植物遗传图谱与分子标记

P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p o n R e s e a r c h 摩尔根的连锁交换定律无 疑是 近代遗传学的 一 个里程碑。 随 着科学家们不断 努力， 遗传学已由 宏观表面现象逐渐发展 深入到 微 观分子 水平， 2 0 0 2 年人类全基因 组的 测序完成标志着遗传学发展进入了 新时代 功能 基因 组时 代， 在 这一发展过程中， 分子标记技术起到了 举足轻重的 作用。 本文主要介绍了 遗传作图 群体的 类型以 及 系统， 主要介绍了 适合自 繁植物的 作图 群体以 及异花授粉植物的 作图 群体。 论述了R F L P , R A P D , S S R , I S S R , A F L P , S R A P 以 及S N P 等标记的 原理、 方法、 优缺点 及其应用范围 等。 关健词 作图群体， 分子标记 P l a n t G e n e t i c L i n k a g e Ma p p i n g a n d Mo l e c u l a r Ma r k e r s G o n g P e n g t a o Z h a n g X u e l i H a i n a n I n s t i t u t e o f T r o p i c a l A g r i c u lt u r a l C o r r e s p o n d i n g a u t h o r , h i t a r h i t a r .o r g Wa n g X i a o l i n g Z h a n g S h u l i n g L i D i R e s o u r c e s , S a n y a , 5 7 2 0 2 5 A b s t r a c t M e n d e l s p e a t r i al , r e s u l t e d i n t h e l a w o f s e g r e g a t i o n a n d l a w o f i n d e p e n d e n t as s o r t m e n t , t h e n b as e d t h e f o u n d a t i o n o f g e n e t ic s . T h o m as H . M o r g a n s l a w o f l i n k a g e a n d c r o s s i n g - o v e r i s n o d o u b t a m i l e - s t o n e o f m o d e m g e n e t i c s . G e n e t i c s i s g r a d u al ly d e v e lo p e d fr o m m a c r o w o r ld t o m ic r o w o r l d , fr o m s u p e r fi c ia l l e v e l t o m o l e c u l a r l e v e l f o l l o w in g t h e n e w fi n d i n g s fr o m s c i e n t i s t s . T h e c o m p le te o f w h o l e h u m a n g e n o m e s e - q u e n c i n g in 2 0 0 2 m a r k e d t h e n e w e r a o f g e n e t i c s , i .e . f u n c t io n a l g e n o m ic s t i m e s . M o l e c u l a r m a r k e r s p l a y e d a n u n s u b s t it u t e d r o l e d u r in g t h i s p r o c e s s . D i ff e r e n t g e n e t i c p o p u l a t i o n s , i n c lu d i n g s e lf f e rt i l i z e d p o p u l a t i o n a n d o u t c r o s s in g p o p u l a t i o n w e r e e v a lu a t e d f o r t h e ir f u n c t i o n in g e n e t i c m a p p in g . T h e p r in c ip l e s a n d a p p l i c a - t i o n s o f m o l e c u l a r m a r k e r s , s u c h a s R F L P , R A P D , S S R , I S S R , A F L P , S R A P a n d S N P w e r e d i s c u s s e d . K e y w o r d s Ma p p i n g p o p u l a t i o n s , Mo l e c u l a r m a r k e r s 1 8 6 5 年， 孟 德 尔 用 豌 豆 伽u m s a d v u m ) 进 行了 一 系 列的 实 验， 提出 了 “ 特殊因 子” 导 致 产生 特定 性 状的 假设， 确立了 现代遗传学的 基础。 孟德尔的思 想一直是生物学中 联系遗传因 子功能 和可见性状的 核心思 想。 在孟德尔时 代， 遗传研究限 制在对植物的可见性状调查的 基础上。 孟德尔对当时 作为模式 植 物的 豌 豆8 个 可 见 性 状: 花的 颜 色 ( 同 时 也 是 种 皮 颜 色 ) 、 种 子 颜 色、 种 英 颜 色、 种荚 形 状、 种 子 形 状、 花瓣颜 色、 植株高 度和花在植株上的 位置进行了 研究。 这些性状实际上就是第一批遗传标记。 在其实 验的基础上， 孟德尔提出了 两条遗传规则， 这两条规则对于所有非连锁遗传位点都是适用的。 一个是 分离定 律: 在配子形成的 过程中， 一个基因的 两个等位基因 分离， 也就是两个配子各得到一个等位基 因; 另一个是独立分配定律: 不同性状的基因独立分配。 1 9 0 3 年， 沃 尔 特 苏 顿 ( W a l t e r S u tt o n ) 和 希 尔多 博 弗 利 ( T h e o d o r B o v e r i) 提出 了 染 色 体 遗 传 学 说 的 假设。 这个假设 基于在光学显 微镜下， 可以 看到并区分染色体， 它们从一代传到下一 代， 同时 传递某 种 性 状。 据此 推睽 孟德尔因 子” 存在于染色体上。 1 9 0 5 年， 人们第一次发现了 有关染色 体部分重组形成 新的 遗传 组合的 证 据。贝 特森( W .B a t e s o n ) 、 桑 德斯 ( E .R . S a u n d e r s ) 和 普内 特( P .C .p u n n e tt ) 在对香 豌豆 P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p o n R e s e a r c h S t u b e r e t a l ., 1 9 7 2 ) 。 然 而 在 除 禾 本 科 及 果 蝇 外， 在 其 它 物 种中 可 用 于 标 记 分 析的 同功酶数目 非常有限。 以 前的形态标记和同功酶标记都是建立在核普酸序列多态的基础之上的，他们都只是核昔酸序 列多 态的表现形式。 分子生物学的迅速崛起提供一系列更加宽广的在D N A水平评估遗传状态的技术 手段。 第 一 个D N A .多 态性 标记是限 制性 片 段多 态性 ( R F L P ) 标 记( B o t s t e i n e t a l ., 1 9 8 0 ) 。 这 种 技术 是 使 用一个特异性的 探针去和不同基因型的限 制性的酶切的 基因组D N A杂交。 依据探针的情况， 这种探 针可以 援盖整个基因 组， 编码和非编码都可以 被分析。 以 这种标记为基础完成了 第一张人类的分子标 记连锁图谱， 标志利用D N A分子标记进行遗传分析时代的来临。P C R扩增D N A是分子生物学的又 一次 技术 革 命， 直接带 动了以D N A 分 子 序列 为 基 础的 标 记发展: R A P D ( W i l l i a m s e t a l ., 1 9 9 0 ; W e l s h a n d M c C l e l l a n d , 1 9 9 0 ) 和A F L P ( V o s e t a l . , 1 9 9 5 ) 。 近来 检 测单 核 昔酸多 态 性 ( S N P ) ( R a f a l s k i , 2 0 0 2 ) 的 方 法得到很大的发展， 对S N P 的检测是自 动化和高通量的如D N A芯片技术， 这就大大减轻了大量繁琐 的操作， 建立高密度的遗传图谱成为可能。 R A P D和A F L P 是基于未知序列片 段， 而R F L P 和S N P 可以 选取表达的 基因 作为 标记进行分析。 如果知道基因的序列和其假定可能影响的有兴趣的性状， 就可以选作标记用于作图， 根据这种方法功 能图 谱 就可以 构 建 起来( C h e n e t a l ., 2 0 0 1 ; S c h n e i d e r e t a l ., 2 0 0 2 ) 。 结 合分离 群体的 表 型数 据 和标 记数 据， 就可以判别潜在的候选基因是否影响单基因或多基因性状。 遗传作图的基础即是同 源D N A序列在减数分裂时期的重组。 一个染色体上的两个位点重组事件 发生的 可能性决定于他们的物理距离， 因此遗传连锁图谱可以 作为物理图 谱的一种参考。 但把基因组 作为一个整体来看， 由于染色体结构的影响其重组频率不是一成不变的。 例如在异染色质的临近区域 重组是受到抑制的。 基于重组概率的 连锁分析和连锁座位排列是 通过最大似然方程式进行评估的 ( F i s h e r , 1 9 2 1 ; H a l - P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p o n R e s e a r c h M o r t o n , 1 9 5 5 ) 。 大 量 的 分 离 群 体 的 数 据 被 输 入 计 算 机 程 序 计 算 遗 传图 谱， 在 众 多 的 作 图 软 件 中J o i n M a p ( S t a m a n d v a n O o ij e n , 1 9 9 5 ) 和N I A P M A K E R ( L .a n d e r e t al ., 1 9 8 7 ) 是 最 常 用 的 两 个 。 1 植物遗传作图群体 作图 群体的 亲 本和 群体在作图 中占 有 十分重 要 地位。 不同 亲本 和群体的 选 择取 决于作图 的目 的 : 是 构建框架图 谱为以 后的 物理图 谱服务， 还是为了 利用图 位方法克隆 基因， 或是定 位Q T L 利 用标记 进行 分子 标记辅 助选择育 种。 不论 哪种情况， 作图 群体中 要研究的 性 状在两个亲 本中 必须是多 态的 ， 并且是 可 遗传的。 两个亲本的 性 状差别 越大， 控制这一性 状的 遗传因 子在分离群体中 会得到充分的 描 述， 也就 越是容易鉴定。 这种原 理不 仅适用于单基因 性状， 也同 样适用于多 基因 性状。 另外一个在构建作图 群体时需 要考虑的 是植 物的 繁殖方式。 一种是自 然自 繁， 如 拟南芥、 番 茄、 大 豆， 或通过人工可以自 繁的 甜菜和玉米; 另一类是自 交不 亲和的 植物如马 铃薯。自 交不亲 和的植 物表 现出 高 度的 遗传杂合性， 这类物种常常由 于近交衰退的原因 而不可能产生纯合株系。因 此， 仅有自 交 亲和的 植物才能在后 代中 表现出 最大程度的 纯合性。 总的 来说， 植 物种类决定了 作图 群体的 选择。 总之作图 群体作为 遗传学研究的 最基本的 研究对象， 在帮 助人们理解特定表型 现象和复杂 基因 组方面有不可替代的作用。 1 . 1适合自挤植物的作圈群体 1 . 1 . 1 F : 群体 最简单的 作图 群体就是F : 群体。 正是以 这种类型的 群体为 基础， 孟德尔建 立了 经典遗传学的 基 础。 F : 群体 构建的 要求其亲本尽可能 在所有要研究的 性状方面都是有差异的， 并且两 个株系 是纯合 株 系。 两个亲 本的多 态性程度可以 在表型水平或 通过分子标记在核普酸水平来评估。 对 大豆和十字花 科 植物等自 交植物， 遗传距离 较远的 亲本的 杂交有助于增加多 态性， 但前提条件是杂 交的 后代是可 育 的， 这样杂交得到的 后代就是F ， 代。 如果两个亲本是真正 纯合的， 那么 所有的F ， 代的 个体都应该有一 样的 基因 型和同 样的 表型特征。 F : 个体自 繁得到F 2 群体。 F Z 群体在重组过 程中 经过了 一次 减数分裂， 理想的 情况是 对一个 共显性标记来说其在 群体中的 分离比 应该是1 :2 : 1 。 由 于瓦个体自 交得到的 后 代 将出 现分离，因 此一般来讲F Z 群体不易保存。 但也有例外 如甜菜， F : 群体可以 通过组织培养得到 拷 贝， 在需要的时间 再生。 另外一 个保持F : 群体的 策略就是建立F 3 池。 要利用几群体建立一个覆盖全基因组范围的图 谱， 1 0 0 个瓦个体是一个理想的 群体个体数目 。 在这一点上， 连锁 位点的 密度和作图的 工作量 达到了 平衡。 如果是利用瓦群体进行Q T L 定 位的 话， 至 少2 0 0 个 个 体 植 株 是 必 需 的 ( B e a v i s , 1 9 9 4 ) 。 对以 图 位 克 隆 特定 基因 的 作图 来 说， 几 千 个 后 代 植 株 是 需 要的 。 例 如 在 对 番 茄 的 果 重 座 位的 精 细图 谱 定 位中 使 用了3 4 0 0 个 植 株 ( A l p e r t a n d T a n k s l e y , 1 9 9 6 ) . F 2 群体 提供的 遗传信息 最为丰富， 可以 估算加性效应及显性效应， 这在杂种优势机理研究中 有着其它 群 体不可替代的作用。 1 . 1 .2 R E L 群体 重 组自 交 ( r e c o m b in a n t i n b r e d l in e s , R I L s ) 由F Z 代 群 体 衍 生 出 来 的 纯 合 株 系 组 成 的 群 体 。 重 组自 交 系 群体作图 最初应用于小鼠 的 遗传学研究。 在动物中， 大约经过2 0 代才 达到可以 使用的 纯合化。 在植 物中， 重组自 交系除完 全自 交不 亲合外一般是通过自 交产生。 在自 交 过程中 一个株系的 一粒 种子就是 下 一 代的 来 源， R E L 也 被 称 为 单 粒 传 代系 ( s i n g l e - s e e d d e s c e n t l in e s ) 。自 花 授 粉 使 得R I L 可以 在 一 个相 对较短的世 代产生， 实际 上， 一般在6 代时 就几乎可以 达到完全的 纯合。 经过多 代的 遗传， 在重组自 交 系的 株系中 重组已 不再能改 变遗传物质的 组成， 进一步的 分离现象不再发生。 因 此R E L 家系很容易 就 P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p o n R e s e a r c h H e u n e t a l ., 1 9 9 1 ; Mc C o u c h e t a l . , 1 9 8 8 ) 0 1 .2 异化授粉植物作图群体 由 于自 交不亲合或自 交衰退的原因，对一些植物物种来说是不可能产生纯合株系的。因此在苹 果、 葡萄、 梨等物种中， 常使用杂合的亲本杂交产生的F , 和回交群体作为作图 群体( M a l i e p a a r d , 1 9 9 8 ; Y a m a o t o e t a l . , 2 0 0 2 ; G r a n d o e t a l ., 2 0 0 3 ) 。 对其它 一 些林 木 等植物， 由 于具 有 很长的 世代间隔， 很高的 遗传杂合性和遗传负荷; 人工杂交比较困 难， 难以 获得足够大的 家系， 从而产生不平衡的交配设计， 获 得遗传参数准确性不高， 因此利用自 然条件下已 存在的 群体进行Q T L 定位是非常实用、 有效的。 2植物遗传作图的分子标记系统 生命的遗传信息存储在核昔酸序列中， 遗传变异是生物体基因组进化的推动力量， 核昔酸序列的 不同 构成了 动植物在物种间 和物种内 的自 然多 态性。 因 此从 严格意 义上来讲， 所有类型的 标记都是基 于 核普酸水平的 序列差异， 只是检测手段不同 而已 。 随 着生物遗传研究在D N A水平上展开， 分子标记 替代了形态标记和生化标记而成为研究的主流。 随着这些有效的新方法的使用， 主要的作物种越来越 多的基因被定位和克隆。遗传连锁分析成了研究控制重要农艺性状基因的常规工具。 自1 9 8 0 年B o t s t e in 提出R F L P 到 今天已 经发展出了数十种D N A标记系统， 这些标记系统各有 优缺点( 表1 ) 。 根据检测多 态性的分子检测技术的 不同，这些标记可分为基于杂交的D N A标记如 A F L P 和基于P C R扩增的D N A标记如S S R , A F L P 和R A P D等。 基于费用比、 基因型检测过程的 繁琐 度、 大 规模基因 型检测的 信息 完整度等综合考虑， A F L P , R A P D , S S R , A F L P 这四 类标记是 在遗传作图 P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p 。 R e s e a r c h 限制性酶的酶切; 对酶切片段的电 泳分析。 通过P C R - R F L P 产生的 标记又称为C A P S ( c le a v e d a m p l i f ie d p o ly m o r p h ic s e - q u e n c e s ) ， 在对突变位点 和S N P 的 分析作图中， 这种标记具有中 等程度的 高通量性和低成 本等特点 ( N e ff e t a l ., 1 9 9 8 ) . P C R - R F L P 揭示的 是 特异P C R产物D N A序列内 限 制性酶切位点 变异的 信息， 也 表 现为限制性片段长度的多态性。 2 . 1 .2 错配P C R - R F L P 在C A P S 技术中， 仅D N A序列内限 制性酶切位点 变异的 信息能被检测出 来， 但是大多 数的 单核 普酸变化并不是产生限制性酶切位点的 不同。 因 此为了 弥补这一缺点， 人们在C A P S 的基础上开发了 一 项 称 为d C A P S ( d e r i v e d c l e a v e d a m p l i fi e d p o ly m o r p h i c s e q u e n c e ) 的 标 记 技 术。 在 这 项 标 记 技 术中 ， 人 们在区分由 单核普酸突变引起的， 但又不产生酶切位点改变的等位基因的引物序列中引入一个或多 个 错配 碱基 ( N e ff e t a l . , 1 9 9 8 ) 。 错配P C R 扩增 产 物选 择有 合适酶 切位点的 限 制性 酶 进 行酶 切， 随 后 凝 胶电泳分析。 因为共显性的特点， 杂合的植株也可以通过这种方法很快的鉴别出来， 因此d C A P S 标记 也很适合精细作图。 2 . 2 RAP D R A P D ( r a n d o m a m p l i fi c a ti o n p o ly m o rp h i c D N A ) 是 最早 通 过P C R 扩 增技 术 应 用于 遗传作图 的 标 记， 自 从R A P D标记出 现以 后， 又有很多不同的 基于P C R扩增的标记技术被开发。 基于P C R标记是 第二代分子标记。 在遗传作图、 基因组印 迹和生物的多样性研究中得到很好的开发和利用。 R A P D标记所用的引 物大约1 0 个碱基的 单 个随机引 物( W e l s h a n d M c C le l l a n d , 1 9 9 0 ) ， 对全基因 组 进行扩增， 这种引 物提高 检测D N A多 态性的能力。由于引物较短， 在P C R中必须使用较低的退火温 度， 以保证引物能与模板D N A结合。 然而， 单个的随机短引物在植物材料中会产生一个具有 1 到3 个 条带的相对复杂的带型， 在其中仅有很少的相对稳定的带才能作为分子标记; 同时， 由于重复性差导 致标记信息很难在各个实验室之间共享; R A P D的P C R扩增要求的较低的退火温度， P C R参数的变 化很容易引起带型的变化等; 目 前R A P D很少广泛的用于遗传组图。 2 . 3 S S R标记 S S R ( s im p l e s e q u e n c e r e p e a t ) 或微卫星标记是最重 要的 分子标记 之一。 它是基于P C R 标记系 统的 P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p o n R e s e a r c h Z i - e t k i e w i c z e t a l ., 1 9 9 4 ) 。 在植 物中 ， S S R 标记 具 有数 量 丰富、 高多 态性 和 共 显性等 优点。 S S R 标 记 依 靠 重 复 单元数目 的 变 化形成多 态性， 这 些重复 单 元通常 是1 6 b p 的 短的D N A序列， 如2 个核 普酸的 重复 ( A T ) . 和 ( C T ) 。 与3 个 核 普 酸的 重 复 ( A T T ) o ， 这 种 重 复 广 泛分 布 在 基因 组中 。 检测S S R 标记的 关键在于设 计出 一对特异的P C R引 物， 为此， 必须事先了 解S S R座位两侧的 核 普酸序列， 据此设计引 物。 S S R引 物的 设 计需 要有大量的已 知 序列作为基础， 因 此开发新的S S R引 物 是一项费时 耗财的工作。 对已 测序的 物种可通过G e n B a n k 等D N A序列数 据库搜索S S R 序列。 对还 没 有全基因 组测序的 物种， 除了 在各种序列数据 库中 搜索S S R 序列外， 还需要构建基因 文库。 通过测 序 来寻 找S S R 位点， 根据S S R 两 侧 序 列 在同 一 物 种内 高 度保守的 特性设 计引 物。 S S R的P C R扩增产物可以 通过琼脂糖凝胶、非变性聚丙烯酞胺凝胶和变性聚丙烯酞胺凝胶检 测。 在琼脂糖凝胶中， 一般采用3 % 的 浓度胶， 可以 分离相差I O b p 的 扩增片段。 如果分析相差小于 l 0 b p 的 片段， 一般使用聚 丙烯酞胺分析。 另外也可以 通过在引 物末端添加荧光基团的 方式通过D N A 测 序 仪 检 测， 这 种 检 测 方 法 可以 把 差 别l b p 的 片 段 区 分 开。 另 外 通 过 荧 光 基团 激 发 光 波 长 的 ， 一 个 泳 道中 可以 检测多个扩增引物， 这和多引 物对在一个P C R 扩增分应的 结合可以 提高分析的 速度。 与引 物5 端使 用T 4 多 核普酸 激酶 标记的3T放 射性 标记、 E B 和银 染相比， 荧 光检测有 很多 优点: ( 1 ) 半 衰 期长; ( 2 ) 良 好的 操作 和安 全 性; ( 3 ) 检 测 方法 更 加 快 速; ( 4 ) 高 通 量、 自 动 化 程 度高。 2 . 4 L S S R I S S R ( i n t e r - s im p l e s e q u e n c e re p e a ts ) 是 一 种 与R A P D 类 似的 标 记 系 统， 虽 然 广 泛 存 在的S S R ， 但 它 并 不 需 要 像S S R 那 样 根 据已 知 序 列 信 息 设 计 引 物 ( G o d w in e t a l ., 1 9 9 7 ) 。 一 般 在引 物的5 或3 ， 端 接 上 2 - 4 个嚓吟或啥吮碱基， 设计出 各种能与S S R序列结合的P C R引物， 对两个相距较近、 方向 相反的 S S R序列 之间的D N A区段 进行扩增。 末端锚定核昔酸的 添加确保了 在I S S R的 条带 分析中 有较稳定 的 条带。 I S S R 技术所用的P C R引 物长度 在2 0 个核昔酸左右， 因 此可以 采用与常 规P C R 相同的 反 应 条件， 稳定性比R A P D好。 I S S R 标记呈孟德尔式 遗传， 具显性 或共显性特点。 I S S R 标记技术已 应用于 遗传分 析的 各个方面， 如品 种鉴定、 遗传关系及遗传多样性分析、 基因定 位、 植物基因 组作图 研究等。 但I S S R的 缺点是 遗传方式显性、 重复性不是很好且对某些引 物组 合产出 率不够。 在I S S R的 改进中 人们发 现对标准I S S R -P C R 扩增产物的 重扩增可以 改进 可重复性和多 态产 出 率( Wi e s n e r a n d W i e s n e r o v , 2 0 0 3 ) 0 2 . 5 S TMP S S R 标记由 于其突出的 特点 在很多 方面得到 应用， 但一个主要限 制因素是需要已 知序列的 支持。 在基因 组序列未 测序的 情况下S S R 标记的开发 涉及到 基因 组文库的 构建， 阳性包含S S R 特异位点的 克隆的筛选等多个复杂的过程。 S T M P ( s e q u e n c e - t a g g e d m i c r o s a t e l l i t e p r o f il i n g ) 是 一 项 可以 从 基因 组D N A 或c D N A中 快 速 产 生 大 量S S R 标 记的 技 术 ( H a y d e n a n d S h a r p , 2 0 0 1 ; H a y d e n e t a l ., 2 0 0 2 ) 。 这 项 技 术 是 依 据A F L P 的 原 理 产 生 大量的 被扩增P s t I - M s e I 限 制性片 段， 接着通过单个5 末端连接有生物素的 寡核昔酸的引 物和一个 单配体引物P C R扩增包含S S R s 的D N A片段。 P C R扩增产物与链亲合素包被的磁珠( s t r e p t a - v i d in - c o a t e d m a g n e t ic b e a d s ) 结合后洗脱， 仅包含目 标S S R s 的片段得以 保留， 这些片段就可以 克隆测 序。 在包含S S R的 扩增子中， 较长的 片 段S T N V标记可以 转化成S S R 标记。 这项技术不需 要建立基因 组文库去筛选包含S S R的克隆， 相比 传统的S S R标记开发更加高效。 P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p 。 R e s e a r c h F e r r i o l e t a l . , 2 0 0 3 ) 。 另 外 把 通过c D N A - S R A P 方法产生的标记测序来和已知模式物种的基因的比对， 可以在其它作物中发现基因。 2 . 8 S NP S N P ( s in g l e n u c l e o t i d e p o ly m o r p h i s m s ) 是同 一 物 种不同 个 体间 染色体 上遗传密码 单个碱基的 变 化， 主要表现为基因 组 核昔酸 水平上的 变异引 起的D N A序列多 态性， 包括单碱基的 转换、 颠换以 及单 碱 基的 插入 或缺失 等 ( N i c k e r s o n e t a l ., 1 9 9 0 ) . S N P 是继R F L P , S S R 之 后的 又 一 种新的 分子 标 记。 S N P 通常具双等位基因多态性， 其突变率相当低， 是一种稳定的突变， 比 之前的分子标记更为有用。 S N P 广泛的出 现在单拷贝D N A序列中， 在编码区和非编码区都可以找到S N P ， 一些S N P 标记是 表型变异的直接原因。 S N P 在很多物种的 基因组中 存在很高的频率， 如在人类基因组中， 平均每1 .3 K b 就出 现1 个S N P ， 而在玉米的1 号染色体中每1 0 4 个碱基就出 现 1 个S N P ， 其多 态性程度比人类要高 得多 ( T e n a i ll o n e t a l ., 2 0 0 1 ) 。 最初 大 规 模的S N P 搜寻 是 基于 基因 组P C R 产 物与D N A 寡 核 普酸 微阵 列 通过杂交进行检测的， 后来人 们通过表达序列标签( E S T ) 的 分析进行S N P 的 搜寻。 传统的S N P 检测方 法是采用一些已 有的成熟技术， 如D N A测序、 限 制性酶切片段长度多态性( R F L P ) 、 单链构象多态性 ( S S C P ) 、 等位基因 特异的 寡聚核昔酸杂交 ( A S O ) 等。 这些技术虽在某种程度上能完成对S N P 的 检测， 但由 于它们必须通过凝胶电 泳进行检测， 因此， 距快速、 高效、 自 动化的目 标还相差甚远。 传统的R F L P P r o c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p o n R e s e a r c h S S C P 则很难满足自 动化的 需要， 难以 大规模开 展工作。 因 此， 这些方 法均未被广泛采用。 D N A芯片技术是近年来新开 发的 一 种D N A序列 变 异 检 测 工 具。 D N A 芯 片 ( D N A c h ip ) ， 也 称 生 物 芯 片 ( b i o c h ip ) ， 以 玻 璃、 硅、 聚 丙 烯 等 作 为 载 体 基 片， 芯 片上 铺了 一层肉 眼 看不见的D N A纤绪 地毯” ， 即 具有特定 碱基序列的 探针。 待测基因 经提取后， 被切 成长短不一的片段， 经荧光化学 物质标记后， 注射到 嵌有芯片的 载片上。 由 于D N A和探针杂交的 程度 与荧光强 度相关， 因 此通过激光扫 描， 即 可根据荧光强 弱测出 被检测序列的 变异。 S N P 用 作 遗 传 标 记具 有以 下 优点 : ( 1 ) 它 在 基因 组中 的 分 布 较 微 卫 星 标 记 广 泛 得多 。 ( 2 ) 与串 联 重 复的 微卫星位点相比 ， S N P 是高 度稳定的 ， 尤其是处于编 码区的S N P ( c S N P ) a ( 3 ) 部分 位于基因内 部的 S N P 可能会直接影响 产物蛋白 质的 结构 或基因 表达水平， 因此， 它们本身可能就是遗传机制的 候选改 变位点。 ( 4 ) 易于 进行自 动化分析， 缩短了 研究时间。 3小结 我们简单回顾了几种主要的目 前在多种植物中正在广泛应用的基于P C R和杂交的分子标记及 其检测 技术。 对某一 特定的 物种来说， 使用哪 种标记需 要考虑包括了 多 态性、 显性、 简单性、 可 靠性、 可 重复性的等多种因素。在R F L P - P C R , R A P D . S S R和A F L P 标记中， 虽然R A P D相比简单、 快速， 但与 R F L P 和A F L P 相比 其在可靠性和重复性方面就不是还好; S S R标记在多 态性偏低的自 花授粉植物有 其独特应用， 并且是 共显性的; A F L P 虽然在复杂基因 组的 遗传图 谱构建中 有很大的 应用价值， 但它是 一 个显性的 标记系统。 这些标记都有 其有缺点， 根据具体情况选择使用才能发挥其最大价值。 致谢 本工作由 海南省作 物分子育 种重点 实验室开放基金( 2 0 0 5 0 3 - 2 ) 资助。 参考文献 A g b o E .C . , D u i m B . , Ma j i w a P .A . , B u s c h e r P . , C l a a s s e n E . , a n d P a s M.F . , 2 0 0 3 , M u l t i p l e x e n d o n u c l e a s e g e n o t y p i n g a p p r o a c h ( M E G A ) : a t o o l f o r th e fi n e - s c a l e d e t e c t io n o f u n l in k e d p o l y m o r p h i c D N A m a r k e r s , C h r o m o s o m a , 1 1 1 ( 8 ) : 5 1 8 - 5 2 4 A l p e r t K .B . , a n d T a n k s l e y S .D ., 1 9 9 6 , H ig h - r e s o lu t io n m a p p in g a n d i s o l a t io n o f a y e a s t a r t i fi c i a l c h ro m o s o m e c o n t ig c o n t a in in g f w 2 . 2 : a m a j o r fr u it w e i g h t q u a n t ita t iv e tr a it l o c u s in to m a t o , P r o c . N a tl . A c a d . S c i ., 9 3 : 1 5 5 0 3 - 1 5 5 0 7 B e a v i s W.D . , 1 9 9 4 , T h e p o w e r a n d d e c e i t o f Q T L e x p e r im e n t s : l e s s o n s fr o m c o m p a r a t iv e Q T L s t u d i e s , I n : P r o c . 4 9 t h A n n . C o m a n d S o r g h u m I n d . R e s . C o n f . , A m e r i c a n S e e d T r a d e A s s o c i a t i o n , Wa s h i n g t o n D .C . , p p . 2 5 B o t s t e i n D . , Wh i t e R .L . , S k o l n i c k M. , a n d D a v i s R .W. , 1 9 8 0 , C o n s t r u c t i o n o f a g e n e t i c l i n k a g e m a p i n m a n u s i n g r e s tri c t i o n f r a g m e n t l e n g th p o ly m o r p h i s m s , A m . J . H u m . G e n e t . , 3 2 : 3 1 4 - 3 3 1 B r u g m a n s B . , d e l C a r m e n F .A . , B a c h e m C . W. , v a n O s H . , v a n E c k H . J . , a n d V i s s e r R . G . , 2 0 0 2 , A n o v e l m e t h o d f o r t h e c o n - s t r u c t io n o f g e n o m e w i d e tr a n s c r ip t o m e m a p s , P la n t J ., 3 1 : 2 1 1 - 2 2 2 B u d a k H . , S h e a r m a n R . C . , P a r m a k s i z L , G a u s s o i n R . E . , R i o r d a n T . P . , a n d D w e i k a t I . , 2 0 0 4 , Mo l e c u l a r c h a r a c t e r i z a t i o n o f B u ff a l o g r a s s g e r m p l a s m u s i n g s e q u e n c e -re l a t e d a m p li fi e d p o ly m o r p h i s m m a r k e r s , T h e o r . A p p l . G e n e t ., 1 0 8 : 3 2 8 - 3 3 4 B u r r B . , a n d B u r r F .A . , 1 9 9 1 , R e c o m b i n a n t i n b re d s f o r m o l e c u l a r m a p p i n g i n m a i z e : t h e o re t i c a l a n d p r a c t i c a l c o n s i d e r a t i o n s , T r e n d s G e n e t . , 7 : 5 5 - 6 0 C a s a A .M， B r o u w e r C . , N a g e l A ., W a n g L ., Z h a n g Q， K r e s o v ic h S ., a n d We s s le r S .R， 2 0 0 0 , I n a u g u r a l a rt i c l e : t h e M I T E f a m - ily h e a r tb r e a k e r ( H b r ) : m o l e c u la r m a r k e r s in m a i z e , P r o c . N a tl . A c a d . S c i ., 9 7 : 1 0 0 8 3 - 1 0 0 8 9 C h a o S . , S h a r p P .J . , Wo r l a n d A .J . , Wa r h a m E .J . , K o e b n e r R . M.D . , a n d G a l e M.D . , 1 9 8 9 , R F L P - b a s e d g e n e t i c m a p s o f w h e a t P ro c e e d i n g s o f t h e Wo r k s h o p o n R e s e a r c h &D e v e l o p m e n t o f B i o t e c h n o l o g y i n H a i n a n , 3 1 J u l y - 1 A u g u s t , 2 0 0 6 , S a n y a , C h i n a 海南生物技术研究 与发展研讨会论文集 2 0 0 6 年7 月3 1 日一 8 月1 日， 中国， 三亚 h o m o e o lo g o u s g r o u p 7 c h ro m o s o m e s , T h e o r . A p p l . G e n e t ., 7 8 : 4 9 5 - 5 0 4 C h e n X . , S a l a m i n i F . , a n d G e b h a r d t C . , 2 0 0 1 , A p o t a t o m o l e c u l a r - f u n c t i o n m a p f o r c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m a n d tr a n s p o r t , T h e o r . A p p l . G e n e t . , 1 0 2 : 2 8 4 - 2 9 5 F e r ri o l M., P ic o B， a n d N u e z F ., 2 0 0 3 , G e n e t i c d iv e r s i ty o f a g e r m p l a s m c o l l e c t i o n o f C u c u r b it a p e p o u s in g S R A P a n d A F L P m a r k e r s , T h e o r . A p p l . G e n e t . , 1 0 7 : 2 7 1 - 2 8 2 F i s h e r R .A ., 1 9 2 1 , O n t h e m a t h e m a t i c a l f o u n d a t i o n s o f t h e o r e t i c a l s t a t i s t i c s , P h i l o s . T r a n s . R o y . S o c . , 1 2 2 : 3 0 9 - 3 6 8 F re i O . M . , S t u b e r C .W. , a n d G o o d m a n M . M. , 1 9 8 6 , U s e o f a l l o z y m e s a s g e n e ti