江淮流域鸭种分子生物地理演化过程分析

2 0 0 7 中国禽业发展大会 江淮流域鸭种分子生物地理演化过程分析 李慧芳1张汤杰2 常洪2 陈宽维1 张晶鑫2 徐文娟1汤青萍1 ( 1 中国农业科学院家禽研究所，扬州2 2 5 0 0 3 ； 2 扬州大学动物科学与技术学院，2 2 5 0 0 9 ) 家鸭( 山“p h t y r h y n c h o sd o m e s t i c a ) 在动物分类学上属于鸟纲的雁形目( A n s e r i f o n n s ) ，鸭科( A n a t i d a e ) ， 河鸭属。我国的水禽饲养历史悠久，至少从西周开始就饲养鸭了，至明清时期，我国养鸭最多的是长江 中下游流域以及珠江流域和四J I f 成都平原。同时我国也是水禽资源遗传多样性最丰富的国家，其中鸭 地方品种2 7 个，这些家鸭品种是人们为使鸭更快“进化”培育出的符合人类需要的群体，其卵用和肉用 生产力都较高。另一方面物种的遗传多样性的分布格局还同自然地理环境条件、社会经济条件以及生 态特点等有密切关系，江淮流域湖塘星罗棋布，土地肥沃，气候温暖湿润，雨量充沛，也培育了江淮流域 鸭种高度的生产力。 系统发育生物地理学( P h y l o g e o g r a p h y ) 是研究亲缘关系相近的物种及种内不同种群形成现有地理分 布格局的历史原因和演化过程的一门学科。由于动物体内的线粒体蜊A ( r r n D N A ) 具有母系遗传、变异速 率快、拷贝数目多的特点，常将其作为研究物种系统进化的首选。近年来，线粒体D N A ( m t D N A ) 作为分子 标记及群体遗传学等方法和原理的运用，使得分子系统发育生物地理学可以进一步从种内水平上分析 种群地理格局的形成过程，分化历史，探讨种群现有分布格局的形成原因。我国有丰富的水禽资源，但 这方面的研究工作还比较薄弱，本研究采用线粒体D l o o p 区序列来分析我国江淮流域不同地理9 个家 鸭品种之间的关系，研究家鸭的生物地理学过程，并探讨其品种的分化。 一材料与方法 1 样品的采集和D N A 提取 我们于2 0 0 4 年选取长江中下游流域和淮河流域的9 个地方品种鸭，共采集1 0 6 份血样，一2 0 。C 冰箱 保存。采集地的具体地理位置和样本数见表1 。我们按照相对较大的地理位置将总共1 0 6 个样本分为 三个大的地理单元，即长江南( 攸县麻鸭) 、长江北( 沔阳麻鸭、荆江麻鸭和恩施麻鸭) 和东线( 高邮鸭、巢 湖鸭、淮南麻鸭、文登黑鸭和微山麻鸭) 。 表1 本研究使用的鸭样本 2 8 0 中国毒牧业协会禽业分会 征文选萃 2D N A 扩增和序列测定 采用酚氯仿提取总D N A ，线粒体D N A D l o o p 扩增所用的引物根据S o m a s o n 等设计的引物重新设计 组合，分别为L 7 8 G T I A T I I G G T r A T C , C A T A T C G T C ；H T 4c c A T A T A c G c c A A c c c T c 代，引物名称中L 和H 分 别表示轻链和重链，其后面的数字代表引物3 端在鸡线粒体D N A 全序列中的位置。该片断位于鸭线粒 体D l o o r 5 端附近，扩增出来的P C R 产物长度为6 6 7 b p ，所有P C R 扩增都在E p p e n d o f f M a s t e r c y c l e r 扩增 仪上进行。P C R 反应条件：9 5 q c 预变性5 m i n ，3 5 个循环( 9 4 变性4 5 S ，5 8 6 C 退火4 5 s ) ，最后7 2 。C 延伸 1 0 m l n , 4 。C 保存。采用柱式胶回收试剂盒回收P C R 产物，回收产物在A B IP R I S M3 7 3 0 测序仪上进行测 序。 3 数据处理 测序结果通过C , h l D 软件读取，并对测序结果的每条结果进行人工逐碱基读取和反复核对，以确 保准确无误。D N A m a n6 0 4 0 软件对所有样本序列排列同源序列，并且与C e n B a n kA r m sp l a t y r h y n c h o s 属 线粒体D N AD l o o p 序列进行比较( G B a n k 序列登陆号为A Y 5 0 6 8 6 8 一A Y 5 0 6 8 7 0 ，A Y 5 0 6 8 7 5 5 0 6 8 9 0 ， A Y 5 0 6 9 0 5 一A Y 5 0 6 9 1 8 ) ，用D n a S P 4 1 0 7 软件统计单倍型、变异位点、核苷酸多样性和品种间基因流( N e i ， 1 9 8 2 ) ，序列相同视为同一单倍型( H a p l o t y p e ) ，忽略缺失和插入位点。用M E G A 3 1 软件基于K i m u m 双参 数模型应用最大拟然法构建单元型系统发生树，系统发生时，以美洲黑鸭为外群。单倍型的歧点分布 ( M i s m a t c hd i s t r i b u t i o n ) 分析以及中性检验用A R L E Q U I N 3 0 1 完成。 二结果与分析 整合在核基因组中的线粒体假基因专指线粒体起源并失去功能的核序列，在使用通用引物扩增时 可能会从总D N A 模板中优先扩增出来线粒体假基因，这不仅增加研究工作的难度，有时甚至会给动物系 统发育和群体遗传研究带来负面影响， 导致得出错误的结论。动物线粒体假基 因( N u m t s ) 一般小于6 0 0 b p ，本实验未用 通用引物进行扩增，测序结果图也未观 察到多峰现象。综合分析表明，本实验 投有动物线粒体假基因的干扰。 l 江淮流域鸭线粒体D N A 单倍型度 其在种群中的分布 本研究对江淮流域9 个家鸭品种的 1 0 6 只样本的线粒体D N AD l o o p 区段 ( 6 6 7 b p ) 进行了序列测定。通过对1 0 6 条 序列的同源分析共发现3 4 个变异位点， 约占分析位点总数的5 1 0 ，其中单一 多态位点2 0 个，简约信息位点1 2 个。插 入缺失2 个。确定了3 1 种单倍型，其中 品种之间的共享单倍型9 个，A 7 为所有 9 个品种的主体单倍型，占家鸭个体样本 的4 3 4 。另8 个共享单倍型为乃、z 4 、 Z 9 、Z 1 2 、Z 1 3 、Z 1 5 、Z 1 8 和Z 2 4 ，其余均为某 图1 利用最大拟然法构建的单倍型问的系统树 ( 美洲黑鸭( m mn 嫡p s ) 为外群) 中国畜牧业协会禽业分会 2 3 1 翻曲A盈珊m磁盈川孤ism弓m斟瑚口|号盈；黾；专猫：暑灯翻；s；暑乃；目搿m油 2 0 0 7 中国禽业发展大会 个品种所特有。 2 单倍型间的碱基差异和聚类关系 1 0 6 个样本定义了的3 1 种单倍型，核苷酸差异程度为2 3 5 5 9 8 3 9 ，平均核苷酸差异为3 9 3 5 ，单倍 型Z 1 2 在单倍型进化树上单独成为一支，其它单倍型分别聚为A 1 、A 2 、A 3 三支。 歧点分布分析结果表明种群单倍型碱基差异分布呈单峰分布( 如图2 ) ，对测定的9 个家鸭品种的序 列采用T a j i I l l a s D 值进行中性检验，经检验均不显著( P 0 1 0 ) ，符合中性突变。这些都说明江淮流域 鸭在过去没有出现群体扩张，群体大小稳定。 出现频率 ( F m q u e n e e ) 一观察值( O b s e r v e d ) 模拟值(Modeled) 234567891 0l l1 21 31 41 51 61 71 81 0 碱基差异个数( N u c l e o t i d ed i f f e r e n c e l 图2 鸭线粒体单倍型的歧点分布 3 家鸭品种遗传多样性、品种之间的基因流和遗传分化 江淮流域9 品种鸭单倍型变异度( H a p l o t y p ed i v e r s i t y ) 总体为0 7 9 8 0 0 3 9 ，9 品种鸭单倍型多样度变 化从o 2 8 6 至O 9 1 0 ，单倍型多样度在荆江麻鸭中最高，其次是攸县麻鸭和恩施麻鸭，在文登黑鸭中最 低。核苷酸多样度( P i ) 变化从0 0 9 至0 4 6 ，平均为O 2 8 ，攸县麻鸭的核苷酸多样度最高而文登黑 鸭最低。9 个家鸭品种的平均固定系数F s t 为0 7 3 7 2 ，平均基因流N m 为3 1 4 。而三个大的地理群体固 定系数F 饥为O 0 3 2 4 5 ，基因流N m 为7 4 5 。长江北鸭种和东线鸭种固定系数F h 为0 0 1 3 9 4 ，基因流N m 为1 7 6 8 ；长江北鸭种和长江南鸭种固定系数F s t 为0 0 2 5 8 1 。基因流N m 为9 4 4 ；东线和长江南鸭种固定 系数F s t 为0 ，0 4 0 6 3 ，基因流N m 为5 9 0 。就三个大的地理群体而言，呈三角形分布，东线和长江南鸭种 处于三角形最长的一条边，地理距离最长，基因流最小，呈负相关关系。 表2 江淮流域9 品种家鸭的地理距离( K m ) 和基因流( N m ) 2 3 2e 中国畜牧业协会禽韭分会 娜 奏| 。 征文选萃 表2 为江淮流域9 个品种家鸭的地理距离和基因流的相互关系，图3 为关系图。不同家鸭品种基因 流与地理距离的M a n t e l 检验较弱的负相关性表明，地理距离是影响江淮流域不同品种家鸭内部遗传结 构的因素之一。说明家鸭遗传分化具有一定的地域性差异，地理隔离也对其居群遗传分化有着一定但 不是显著的影响。 地理距离( k m ) 图3 江淮流域币同品种家鸭地理距离与基因流之问的关系 经A M O V A 分析，江淮流域九个鸭品种之间的方差组分仅占1 9 1 ，品种内的方差组分占9 8 0 9 ， 如表3 所示，差异显著( P 0 舾) 。这一方面和家鸭在我国发展的历史较短有关，从历史记载来看，我国家鸭品种形 成大约于明朝，距今也不过千年时间，估计还不足以积累更多的遗传变异，表现为遗传分化程度不高。 另一方面，相对于家畜而言，家禽的遗传距离比家畜要小，在鸡和鹅上也有类似现象，这可能与禽类的流 动性较大有关。 序列分析结果同时显示，长江中游家鸭品种的遗传多样性高于东线品种。一方面这与物种的最适 宜生境的分布有关，长江中游地区处于我国动植物区系的核心部分，东西南北渗透使该地区成为具有东 亚特色的生物多样性最丰富的地区之一。长江中游属于亚热带季风湿润气候，终年湿润，雨热同期。受 e 中国畜牧业协会禽业分含2 3 3 2 0 0 7 中国禽业发展大会 生境的影响相对较小，遗传多样性的损失也较小。二是人工选择，在江淮流域的分布区内，人们常处于 对某种性状的偏好，如对产蛋和产肉性状，将它通过选育的方式固定下来。三是遗传多样性的分布和品 种的大小有关，文登黑鸭濒危，本次研究我们也仅采到7 个样，文登黑鸭单倍型多样度较低显然和现存 数量有密切关系。就线粒体而言，中国鸭种的遗传资源缺乏，共享单倍型有9 个，其中A 7 为主体单倍 型，占4 3 4 。这些都暗示着我国家鸭拥有较近的共同祖先，中国家鸭的起源单一，而各地鸭种的不同 表型应为人工长期选择和自然选择共同作用的结果。 江淮流域的东部地区地势较为平坦，共享单倍型的频率高于长江中游地区，说明了东部地区的基因 交流可能与生态环境和地理交互作用有关。而长江中游更适宜的生态环境使鸭种有机会建立稳定的种 群，并比东线鸭有更多的时间就地发生遗传分化。 以上我们仅从线粒体D l o o p 区序列讨论了家鸭的系统进化关系。由于采用不同方法所获得的分 子系统进化树之间存在一定差异，为了更准确地家鸭品种之问的系统进化关系，还必须综合多方面材料 进行讨论，这正在进一步研究中。 2 江淮流域家鸭系统发生关系 单倍型A 7 是9 个家鸭品种的共享主体单倍型，说明它们来自于共同的祖先，也是一种较为稳定的、 能够适应自然选择和人工选择的单倍型。从各单倍型在最大简约树( M P 树) 中的分布和各单倍型的实 际地理分布来看，地理单元内和单元之间的并没有按照地理分布形成明显的族群，各地理单元的单倍型 都相互散布在不同的分布群中，呈现一种混杂的分布格局。在M P 树上，除了单倍型Z 1 2 单独形成一个 独立的分支外，其余形成3 个大的分支，分支I 以长江中游品种居多，分支中东线品种鸭偏多，而单倍 型在分支上的分布则完全散乱。主体单倍型A 7 位于分支1 1 1 ，其余分支也各有共享单倍型分布。显示 了家鸭品种的单倍型空间分布的复杂性。 39 个家鸭品种的基因流及地理分布的初探 基因流( N m ) 指一个种群的基因转移至另外一个种群，它通常是个体迁移的结果。当N m 值大于1 时，说明群体之间没有明显的遗传分化或遗传分化程度很低，当N m 值小于1 时，表示存在着遗传漂变而 发生了分化，通常N m 值大于4 表明种群之间的基因交流比较充分。 虽然就