质粒介导的促进猪生长的新方法

质粒介导的促进猪生长的新方法 张永亮 ( 华南农业大学动物科学学院，广州5 l o “2 ) 摘要生长激释放因子( G H R H ) 是促进猪生长激素( G H ) 释放的主要激素，具有促进猪生长的作用， 但由于其半囊期较短，限制了其实际应用。基因导八技术的发现和发展，以噩它所带来的显著的经济效益，已 受到人们的重视。质粒介导的G H R H 基因特染技术在优化生产噩动物福利方面已经表现出良好的应用前景。 关键词c H R HG H 猪生长 在家畜生产中使用G H 已经非常广泛，可以有效地提高饲料中氮的利用，而氮利用率的提高可以 促进蛋白质沉积，促进生长和提高生产性能，也可以提高饲料利用率，减少氮产品的浪费。然而，出 于经济方面的考虑，已经缩减G H 的大规模使用。应用生长激素花费高昂，并且在体内半衰期短，需 要反复注射，这样浪费人力资源。此外，长期注射G H 对动物健康还有很多不良反应，例如诱发乳腺 炎，体温过高导致热应激以及引发溃疡等。 G H R H 也可以促进动物的生长，提高动物的生长性能，维持生理反馈，调节生长轴。然而，重组 G H R H 的广泛应用也受到高花费与频繁投药的限制，并且只有频繁投药才可以发挥生物学效应。所 以。我们探索了使用质粒介导G H R H 在体内发挥作用的可行性，这有点类似于重组D N A 疫苗。质粒 介导G H R H 注射青年猪可以改善猪的机体组成、提高猪的生长性能。给妊娠猪注射质粒，可以增加 仔猪下丘脑中生长激素和泌乳细胞的量。此外，还没有发现注射G H R H 质粒给动物带来负面影响。 1G H R 的结构特点 生长激素释放因子( 目r o w t hh o r r n o mr e l e 8 6 i n gf a c t o r ，G R F ) ，又被称为生长激素释放激素( g r o w t I h o n o n er e l e i n gh 0 n e ，G H R H ) ，由下丘脑合成并分泌，能促进脑垂体生长激素( g w t hh o r m o n e ， G H ) 的合成与释放。G H R H 由4 4 ( o r 4 3 ) 个氨基酸残基组成，不同动物和人的c H R H 同源性很高， 种属差异极小“ ，人与猪的G H R H 相差3 个氨基酸，与牛相差5 个氨基酸，与绵羊相差7 个氨基 酸。人、牛和猪的G H R H 前2 7 个氨基酸完全相同。 多种G H R H s 的e D N A 序列也已清楚，砀源性也较高悼。j ，与人G H R H 的c D N A 相比，猪相差1 3 个碱基，相似性达9 0 1 5 ；猪与牛相差8 个碱基，相似性为9 1 5 8 。 G H R H 的活性区域主要位于前l 一2 9 个氨基酸，如表1 所示，c 端氨基酸残基的缺失对其活性影 响不大，而N 端氨基酸的缺失则会大大影响其生物学活性”1 。另有报道指出G H R H ( 1 2 9 ) 几乎保 鲳了G H R H ( 1 4 4 ) 的全部活性。 天然G H R H ( 1 4 4 ) N H ：易于经酶学和化学途径发生结构改变而失活”1 。在血浆中。G H R H ( 1 一“) 很快被二肽酶( d i p e d y l p e p l i d e ) 水解，水解位点位于A l a 2 和A s p 3 。在水溶液中， G H R H ( 1 4 4 ) 还会发生化学重排( A s n 8 一A s p 8 ) 和氧化( M e l 2 7 一M e t ( O ) 2 7 ) ，会大大降低其生 物学活性。因而，为了提高C H R H 的稳定性，有必要对其结构进行改造，对其结构中的某些氨基酸残 基进行替代：替换N 端氨基酸可以阻止酶的降解；8 位和2 7 位残基的替换能阻止化学重排；A h l 5 替 代G l y l 5 能增加G H R H 与受体的结合力。小鼠C H R H 序列中的H i s l ，V a l 2 能完全抵抗D P P 一( 2 4 h 4 9 1 稻藿养与饲j s ；研究进展 作用) 的降解，增强在血浆中的稳定性。小鼠G H R H 中的豇1 1 8 ，大鼠G H R H 中的G 1 蝎( 非天然序列) 能显著增强G H R H 在水溶液中的稳定性，降低异构化的几率。经改造后G H R H ( 1 3 2 ) 一O H 的序 列，包括H j s l 、V a l 2 、n r G 1 n 8 、灿a 1 5 和1 e t 凹，经太鼠垂体G H 释放测定生物学活性，活性提高了 近3 倍，体内活性提高了1 1 一1 3 倍。 T a b l e l E f f e c Io fd e I 曲n 帆G H R Ha 咖坤 注：一N H 2 表示c 端酰胺化，一0 H 表示c 端为游离的羧基。 G H R H 在畜牧业上有着重要的应用价值。P o m m i e r 【l “1S A 报道注射G H R H ( 1 2 9 ) 能增加猪 血清中G H 的浓度，并能使猪的生长提高到1 1 0 ，增加胴体中肉的比例( 6 ) 和胴体长度( 3 ) ， 增加间眼区( 1 3 ) 、肝重( 1 9 ) 、肾脏重量( 3 0 ) ，提高饲料利用率( 2 0 ) ，降低饲料消耗达 2 6 。能增加血清中葡萄糖和胰岛素的水平。G H R H ( 1 2 9 ) 能增加猪的肩部、臀部肌肉重量达 1 6 ，降低脂肪达2 5 。化学分析表明，胴体中蛋白质的重量增加l o 5 ，脂肪降低2 8 7 。给 奶牛注射G H R H 可以增加产奶量达4 4 ”“”1 ，增加饲料的消化率及对N 和能量的吸收，增加N 的 潴留。增加血中I G F I 、胰岛素和I G F I 结合蛋白一l 的浓度。G H R H 增加乳中成分的含量和各器 官的重量，增加脂肪的动员和肌肉组织的重量，增加乳腺的代谢及乳腺细胞数目。 尽管G H R H 在畜牧业上有着重要的应用价值，但由于其在动物体内的半衰期很短，还不能直接 应用于生产实践。 2 质粒介导的外源基因在动物肌肉组织的表达 肌肉组织表达外源基因首次由w o “甜缸发现，将表达质粒直接注射到动物的肌肉组织，可 导致基因的表达。将含有报道基因的质粒注射到小鼠的肌肉组织，检测到了报道基因( B 一半乳糖苷 酶、虫荧光素酶及氯苯乙酰基转移酶) ，表达位于肌纤维内。在成年及新生的大鼠的骨骼肌和心肌也 观察到j ，相同的结果。外源基因在肌肉组织的表达受年龄的影响，质粒D N A 在肌细胞内呈非整合状 态存在，持续表达时间达1 9 个月“”。肌肉组织在表达外源基因上有分化率低、毛细血管丰富、可分 泌多种非肌肉蛋白等特点。另外，骨骼肌纤维具有分裂周期长，容纳大量的特性，这使得它利于合成 和分泌大量非肌肉蛋白。 质粒载体有很多特点，如易于构建、制备成本低、可使用符合G M P 要求的制备方法、安全性好， 能被多种细胞吸收，表达时间受细胞的分化率和棱酸活性决定1 ，不整合人细胞基因组等。反转录 病毒载体不能感染静止期的细胞，所容纳外源基因的大小有限( 小于7 k b ) 。另外，反转录病毒还具 有诱发突变、产生病毒等危险。腺病毒能感染静止期细胞，但具有携带外源基因大小有限、病毒蛋白 诱发机体免疫反应等缺点”“。肌肉组织直接注射基因转染不要求分化的细胞，不引起免疫学问题， 但表达的水平较低。 该方法的缺点是其相对较低的表达水平。在大鼠、猫和猴的肌肉组织中，报道基因的表达水平低 4 9 2 分子营养与新接术研究 于小鼠。实验证明，只有1 0 0 根肌纤维摄取并表达注射的基因，表达只局限于注射针剂。已经报道了 几种方法能提高表达水平，如先注射高渗葡萄糖( 2 5 ) 、将质粒溶于l O 甘油可以提高表达水平并 降低个体问表达水平的差异。布比卡因诱导的再生肌细胞表达水平有显著的提高，提高可达8 0 倍以 上”。应用P L G A 包裹G H R H 表达质粒，也可以起到提高表达水平的作用”o 。电击穿孔技术可以提 高质粒摄取，进而提高表达量达1 0 0 倍到10 0 0 倍。肌内注射质粒电击技术已经在小鼠、大鼠和犬上 得到成功应用。 。这些主要是编码激素、细胞因子和酶等的序列，用于传递治疗基因。此外， 这项技术也成功应用于反刍动物的免疫方面。肌细胞摄取D N A 的机理还不清楚，可能与T 管系统 有关。 质粒注射的另一优势是可以采用组织特异启动子，只能在特异组织中表达。1 。因而，质粒不 在其他细胞表达，可以保障组织的安全性。由普遍启动子启动的质粒，像抗原递呈细胞等细胞可以表 达肽类，并且封闭质粒和转基因产品引起的免疫反应，这可能潜在的破坏周围肌纤维。除了保护表达 位点，我们还应用合成的肌肉启动子，它启动外源基因表达效率要比一些内源性肌肉启动子( 像肌 动蛋白，肌酸激酶以及病毒启动子，例如c M V 启动子) 都高。 由质粒编码的蛋白质从肌肉中分泌，并且经由循环系统到达他们的靶器官。比如G H R H ，它的靶 器官是垂体前叶。肽类合成和分泌也受质粒注射部位肌肉的解剖结构所影响。通过使用可以表达分泌 胚胎碱性磷酸酶作为报告基因，比较了肌肉特异合成启动子在不同肌肉组织的表达情况”“。胚胎碱 性磷酸酶在正常血浆中是不存在的。该酶的活性可以通过一种敏感化学发光法，在注射后2 4 h 内进行 检测。因此，这为评估启动子在体内功能和转染效率提供了一种有效途径。结果表明，在背最长肌、 半腱肌等比较大的肌肉组织中，表达外源基因的效率都比较相似。反之，在像咬肌这种相对较小的肌 肉中表达效率比较低。通过电穿孔介导质粒注射动物( 包括大动物) 可以在体内长效地表达蛋白 并能调节蛋白的分泌水平。 到目前为止，应用该方法已成功地在肌肉组织中表达了血凝集因子、红细胞生成素和胰岛素等， 并已被用于治疗肌肉组织的疾病。另外，还可以为机体提供有生物学功能的蛋白质分子。 3 应用重组蛋白与质粒介导表达的比较 目前已经有大量关于给不同哺乳动物注射重组G H 和G H R H 后增加和储存生长效应的研究。天然 肽类可以被血清中蛋白酶降解，这样就需要相对频繁给药才能产生显著效应。例如，G H R H 的半衰期 为6 1 7 m i n 。为了克服短循环时间这一缺点，有三种策略可以考虑：第一，这种肽必须经过处理， 以保护其不被降解掉，并且可以缓慢长效释放；第二，重组G H R H 肽类形式必须改变氨基酸序列， 以降低蛋白水解作用并延长半衰期”1 ；第三，编码G H R Hc D N A 序列质粒可以用以注射，这可以 增加G H R H 循环、提高内源G H 的释放。我们改进最后提到的方法，并应用于猪、狗及其他动物。 4G 咖在肌肉的表达对青年猪影响 有研究嗌1 比较了体重及机体组成方面的变化，并分析了体内激素和生化指标的变化。将幼龄猪 分成三组，分别注射直接用S P c 5 1 2 作为启动子表达野生型G H R H 质粒抗血清蛋白酶水解的G H - R H 、H v G H R H 以及B 一半乳糖苷酶报告基因质粒。给3 周龄幼猪每头肌内注射1 0 r n g 质粒，并在 注射后用外部电极在皮肤表面进行电极处理。研究发现，血清中G H R H 水平比对照组高2 倍到4 倍， G H 和I G F 1 分泌水平增高3 6 倍。日粮按动物体重6 投放，其中蛋白质占2 4 ，赖氨酸1 _ 6 。 在这种饲养条件下，在注射后6 5 d 时，与对照组相比，注射p S P H V G H R H 组的猪体重提高3 7 ， 比p s P 一卅一G H R H 组提高2 1 。此外，与以往直接投放G H 相比，血清中尿素含量显著下降，这是 由于氨基酸分解代谢减少引起的。 此后，对电击条件进行了优化o 。使用较低的质粒用量，并改用肌肉内电极针头，以此来观察 动物生长及机体组成方面的变化。采用7 一l O 日龄的小猪作为实验对象，分别注射O 1 、l 、3 n 堰 - 4 9 3 猪营养与饲料研究进展 p S P H V G H R H 。注射O ，I m g 质粒组在5 3 d 时体重显著提高( 2 2 4 o 8 k g ，对照组1 9 7 O 0 3 k g ，P O 0 1 ) 。放免测定机体组成，结果表明，体内脂肪减少2 2 ( P o 0 5 ) ，骨内矿物质密 度增加1 0 ( P 0 0 0 4 ) 。注射3 m g 质粒组中有少数猪( 少于5 ) 检测到G H R H 抗体，由于抗体 中和表达的e H R H ，所以与对照组相比，并未发现体重提高。 目前面临的难题是如何把实验室技术在日常生产中加以推广。为了推广这项技术，对1 5 0 一1 8 0 头青年猪进行了实验。每组2 0 头猪，分别注射0 0 5 m g 到2 m gp S P H V G H R H ，并设一对照组。在 猪7 一l O 日龄时注射，并喂以高蛋白含量饲料，其中赖氨酸占1 _ 6 。在1 4 3 d 的饲养试验中，注射 剂量为0 1 ，O 5 ，1 m g 组平均日增重分别提高5 5 一9 O ( 质粒注射组o 8 5 o 0 2 k g d 、对照组 0 7 8 0 0 2 k d ，P O 0 3 ) 。屠宰时皮毛量对照组比质粒对照组高4 4 ( 尸 o 0 0 1 ) 。此外，注射 两个月时，对C D 4 + ：c D 8 + 比值，这一衡量免疫功能的重要指标也进行了测量，结果发现质粒注射 组比对照组提高了2 5 ( P o 0 5 ) 。这些免疫防御增强的数据就可以解释试验组动物生长良好的原 因了。 从最新的关于动物生长曲线研究发现，注射后前3 0 d 是动物生长最为迅速的阶段，体重与时间的 直线回归斜率为o 4 2 9 ( k g d ) ，而对照组为O 3 4 9 ( k g d ) ( P o - 0 2 ) ，提高了2 2 。在注射 后3 0 d 和1 4 3 d 时，斜率分别为0 9 6 ( 蝇d ) ( P o 0 2 ) 和o 8 9 ( k g d ) ，”s p e c t i v e l y ( P O 0 2 ) ，提高了7 。尽管动物体内G H R H 含量仍然在随着动物生长而增加，但造成这种实验后期生 长变化不明显的现象可能是由于外源G H R H 表达量下降而引起的。因此，随着时问推移，体内G H - R H 的有效浓度在降低。由此我们考虑，若要维持G H R H 在体内有效浓度，应该进行第二次质粒 注射。 5 质粒介导G H R H 对两代动物生长效果的比较 从近来注射大鼠和猪o 的研究中发现，当对怀孕动物注射H V G H R H 质粒后，他们的子代动物 体内生长激素和泌乳细胞数量有所增加，同时可以在一段时期内维持体重持续增长。这些研究表明 注射G H R H 不但可以直接在注射部位发挥生理学效应，还可以在母子两代问同时发挥效应。我们给 怀孕8 5 9 0 d 的母猪注射O ，1 培到5 m g 不同剂量的p s P H V G H R H ，跟踪观察仔猪从出生到屠宰的 变化。结果发现注射剂量存在一个阈值。注射5 m g 的剂量组，后代仔猪生长效应都被消除了。仔猪 消失的生理效应包括：提高出生重、屠宰体重；改善饲料利用率；血清中G H R H 和I G F I 浓度；提 高下丘脑生长激素和泌乳细胞数量等。此后，我们又提高样本数( n = 8 0 ) 进行一次实验，实验显 示，注射组比未注射组死亡率下降5 7 ，并且这一现象至少持续到母猪的头两胎。 质粒介导生长激素释放激素注射动物，可以正常地调节生长激素的分泌，并调节动物免疫功能， 而且对动物本身及其后代也没有发现不良反应。因为在动物的生长和繁殖过程中，生长轴G H R H G H I G F I 共同调节动物的组织代谢、蛋白合成。在妊娠期间，母猪机体变化可以影响子宫内及出 生后的动物发育，还可以提高围产期小猪的存活率。同时，G H R H 直接作用后代仔猪垂体细胞，进而 直接地增强动物的生长和福利。注射动物及其后代的发病率和死亡率都有所下降，这对发展畜牧业生 产有很高的经济价值。 参考文献 1 B e nP ，B 眦e 蛐P ，E 盹hF ，r l gN ，W e 呲瑁w B 如dc u i u e m i n 凡H l l I n 卸印w t bh o m I m 他妇i I l g k 蛔 蛐d 鲫帅蜘“n 如mt w 0p 曲c 弛a I i ct l l m o 鹉：i 8 0 l a 虹o n 州c 诅r a c t e d 枷o nB i o c h e I T LB 面p h y & R e & ( k m m u J L ，1 9 8 3 ； n 6 ：7 2 6 2 】E B c hF ，B 0 u 即P ，“n g M ，B 甩z e a uP 趼dG u i 哪i n I LI 砌丑t i 蚰dc h a r a c t 谢z 撕蚰0 f t h eb o v i n eh y 川哪i c 酽D w t hb o n n e 托l e 鹄i I I g 协LB 沁h e nB i o p h 弭R 佩C 眦m 眦。1 9 8 3 ；1 1 7 ：7 7 2 【3 B r a e 肌n ，B o l l l 朗P ，E 靶hF ，胁g N ，w 妇f I b 。r g w Ba n dG l l i u 吼i n I Lc m w t I h o m 耻一r e l e 叫I g f a c t o r h 砌o - 4 9 4 分子营苒与新接术研究 V i 址衄d 衄p 五n eh y P 0 t h a b 哪：i m o n ，靶q I l e I l c ea n d y s i sa I l dt o t a l 岬t h e B 谊B i o c h e 札B i o p h y 8 陆“衄u T L ， 1 9 8 3 ；1 2 5 ：6 0 6 4 B o h l e nP ，w e h m l l b e r gw B ，E B c hF ，“I l gN ，B m 哪Pa n dG u i 哪i n R 砒啉h a l a l l l i og r o w t h1 1 0 n n o n e 一抛l 幽“g 沁t o r ：i 叫砒i 蛆，8 。q u e n c e 帅山幽a n dt o “5 y “t l l 凹I sB i o c h e T I LB i o p h y s R 幅c 0 舢咀，1 9 8 4 ；1 2 5 ：1 0 0 5 5 c u m e m i n R ，B 抛哪P ，B 枷即P ，E 汕F ，u I l g N 蛐d w e l I r c n h e r g W B G m w t l lh 一托l 蛐i 。唱k t o r 如mah 呲 p 叩c r 嘲山ct I I m o rt h 砒c a u 种da e 硎e g a I 卜s c i 即c e ，1 9 8 2 ；2 1 8 ：5 8 5 5 8 7 6 c h 曲c l 岵E u m p 郫mP a ，0 4 5 9 7 4 7 A 1 1 6 ， 7 B l e 血a l lkE u 叩啪P 出眦，0 5 0 9 8 3 1 A 1 6 8 酬a n 学e r L ，L 删c ，k h 锄c 幽La n dG a u d 陀硼P 晰刊州cd 郫d 撕叩0 f 哪g r o w t I lh o 咖o n e r e l e 越“g 柚o r ( 1 2 9 ) m i d e i l l “p i t u i a r ya I l d a l m uB r 且i I lR ，1 9 9 3 ；6 1 6 ( 1 2 ) ：3 9 4 7 9 c 蚰p b e uR M ，B o “g 嘲J ，F e I i xA M R a t i o n a ld 鼬i 驴8 y n L h 曲面，叩db i o l o g i c a le v a I u a t i 叩0 f 肿v e lg r 0 w t hh 叩埘mr d e a s i I I gk 1 0 r d 叼1 B i o p 0 1 y m n ，1 9 9 5 ；3 1 ( 2 ) ：6 7 8 8 1 0 P 0 r I I l n i e rs A 曲dH D u d e 丸E 妊e c t0 ft l l 8 铲n d 帅ehm a l i g n 姐t h y P 酣h e I l i a 蚰d e l e 丌r I i n e db ya 瑚t r i c 即d o n u c J s e 舶s a y 蚰t I - eq u a l 峙c b 删t e s t i c 80 fc o m m e r c mp o r k l o i 腿工A j l i 皿s d ，1 9 9 0 ；6 8 ( 5 ) ：1 2 9 1 1 2 9 8 1 1 D u b r e l l nP ，P e 血c L e r c D ，P e u e n e r G ，G a u d r uP ，F 佃盯c ，M O W l 锄dB r a 舢PE 雠c to f d o 曲d 蛔u 。n q r d a d m i I l i g t r a l i 蚰0 fa p o t e 呲帅a l o g0 fh u n I 蚰印w t l lh 唧o e - 冲l e 商“gf a c t o r 叩h o n n o l l eB e c r e t i o na n dg r o w t hi “p i 挚工 A I l i Ls c i ，1 9 9 0 ；6 8 ( 5 ) ：1 2 5 4 1 2 6 8 1 2 D a l l lG E ，c h a p i nL T ，M 撇l e y w M ，K a m d 缸M B ，T u c k 盯H 丸叫c t 0 一毗j ce 晚恒0 f a ( 1 3 0 ) N H 2 蛐日l o g0 f 州h h 0 一d e 鲫i I l g f a c t 叫i nd a i l y w 工D a i r ys c L ，1 9 9 4 ；7 7 ( 9 ) ：2 5 1 8 2 5 2 5 1 3 L 且一e r r eH ，P e u 商e r G ，A 陆b a tT ，F o u r I I i 盯K ，G a I I d m 硼P ，B m z e 卸Pa n dP e 6 t c l e r c nn ee 如c l0 f f e e d i n t 止e 皿d 弘州h I l o m m I l e 一坤l e 明1 I l gB 址t o r 册l a c 僦i I l g 蛐c o w e JD 缸r y & L ，1 9 9 5 ；7 8 ( 4 ) ：8 0 4 8 1 5 1 4 【砷i e 晰f L P e t i t c l e r cD ，P e t i 盯G ，D e l o m 坤L ，D u h r e u i l P ，M o d 8 B e tJ ，G a u d I e 锄P ，c o u t m Y 址l dB m 咖P E 如d 0 fh u 掣o w t l lh e 一化l 朗8 i ”g k t o r 卸d ( o r ) t h y m t r 叩i n 一肿l e 鹅i “gf a c t o ro nh 0 删加ec 咄e n 圳o mi nd a i r y c a l v JA 1 1 i m L1 9 9 0 ；6 8 ( 8 ) ：2 4 3 6 2 “9 1 5 0 d a t e K ，J 0 h k eT ，O z g 咐A 锄d O l a s l I is - P l 蚰mg 啪血h 伽m m ，i n s L I l i I l l i k e 酬h f t o r I ，a n dn l i l kp r o d u c 蚰 兜5 p 0 1 1 8 e Bb 既o g 即。啊h u m 锄F m h1 1 0 r l 蚰e 一一e 腿i r gf 扯t o r 虹a l o 伊i n 出f yo 呷目E n d o c d n 0 I o g y ，1 9 9 0 ；7 ( 4 ) ： 4 8 5 4 9 5 1 6 w o J A ，M 且l n 呻R w ，w i u i a 鹏P ，c l l 0 “g w ，A c 柚d iG ，J 8 l l iA 姐dF e l 印e rP Ls c i e 眦e ，1 9 9 0 ；2 4 7 ：1 4 6 5 1 4 6 8 1 7 w o J A ，h 血k eJ J ，A e s 丑d ic ，w i i a T 脑P 锄dJ a l l i 九H 眦M O LG e I l e L ，1 9 9 2 ；1 ：3 6 3 3 6 9 1 8 M j l l 盯丸D 甜以N a t u r e ，1 9 9 2 ；3 5 7 ：4 5 5 4 6 0 1 9 V i t “u 0 M 拼以H I 岫G e mT k 丑P y ，1 9 9 4 ；5 ：l l 一1 8 2 0 w 埘J A ，D o w t yM E ，J 舢s ，R e P e t l o G ，B 哪R K ，h d t k eJ J ，w u j 哪P 叩ds h u t t e r b kD B 工c e us c i ，1 9 9 2 ； 1 0 3 ：1 2 4 9 1 2 5 9 2 1 冯立文，张永亮，张玉静，刘松财，欧阳红生G R F 的基因改造及化学合成，中国兽医学报，1 9 9 8 ；1 8 ( 6 ) ： 5 加一5 2 2 2 2 张永亮，张玉静，刘松财，欧阳红生生长激素释放因子在动物体内的表达，中国兽医学报，2 0 ；2 0 ( 4 ) ： 3 6 0 一3 6 4 2 3 D r a g I I i a A “R ，F i o m 仕0M L ，H i uL A ，M a l e 朋，D 蚰v 盱D R 柚ds c h w a r l zR 工M y o g e 血唧惴B i o n0 f 蛆叫e c o a b l 。p m l 帆一瑚i 8 l a n 母“w t l l1 1 0 m m 肿一r e I e 帖i n gl l o n n e 蛐孕n 蜘协l o 唱一t e n ng m w t l li I - p j 铲N a tB i 毗e c h n o L ，1 9 9 9 ； 1 7 ( 1 2 ) ：1 1 7 9 1 1 8 3 2 4 D m g l l i a A k l iR ，“x 明ds c h w a 血R 工E I I I l 蚰c e dg m w t I Ib y t o p i ce x p r e 站i 0 fF o w t hh o 地蚰e 肥l e 曲i g1 1 0 咖eu - 越r - g 删i I l j e c 讪l e m y o g e I l i cv e c 帆N 砒B i o t 髓h n 0 L 1 9 9 7 ；1 5 ：1 2 8 5 1 2 8 9 2 5 w i l b 盯 ，h lM ，蛆ds c h n e i d e rM cD 弼r r i b 蚰u c l e 脚I l i k eI I Ij 3 锄i n d 瑚em 酏叩h 8 伊h a 而e rt 01 i p 0 唧l l a l 眦B - f e 甜叽M O L1 h ：2 0 0 2 ：6 ：3 5 4 2 2 6 v j l q l l i n 丌K e 删dP F ，P 叭蜘咖一J 叩玛M ，c m p d e “n eP ，B o i s N ，D e l a e 地P ，“町J P ，S c h e 啪D ，F i 8 z 蚴M Y ，邮ds c l I y a r b kE k 咖佃m 出r0 f I l a k e d D N A i I l t l l eB k e l e “m u s d 0 f 肌i m a l m 批0 f m u 且c I I l 盯由劬r o p h i 酋 G e 1 1 l n2 0 0 1 ；8 ：1 0 卯一1 1 0 7 4 9 5 括营养与饲料研究进展 2 7 Y a s n | A ，O d 丑K ，u s n 砌哟aH ，K 吐u d oK ，s u w kT 。Y 璐h i d 8T ，P 姓H M 。F u b ；陬K 髓dM 咐m 细工E l 倒a 钯d 目a 8 缸nB e 啪t i o nb y i nv l v 0g e 肿e l e c 仃0 p o m t i - n8 k 山I a l m u 8 c kI n L 工M O LM 砒2 0 0 l ；8 ：4 8 9 4 9 4 2 8 T e r a d a Y ，T a m k a H ，O k 日d oT ，l I l 憾I l i 诅s ，K 唧a l l 啪M ，A k i h T ，s a 驵k is 帅d M 删咖EE 伍c i 衄t 衄d l j 鲫d d e - p e n d B n t 把g u l a t e de 啪T o p 耐e “p r o d u d i 帅b yn 吐e dd I I ai n j e c b 咖舳di n 而v oe l 优t r 0 印m 血礼A 血工d I I e yD 讧2 0 0 l ； 3 81s 5 0 s 5 3 2 9 B a b ；畦L A ，P 叩t a r n l l 0 R ，蹦吐s ，【北l I r B 蚰dv 柚D m n 师“n e I v 曲d e nH u 出I I I d u c d 曲0 f i m m u n e 肼P o n s b y D N Av 托c i n e 日i l 盯驴a I l i 1 a 1 8 V 扯c i n e ，2 0 0 3 ；2 l ：“9 6 5 8 3 0 H a 铲咖mJN ，c o u l o n ，s c a l l a nc ，B u 岍l