枯草芽孢杆菌β1314葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学特性分析

枯草芽孢杆菌B 一1 ，3 1 ，4 一葡聚糖酶基因 在毕赤酵母中的表达及酶学特性分析 乔家运曹云鹤李一航李德发 ( 农业部饲料工业中心，中国农业大学，北京1 0 0 0 9 4 ) 摘萋P c R 扩增获得枯草芽孢杆茵M A l 3 9 的B l ，3 1 ，4 一萄聚糖酶基因D N A 片段，E c o R J 和x b a I 应 酶切后与p c A P z 。L A 相连接，构建成半赤酵母组成型表达栽体P c A P 一姐b t 。将P G A P 一鲫b l 线性化后电击转化毕 赤酵母x 一3 3 感受态细胞。经过抗生素；c i J l 筛选荻得重组茵椿。摇瓶发酵结果显示。分泌蛋白的分子量太小 约3 lk D 8 ，重组酶活性逮到7 7 5 l U m l 。重组B l ，3 1 ，4 一葡聚耱酶的最适反应温度是4 0 ，最适反应p H 值是6 4 。外滩基因在重组毕赤酵母中有很好的遗传稳定性。 美键词枯草芽孢杆菌B l ，3 1 4 一葡聚糖醇毕赤酵母表达 B l ，3 一l ，4 一葡聚糖由葡萄糖分子通过B l ，3 和B l ，4 糖苷键连接而成，是大麦和燕 麦等一些谷物中的主要抗营养因子，不能被畜禽消化道内源消化酶降解。p 一1 ，3 1 ，4 一葡聚糖的 抗营养作用主要表现在三个方面：一是因为不能被畜禽消化吸收而直接降低了这些谷物的能量价值； 二是在畜禽肠道中呈黏性，包裹消化道食糜，使之不能与消化酶充分接触，而降低营养物质的消化 率；三是食糜黏度增加为有害微生物繁殖提供充足的营养，利于有害菌的定居和增殖。B 一1 ，3 1 ， 4 一葡聚糖酶就是能够专一降解B 一1 ，3 一l ，4 一葡聚糖的酶制刺。国内外一些研究报道从芽孢杆菌 中克隆出B 一1 ，3 一l ，4 一葡聚糖酶基因”“J ，并实现了在大肠杆菌”。和酵母菌”。中表达。 本研究将一株枯草芽孢杆菌M A l 3 9 的B 一1 ，3 一l ，4 一葡聚糖酶基因构建到毕赤酵母组成型表 达载体中，实现了该基因在毕赤酵母中的高效分泌表达。 l 材料与方法 1 1 菌种和质粒 大肠杆菌T 0 p l o 、毕赤酵母菌株x 一3 3 由本实验室保存，具有m o c i n 抗性的组成型表达质粒 p G A A 购自I I l “t r o g e n 。 L 2 试荆和培养基 1 M 山梨酵，L B 培养基，m 液体培养基，o c i n + Y P D S 琼脂( 1 Y e 臧e x t r t 、2 P e p t o n e 、 2 D g l u c o s e 、l M 山梨醇( 8 a r b i 吼) 、2 a g a r ，加入l o o 斗吕I I l lz c i n ) 。 1 3 感受态细胞的钼备 。 大肠杆菌T o p l o 感受态细胞按照分子克隆”1 的方法制备。 毕赤酵母感受态细胞制备方法：接种酵母菌入Y P D 培养基中，摇菌过夜，转接人一瓶新的Y P D 培养基中，摇菌至O D 约1 3 时，将菌液倒入5 0 I n l 离心管中，离心集菌，用预冷的d d H 2 0 洗2 次，50 0 0 r P m ，6 n l i n ，用预冷的1 M 山梨醇洗1 次，溶于适当体积的1 M 山梨酵中。 1 4 毕赤酵母表达载体构建与转化 根据G e n B “k 里公开的枯草芽孢杆菌B l ，3 1 ，4 一葡聚糖酶基因的序列，比对后设计一对引 物：B s g l u l ：5 一C G A A T G A G T 丌研一3 和B s 一一1 1 2 ：5 一T r A T r r 几m T A T A G c G c A 一3 。 4 3 1 箍营养与饲料研究进展 以基因组D N A 为模板进行P c R ，反应体系( 5 0 山) ：D N A l 一，P c Rm i x2 5 一，B s g l u ll 山，B s g l u 2l 一，d d H 2 02 2 一，反应程序为9 4 6 0 s e c ，4 0 3 0 s e c ，7 2 9 0 s e c ，4 0 个循环，P c R 在P r c 一 2 0 0P e m e r 热循环仪上进行P C R 产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测。挑取阳性克隆测序出B 一1 ，3 1 4 一葡聚糖酶基因原始序列如图1 所示。 lG G A 邢T r r 棚A 唧T G l 优C A T C A c r 删眦A 代A G c 代A A A C A G G c G G A T c G lG LFMSL C AITSA ASAOTG GS 6 lT 兀T 兀从C C 兀T r C A G C r A T A A C T C C G G n l 田口姒A A A A G C A A A l 、G ( 玎r A C T C C 2 lF F E PF NSYNSG FWOK A NGYS 1 2 lA A 眦A G A T A l 、G 眦A A C T G c A C T T G G C G r c C A A A T A A T G T A T C C G T G A C ( 玎C A 代A ( 船 4 1NG DMF N C TWR A N N VSV TSSG 1 8 lG A A A 眦G 兀T c G C G c T G A C A A G C C C G 盹丌A T 从C A A G m B A C T G C C C O G A G 从C C G C 6 lEMR L A LTSPSY N KFD CCE NR 2 4 lT C C G C T c A “C C T A T G G c T A 田姒C T r r A T c 从G T C A G A T G A 从C C C G c I A A A 从C A C G 8 1 SAOT Y G YGLYEVRMK P A K N T 3 0 lG C G 棚G 帆A T C G r I 娜C A C T r A T A C A G G T C C 从C G G A T G G T A C C C C 兀U O G A T G A G 1 0 lGIVSSFFTY T G PT D G T PWD E 3 6 l 兀C A T A T C G 从T r I T r A C C A A A A G A C A C G A C A 从6 唧A A l T r A A T r A n A T A C A A A T 1 2 1IDIE FLG K DT TKV OF N Y YTN 4 2 lG G C C C G G G A “C C A 他A G A A G G T r G C G G A T 伽G G A n 他A C G C G G 0 c A A T G C 田r c A T 1 4 1G A G N H E K V A D LGF D A A N A YH 4 8 1A C C T A 眦G 1 T C G A T r G G C A G C C G A A C 代T A T A A 从田姗 T G T C G A 盯X ；G C A A T T A 1 6 lTY A F DwQPNSIKWYV D GQLK 5 4 1C A T A C T G c G A C A A G C C 从A T C C C G A C A A C A C C G G G A 从G A T C A T G m A A C 兀E 眦A A T 1 8 1HT A TSOIP T T PGKIMMN LWN 6 0 1G G G A T A G G l B T C G A T G A c T G G c T C C G T T C C r A C A A T G G 田0 T A A A T C C G C T A T A C G ( 叮C A T 2 0 lGlG V D DWLCSYN GV N P LY A H 6 6 lT A T G A C T G G G T G C G C T A l I A C A 从A A A T 从 2 2 lY DWV RY T K N 围I 枯草芽孢杆菌B 一1 3 1 ，4 一葡聚糖酶核苷酸序列及推测的氯基酸序列 F i 蛐弹lN u c l e i ca c 试sn 耐嚣血响t 甜蛐j n oa c i d ss 朗u e n o 瞄0 fK 哪b t 宣】i sB l - 3 一l ，4 一窖l u c 瞅 将p G A P Z d A 质粒用E c o R J 和x b a I 双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收。 将酶切出的P c R 产物与线性化的质粒进行连接，转化人大肠杆菌T o p l o 感受态细胞，划线培养， 菌落p C R 鉴定，获得重组克隆p G A P 一8 u b l 。大量提取p G A P s l l b l ，用限制性内切酶B 8 p H I 酶切。 取约l O 山线性化的载体电击转化毕赤酵母x 一3 3 感受态细胞，涂布含”0 c i n 的Y P D S 平板，3 0 培 养2 3 天。 1 5 重组B 一1 ，3 1 ，4 一葡聚糖酶活性测定 酶活性测定根据L u ( 2 0 0 3 ) 的方法 ，经p H 6 4 溶液适当浓度稀释后的发酵上清液，加入 8 m 柚的底物溶液中，置4 0 恒温水浴锅中3 0 m i n ，用D N S 试剂终止反应。煮沸5 向n 后，测定在 0 D 时的吸光度。对照反应时先在酶液中加人D N s 试剂使酶失活，然后再加入底物溶液进行反应。 单位酶活性定义为，在4 0 和p H 6 4 时，每分钟从8 m 旷I I l l 的B 一葡聚糖溶液中降解释放1 岬0 l 还原 糖所需要的酶量。 1 6 重组B 一1 ，3 1 ，4 一葡聚糖酶遗传稳定性测定 挑取阳性克隆人放有1 0 d Y P D 培养基的锥形瓶中，在2 8 3 0 恒温摇床中培养2 4 b ，作为第一 代培养产物。然后从中取1 0 0 山培养液加入另一瓶1 0 n l lY P D 培养基中，培养2 4 h 后依次传代，共传 4 3 2 分子营养与新接术研究 2 0 代。测定每一代培养液上清液中的酶活性。提取每一代培养液中酵母基因组D N A ，采用P c R 扩增 此B 一1 ，3 1 ，4 一葡聚糖酶序列。 2 结果与分析 2 1 毕赤酵母表达载体的构建 由上海生工全基因合成的此B 一1 3 1 ，4 一葡聚糖酶序列，经测序后正确无误。用E c o R J 和 ) ( b a I 双酶切后，与p G A P Z n A 连接。用菌落P c R 法筛选得到阳性克隆。即构建成组成型毕赤酵母 表达载体。 2 2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 采用电转化方法，将用B s p HI 线性化的p G A P s u b l 转化到毕赤酵母x 一3 3 中，均匀涂布于含 有1 0 0 峙I r I lz e o c i n 的Y P D s 平板上，3 0 培养7 2 h 后，将长出的克隆划线保存。挑取菌落在培 养基中在恒温摇床中3 0 摇菌，取菌液测定酶活性。鉴定出一株产B 一1 ，3 一l ，4 一葡聚糖酶活性 最高的重组毕赤酵母菌株。 2 3 重组毕赤酵母的表达和S D S P A G E 取鉴定出的高产酶菌株，在) D 培养基中摇菌，每隔1 2 h 取样测定酶活性，绘制出产酶曲线 ( 图2 ) 。发现在6 0 h 时的酶活性最高，之后酶活性不再增长。 o V 趟 蜒 罐 01 02 03 0柏5 06 07 08 0 培养时间( h ) 图2B 1 3 一l 。4 一葡聚糖酶酶活性变化曲线 H 鲥件2E 丘缸0 f 血肿帅山eB l - 3 一l ，4 一g l 衄瑚靶a c t I v i t y 取6 0b 的培养物，离心取上清液，根据进行l 丑e m l I l l i ( 1 9 7 0 ) 的方法进行s D S P A G E ”1 。发现 一条分子量3 l k D a 左右的条带( 图3 ) 。此基因预测的分子量约2 5 k D a ，说明可能发生了糖基化反应。 2 4 重组B 一1 ，3 一l ，4 一葡聚糖酶的酶学性质 在2 0 7 0 0 c 范围内每隔l O 测定表达产物的酶活性，绘制曲线。结果( 图4 ) 表明，重组毕赤 酵母表达产物的最适反应温度约4 0 。 采用磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液( p H4 0 8 ，O ) 和甘氨酸一氢氧化钠缓冲液( p H9 O 一1 0 0 ) ， 研究了不同p H 值对此重组B l ，3 1 ，4 一葡聚糖酶酶活性的影响。结果( 图5 ) 表明，在p H6 4 左右，此酶的活性达到最高值。 对此高产重组毕赤酵母遗传稳定性分析表明，传代2 0 代后，酶活性达到第一代的9 6 一1 0 2 。 提取2 0 代培养物的酵母基因组D N A ，用P C R 法均能扩增出此基因。说明B 一1 ，3 一l ，4 一葡聚糖酶 基因已经整合到毕赤酵母基因组当中，传代培养过程中没有丢失。 4 3 3 蚰舳卯蛐加加。 猪营养与饲辎研究迸展 卓 、一 妲 髓 靛 罂 2 030柏 5 06 07 08 09 0 温度( ) 围3B l ，3 一1 4 一葡聚糖酶S D S P A G E 图M 蛋白质珊r k 盯；l ，发酵上清瘕 n 印砖3s D s n 衄0 f B 一1 ，3 1 ，4 一粤啦衄瞬M 皿幽蜘l 盯硼趣m 盥r k 盯；1 ，F o d I d d 幻m 瑚曲廿轴F 珊a 恤血 3 讨论 图4B 一1 3 一1 4 一葡聚糖酶最适反应温度和热稳定性 表示最适反应温度；表示热稳定性 F I 印雎4T 咖p e m 衄t 叩t i m 岫蛐ds 嵋b m t 了o f t kB l ，3 一l 。4 一掣u c 啪 d e n d L 曲t 叫l p e m t u 肿s 讪i l j 竹姐d t e I r l p e m t 山s t a b i I i t y 大麦是我国第四大粮食作物，主要用于酿酒原料和饲料原料，但其中含有大量的B 一葡聚糖，这 种黏性的聚糖体，严重影响了在酿酒和饲料工业中的应用。已有报道显示，在肉鸡大麦型日粮中添加 B 一葡聚糖酶可以提高鸡的生长性能和营养物质代谢率“，在猪日粮中的应用也有类似报道”“。 B 一葡聚糖酶应用于酿酒和饲料工业，要求其产酶活性高，热稳定性和p H 稳定性较高，其中酶 活性和热稳定性是首要考虑的因素。利用高效表达系统作为生物反应器，大规模低成本生产B 一葡聚 糖酶，无疑是解决这一问题的有效方法之一。本研究根据毕赤酵母密码子偏爱性将克隆到的B 一1 ， 3 一l ，4 一葡聚糖酶基因合成后，实现在毕赤酵母x 一3 3 中表达。但是，表达出的酶活性仅达到 7 7 5 1U I I l l 。小于前人在毕赤酵母中表达的酶活性。同时也发现，此重组B l ，3 1 ，4 一葡聚糖酶 在7 0 保存3 0n l i n 的残存酶活力仅达到不足1 0 ，说明此酶的耐热性较差。因此，为进一步提高该 酶的表达量和热稳定性，我们准备从酶的结构上出发，研究决定表达量和热稳定性的关键几个氨基 4 3 4 撕 蚰 0 蚰 蚰 o 一术v艇谜麓雩 1 2 0 1 0 0 术 8 0 藿6 0 茁 霹加 2 0 0 分子营养与新技术研究 3456 圈5 n g m5 酸，进行密码子突变研究。 7891 01 l p H 值 B l ，3 一l ，4 一葡聚糖最适反应p H 值 p o p 岫m0 f t h eB 1 3 一1 4 一咖m m 参考文献 1 u o b e mJ ，P e r 一P 0 璐J A ，Q u e dE ，M o k u l 盯c l 枷唱，瓢p r e s 蛔趴dn l l c k d 耐e8 6 q I l 朗c eo f t h ee n d o B l ，3 1 ，4 一D g l u c a n 唧g e 鹏丘0 B ”i l l 呻h c h c n i f o r m 谊P 砌c d v e8 t r I l c t u r 日l 蛐d y B 0 f 地e n d e dp o l y p e p t i 如E 删 J O I I I T l a l0 fB 1 0 c h e I n i s 竹，1 9 9 1 ，1 9 7 ：3 3 7 3 4 3 2 B 0 r r i 暑eR ，B u e t t I l e r K ，M n t B a e l Ps t f I l c n 珊0 f 吐1 eb e h l ，3 一l ，4 一一u c 衄曲。g e n e0 f B 耐I l 聃I 聃c 哪珊：h 咖k 西髑t od l I l e rb e t a d u c 帆酗睡M o I e c I l l 缸皿dG e n e dc e e t i c s ，1 9 9 0 ，2 2 2 ：2 7 8 2 8 3 3 B u e n o A ，V a 。q I l 忧d eA l l 如mc R ，c 0 nJ ，V m a T G 。d e lR e y Es y n t l l 鹧ba J l d8 e c 陀l i o n0 f 4B a c i 璐c i r c l l I 锄w L 一 1 2 1 ，3 一l ，4 8 一D d u c 阻聃e mE h e d c l I i a KJ 0 邮1 丑l0 f B 肿l 商o l o g y ，1 9 9 0 ，1 7 2 ：2 1 6 0 2 1 6 7 4 c 蚰t w e uBA ，M c c 咖e uD J M o k c u l a rd o l l i T l ga n d 唧嘟越o n0 faB a c m 世8 I I b I i l i sp 一酊u c a n a 铲1 ei nE 如l l e c h i 8c 俨 h e e r I e1 9 8 3 2 3 ：2 1 l 一2 1 9 5 c h 蚰Hz ，uxL ，L j 呻酊a l l lL G 轨u 唧i I l g da l 。3 一1 4 一B D g l u c a I l n 跎( 恤h e n a 鲫) f r o md 忙皿础曲i c f 岫 g 岫O I p i n 唧y 5s 缸缸nP C 一2 ：p m p e r t i 髓0 f t h e 即2 y m e 靠p I e s 8 e d i nE s c h e r i c h i ac o l i 蚰de “d e n o e t l l a t t l l eg e 眦h ab a c 。 t e d a l 耐和】o 岍l 且l0 fB a c t e 血l o 盯，1 9 9 7 1 7 9 ：6 0 2 8 印3 4 6 c 曲懈e uB A ，B r a d G ，M u r p h y N ，M e uDJ c 咖p 丑r i 唧“e p 。哪i 0 f t h e 帅d o B l ，3 1 ，4 一g l 灿 g 即e h 啪B a c m 璐B 血池i n S c h 娜q c 凹c 试雠在呲t h e C Y C l 啦d A D H l 掣叫o t 隅C u 玳n tG e n “c 8 ，1 9 8 6 ，l l ： 6 5 7 0 7 蛐r 0 0 kJ ，R u 8 吕e uD 砒M o l e c u l a rc 1 0 n 沁：A1 8 b o r 咖I y l 帅u a l ，3 I ddc o l d 辆I l gH a r b 叫L a b o m l 0 I yF 恼B ，N 肼 Y o r k 2 0 0 1 【8 L u w Q ，I j DF ，w u Y nI 加u e n c eo f 啪t 盯d c 6 “t y I l d t 衄l p 啪h l r e x y l a l l a 跎b i y m h e B i B i np n o I 一a