表面放射状地生有成串的孢子，孢子随曲霉种类的不 同而呈黄色、橙色或黑色。 23 / 50 从皮肤取材查真菌如何检查？ 微生物实验总结 姓名 :赵叶锋 班级：食品科学 113 学号： 2016013522 大三的第二学期块结束了，这个学期操作了四个微生物实验，以及一个自主设计性实验。通过前阶段对四个实验的操作和认知的基础上，展开第五个实验的自主设计。实验分别是菌落总数测定，霉菌和酵母的检查和计数，乳酸菌的检验，微生物药敏试验以及探讨环境因素对微生物生长的影响。 这学期的微生物实验是在上学期微生物实验的基础上的累积和扩展延伸：以培养基的制备与灭菌，玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌，微生物接种技术和细菌的革兰氏染色为技术基础进行的，以加强学生基础理论知识和基本技能的培养为目的。 下面我来谈谈我在实验中的心得体会。 24 / 50 第一个实验是菌落总数测定。让我重新认识了一下这个名词：菌落形成单位，我现在的理解就是： 1ml或者 1g待测样品中菌落的个数，一定要注意的是单位是 CFU/ml或 CFU/g。还有就是要掌握好对高压蒸汽灭菌锅的操作。实验之前要充分做好预习工作，以便实验的进行。由于是测定微生物实验，就要尤其小心其他杂菌的混入影响实验结果。因此要做好实验仪器和各种试剂的灭菌，有培养皿，试管，移液枪头，按要求配置好的琼脂培养基和生理盐水，按各自要求用纱布和报纸包扎好，送入高 压蒸汽灭菌锅进行灭菌。玻璃仪器在包扎前要进行清洗，并烘干，以免水分沾湿报纸。灭完菌后取出物品进入超净工作台，超近工作台的紫外灯在进入 20 分钟前开启，并在进入时关闭，以免影响人体。要对台面进行消毒处理，用酒精擦拭。可以在等待琼脂培养基冷却到 50摄氏度左右前对待测样品进行 10倍系列稀释至需要的浓度。要注意的是一定要标记好浓度或者按顺序排列在试管架上以免弄混，同一个试管里吸取样品才能用同一个枪头进行移液。再进行平板接种。待琼脂培养基冷却好后，用右手打开纱布并将锥形瓶拿住，将瓶口靠近酒精灯再进行灭菌，左手拿培养皿用 大拇指和食指稍微打开培养皿盖，将琼脂培养基倒入培养皿中心内，不用倒很多，使琼脂培养基没过培养皿表面即可。培养皿一定是平拿在手上的，倒好后轻轻盖上培25 / 50 养皿盖，缓慢地平方在超净工作台台面边缘处，再推至中间。再用移液枪取 1ml样品快速打入培养皿中央，盖上培养皿盖，然后用手轻轻摇晃，千外不要太大力。然后贴上标签记号，静置。如此依次操作下去。静置一段时间待培养基凝固后倒置放入恒温培养箱培养一段时间再取出进行观察计数。 我们组的实验结果不甚理想，培养皿中的微生物都是连成一片的，或者是培养皿壁上也都长着，主要是由于待测样品打入培养皿后，摇晃不均匀或者太大力了，以至于菌液没分散开来或是跑到培养皿壁上去了。 第五个实验是自主设计实验环境因素对微生物生长的影响。选取 3个环境因素物理、化学和生物因素均可进行设 计。根据前四个实验的基础，通过小组探讨和交流设计出实验方案。并加以验证。通过自主设计实验可以结合小组的智慧，加强团队协作精神和创新思维，通过实验可以验证理论，增加感性认识，培养独立工作能力和思考能力，并使具有过硬的专业技术水平。 通过这次的实验，我明白了任何事情丢不是一蹴而就的，而是一个慢慢积累的过程。虽然实验结果不是很理想，但是我参与了过程，通过小组讨论我们也分析了失败的原因，找到26 / 50 了解决的方法 ，避免了下一次失误。并且从中理解了团队讨论和合作的重要性。以上即是我的全部感想。 1 食品微生物检验定义： 应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和食品中微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响。 2 食品微生物检验的特点： 1.研究对象及范围广 2.涉及学科多样 3.实用性及应用性强 4.采用标准化 3 食品微生物检验的意义： 食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。 首先，它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。 其次，通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，27 / 50 为各项卫生管理工 作提供科学依据，提供传染病和人类、动物的食物中毒的防治措施 。 再次，食品微生物检验是以贯彻 “ 预防为主 ” 的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒和人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重大意义。 总之，食品微生 物检验的目的：为生产出安全、卫生、符合标准的食品提供科学依据。 4 食品微生物检验的范围： 5 食品微生物检验的指标 我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌。 、菌落总数 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得每 g检样中形成的微生 物菌落总数。 、大肠菌群 28 / 50 包括大肠杆菌和产气杆菌的一些中间类型的细菌。寄居于人及温血动物肠道内随大便排出体外。大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。 、致病菌 、 霉菌及其毒素 有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应检验。 6 食品微生物检验的发展： (一 )致病菌检测阶段 指示菌检测阶段 微生态制剂检测阶段 现代基因工程菌和尚未能培养菌的检测 7 微生物检验实验室 微生物检验室基本条件 总要求：对各室的共同要求是高度的清洁卫生，也就是要尽可能地创造无菌条件。 29 / 50 基本条件：微生物检验实验室必须具备显微镜工作，微生物分离培养工作及基本化学工作顺利进行的基本条件。 具体要求： 1、光线明亮，但避免阳光直射室内； 2、洁净无菌，地面与四壁平滑，便于清洁和消毒； 3、空气清新，应有防风、防尘设备； 4、要有安全，适宜的电源和充足的水源； 5、具备整洁、稳固、适用的实验台，台面最好有耐酸碱、耐腐蚀的黑胶板； 6、显微镜及实验室常用的工具、药品应设有存放橱柜。 微生物检验室实验守则 在进行微生物检验时要时刻记住：我们实验的许多对象可能是 病原微生物，如果不慎发生意外，不仅自身招致感染，而且可能造成病原微生物的传播。 30 / 50 检验实验室必须遵守以下守则： 1、包、衣物等勿带入实验室 2、应戴口罩、帽子，换用专用鞋。 3、保持安静、有秩序，禁止饮食、吸烟等。 4、检验前应登记日期、批号，详记检验序号，日期，程序和结果5、室内保持整洁，完毕后清理桌面。 6、无菌室应备有专用开瓶器、金属勺、接种针等，使用前后应灼烧灭菌。 7、无菌室内应备有盛放 3来苏水或 5石炭酸溶液的玻璃缸，内浸纱布数块；备有 75酒精棉球；无菌室每 次使用前后，用紫外灯照射。 8、吸过菌液的吸管，投入上述玻璃筒中，不得放桌上；菌液流洒桌面，用抹布浸沾 上述溶液泡在污染部位，半小时后可抹去。若手上沾有活菌，也应在上诉消毒液中浸泡 10 20min，再以肥皂及水洗刷。 9、遇火险，应立即关闭电门、煤气门，如果酒精、乙醚、汽油等着火，切勿用水，应以沙土等灭火。 10、离开前用肥皂将手洗净，脱去工作服、帽、专用鞋。关闭门窗以及水电煤气等开关。 几种意外情况的处理： 31 / 50 皮肤破伤：先除尽异物，用蒸馏水和生理盐水洗净后，涂以2碘酒。 灼烧伤：涂以凡士林、 5的鞣酸或 2的苦味酸。 化学药品腐蚀伤：若为强酸腐蚀，先用大量清水冲洗后，再用 50g/L碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和；若为强碱腐蚀，也先用大量清水冲洗后，再用 5醋酸或 5硼酸溶液洗涤中和。若受伤的是眼部，经上述处理后，最后滴入橄榄油或液体石蜡 1 2滴。 使用前准备： 用紫外线杀菌灯进行空气消毒，开灯照射 30min后关灯，间隔 30min 后方可进入室内工作； 霉菌较多时，先用 5石炭酸全面喷洒室内，再用甲醛熏蒸；细菌较多时，可采用甲醛与乳酸交替熏蒸。一般情况下，可酌情间隔一定时间用 2ml/m3 甲醛溶液或 20 ml/m3 丙二醇溶液熏蒸消毒。 无菌室的熏蒸消毒主要采用甲醛熏蒸消毒法。 1、加热熏蒸 32 / 50 2、氧化熏蒸 无菌室无菌程度测定 测定无菌室无菌程度一般采用平板法： 灭菌的 15ml 营养琼脂培养基 盖暴露于无菌室内不同地方，10min后，盖好皿盖。倒置于 37摄氏度培养 24h后，观察菌落情况，统计菌落数。每皿内菌落数不超过 4个，则可认为无菌程度良好，若菌落数很多，则应对无菌室进一步灭菌，灭菌后再检验。 常用仪器 超净工作台是箱式微生物无菌操作工作台，占地面积小，使用方便。其工作原理是借助箱内鼓风机将外界空气强行通过一组过滤器，净化的无菌空气连续不断地进入操作台面，并且台内设有紫外线杀菌灯，可 对环境进行杀菌，保证了超净工作台面的正压无菌状态。 高压蒸汽灭菌锅是应用最广、效果最好的湿热灭菌器，可用于培养基、生理盐水、废弃的培养物以及耐高热药品、纱布、采样器械等的灭菌。高压蒸汽灭菌锅的种类有手提式、直立式以及横卧式等多种，它们的构造和灭菌原理基本相同。 33 / 50 高压灭菌锅为一双层金属 圆筒，两层之间盛水，外壁坚厚，其上方或前方有金属厚盖，盖上装有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而器内蒸汽压力可升高，其温度也相应增高。高压蒸汽灭菌锅上还装有排气阀、安全阀，用来调节灭菌锅内蒸汽压力与温度并保障安全；高压蒸汽灭菌锅上还装有温度压力表，指示内部温度与压力。 常用玻璃器皿 微生物检验室所用玻璃器皿，通常以中性硬质玻璃制成。硬质玻璃能耐受高热、高压，同时，其中游离碱含量较低，不至于 影响基质的酸碱度。 试管，培养皿，三角瓶，刻度吸管，试剂瓶，玻璃缸，玻璃棒，玻璃珠，滴瓶，玻璃漏斗，载玻片、凹玻片及盖玻片，发酵罐，注射器及其大小针头，量杯、量筒。 新玻璃器皿洗涤 新玻璃器皿因含有游离碱，应先在清洁液或 2%盐酸内浸泡数小时，再用自来水冲洗干净。 温度计检查法 用一支 150 的水银温度计，使用前先将其水银柱甩到 034 / 50 以下，插入灭菌物品内层，按常规灭 菌，灭菌完毕后，取出观察，确定是否达到要求的温度 2.灭菌效果检验常用方法 将有芽孢的细菌放在培养皿内，用纱布包好，按常法灭菌。灭菌后取出培养皿，经培养后若无细菌生长，即表示灭菌效果良好。 玻璃器皿的灭菌 一般常用的玻璃器皿，在洗净晾干后，才能灭菌。试管、三角烧瓶等，在灭菌之前，管口和瓶口塞好棉塞，在干热灭菌器内 160 ， 2h灭菌。培养皿灭菌前，用牛皮纸或废报纸包好，每二对或五对为一包，排列在灭菌箱搁架上进行干热灭菌。吸移管灭菌前，口上塞一小棉球，每支用纸包扎好，或置于金属盒里，放在灭菌器内灭菌。 几个基本概念回顾： 一、灭菌 杀灭物体中或物体上所有微生物的繁殖体和芽孢的过程称为灭菌，即灭菌是杀灭或消灭一定环境中的所有微生物。灭菌的方法分为物理灭菌法和化学灭菌法两大类。 二、消毒 35 / 50 用物理的、化学的或生物学的方法杀灭病原微生物的过程称为消毒。具有消毒作用的药物称为消毒剂，一般消毒剂在常用浓度下，只对细菌的繁殖体有效，对于细菌芽孢则无杀灭作用。 三、防腐 防止或抑制微生物生长繁殖的方法称为防腐。用于防腐的药物称为防腐剂。某些药物在低浓度时是防腐剂，在高浓度时则为消毒剂 四、无菌 无菌是不含有活的微生物的意思。防止微生物进入机体或物体的方法叫无菌技术活无菌操作。进行微生物学实验操作时，须严格注意无菌操作。 8 食品微生物检验的一般步骤 9 采样的要求 1、严格遵守样品采集的操作规程。 2、所采样品必须具有代表性。 3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。 4、不36 / 50 得加入防腐剂、固定剂等。 5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。 10 食品微生物检验的取样方案 国际食品微生物学规范委员会取样方案； 美国 FDA微生物学取样方案； 世界粮农组织取样方案 ;4 其他方案。 一、 ICMSF 方法 根据危害度的分类，将取样方案分成二级法和三级法。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案，对健康危害低的则建议使用三级抽样方案。 I 类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品； 类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变； 类危害：食用前经加热处理，危害减小的食品。 将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重三档 在进行详细叙述之前，先解释四个代号： n：系指同一批次产品应采集 的样品件数。 c：最大可允许超出 m值的样品数。 37 / 50 m：微生物指标可接受水平的限量值。 M：微生物指标的最高安全限量值。 二级法：设定取样数 n，指标值 m，允许有 c 个样品其相应微生物指标检验值大于 m值。 二级抽样方案 :自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准 m值，超过 m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过 m值的，来判定该批是否合格。 以生食海产品鱼的副溶血性弧菌为例， n=5， c=0， m=100，n=5即抽样 5个， c=0即意味着在该批检样中，不得有超过 m值的检样，此批货物为合格品。如果 c 0 表明该批产品不合格。 三级法：设定取样数 n，指标值 m，附加指标值 M，介于 m与 M 之间的样品数 c。 按照三级采样方案设定的指标，在 n 个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于 m 值；允许有 c 个样品其相应微生物指标值在 m值和 M 值之间；不允许有样品38 / 50 相应微生物指标检验值大于 M值。 例如：冷冻生虾的细菌数标准 n=5， c=3， m=10， M=100，其意义是从一批产品中，取 5 个检样，经检样结果，允许 3个检样的菌数是在 mM值之间，如果有 3 个以上检样的菌数是在 mM 值之间或一个检样菌数超过 M值者，则判定该批产品为不合格品。 11食品微生物检验采样原则 能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装 取样的应按无菌操作进行取样。 12样品的送检要求 1、要快速运送：不要超过 3小时； 2、若路途遥远，可在 15 低温下运送； 3、要注意防污染、防散漏、防变质； 4、要填写检验申请单。 13样品的保留 阴性样品：在发出报告可及时处理； 39 / 50 阳性样品：在发出报告以后 3天才能处理样品； 进口食品的阳性样品：要保留 6 个月才能处理。 微生物检验不进行复检 14 无菌技术 什么是无菌技术 指在微生 物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。 无菌环境 无菌室；无菌柜；超净工作台 1、无菌室 无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间 无菌 室的消毒和防污染 每日紫外线照射 . 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸 . 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。 2、超净工作台 超净台的使用与保养 : 40 / 50 风速保持在米 /秒 ; 使用前开启紫外灯照射 30分钟以上 ; 让超净台预工作 1015分钟 ; 使用完毕后，用 70%酒精将台面和台内四周擦拭干净 . 无菌操作 1、无菌操作目的： 保证待检物品不被环境中微生物的污染； 防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。 2、进入无菌室前的准备 定期检查无菌环境的空气是否符合规定； 用紫外线灭菌处理 3060 分钟； 检查无菌器材是否完备； 洗手消毒； 41 / 50 手部消毒后，再穿戴无菌工作服。 3、检验操作过程的无菌操作要求 在操作中不应有大幅度或快速的动作； 使用玻璃器皿应轻取轻放。 在正火焰上方操作； 接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； 在接种培养物时，协作应轻、准。 不能用嘴直接吸吹吸管。 带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有 5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。 15微生物的接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 常用的接种方法有以下几种： 42 / 50 ）划线接种 ）三点接种 ）穿刺接种 ）浇混接种 ）涂布接种 ）液体接种 ）注射接种 ）活体接种 分离纯化方法： .倾注平板法 .涂布平板法 .平板划线法 16菌落形态学 Bacterial Colony Morphology ? 有荚膜的细菌菌落较 大并且表面光滑，而没有荚膜的则表面较粗糙； ? 具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透明。 ? 没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等； 17细菌的生化反应检查法 由于细菌各自酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌，43 / 50 这种试验称为细菌的生化反应试验。 1. 在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的 PH 值变化。 2. 在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜 色反应。 3. 根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4. 根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。 生化试验的注意事项 1、待检菌应是新鲜培养物。培养 18-24h。 2、待检菌应是纯种培养物。 3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为 24 或 48小时。 4、应做必要的对照试验。 5、提高阳性检出率，至少挑取 2-3 个待检的疑似菌落分别进行试验。 生化试验分类 44 / 50 糖类代谢试验 氨基酸和蛋白质代谢试验 有机酸盐和铵盐代谢试验 酶类试验 18 糖 (醇 )发酵试验 原理 糖类是作为碳源和能量来源提供细菌合成菌体成分必需的原料，由于细菌各自有不同的酶系统，故对糖 (醇 )类的分解能力不尽相同。有的能分解某些糖类，生 成酸又生成气体，有的虽能分解这些糖类但只能生成酸不能生成气体，有的则根本不能分解。借此特点，可作为鉴定细菌的依据之一。该试验检查细菌对加在基础培养基中的特殊的糖发酵 (降解 )后产酸或产酸产气能力。 方法 (1)试剂：糖发酵培养基中，常用的指示剂主要有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫和酸性复红等。前二者颜色反应较敏感，但稳定性较差。后二者比较稳定。特别是对发酵迟缓的细菌，培养时间较长，则以后二者为优。 (2)培养基：液体糖发酵管，半固体糖发酵管，固体糖发酵管，双糖 (或三糖 )高层斜面发酵管。 45 / 50 (3)操作：以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌接种到糖 (醇 )发酵培养基中，置温箱内，按各类菌所要求温度 (通常为 37) 经一定时间 (数小时至二周 )培养，然后观察结果。 记录： 产酸不产气，阳性，以 “+” 表示 产酸产气，阳性，以 “”表示 不产酸产气，阴性，以 “ -” 表示 19 甲基红 (MR)试验 原理：某些细菌分解葡萄糖的过程中产生丙酮酸，丙酮酸进一步被代谢成为乳酸，乙酸，甲酸等。使培养基的 pH 下降至以下，加入甲基红指示剂出现红色为阳性；有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质，最终的酸类较少，培养基 pH 较高，加入甲基红指示剂呈黄色为阴性反应。因此该试验是检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力，某些细菌比其他细菌能够产生更多的酸。