H9N2亚型猪流感病毒HA基因的克隆及体外表达

第六届理事会第二次会议班教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 性抗原基因插入伪狂犬病毒基因组， 构建二价或多价基因工程疫苗， 达到一针同时预防多种 疾病的目的， 将有利于养殖业的健康发展。目前，已有儿十种外源基因在伪狂犬病毒中获得 高 效 表 达 6-100 猪细小病毒基因组编码三种结构蛋白V P l , V P Z , V P 3 ， 其中V P 2 是构成病毒粒子的主 要衣壳蛋白， 约占病毒衣壳蛋白总量的8 0 。 血清学试验证实， V P : 可以诱导产生血凝抑制 及中 和 抗体， 细小 病毒的 主要 抗原决 定 簇也 位于V 几上 1 1 。 因 此本 研究以P P V 最主 要的 保 护性抗原基因V P a 为目 标基因， 在 缺失 部分g E 和g l 基因的 基础上构建转移载体。 g E 和 9 I 基 因 是P R V 重 要 的 毒 力 决 定 基因 ， 缺 失 部 分g E 和g l 基因 可以 减 弱P R V 的 毒 力 ( 1 2 -1 3 0 由 于gG是P R V 最 强 的 启 动 子 之 一 ， 最 早 有V a n Z ij 1 等 14 利 用 该 启 动 子 构 建 了 表 达 猪 瘟 病 毒 ( H C V ) 囊膜蛋E l 的重组P R V 。 动物免疫试验结果表明接种猪可同时获得对P R V和H C V的 保 护。 随 后Id d e k ig e n e 等 p 5 又 构 建 了 以 不 同 启 动 子 驱 动 的 表 达 H C V E l 蛋 白 的 4 株 重 组P R V , 且 动物试验结果 表明 ，C M V立即启 动子和g G启 动子控制下的H C V E l 重组P R V ， 均能 使猪 免受P R V和H C V的双重攻击。为了 使V P 2 基因在P R V中正确表达并产生免疫力. 本实验 利用g G基因 强 启 动 子的 特性， 启动 外 源 基因 的 高 效 表 达， 利 用g G , g D , 1 1 K 全基因， 部 分g E , g l , 2 8 K 作为重 组的同 源臂。 在g E 和g l 基因 单 酶 切 位点s t u l 和s p h l 之间 切去2 3 0 0 b p , 把两端带有s t u l 和s p h I 酶切 位点的V P 2 基因 插入， 由 于是 双位点插入， 不必 进行方向 鉴定。 重组质粒用酶切和P C R的 方法鉴定插入片段是V P 2 片段， 成功的 构建了 转移载体p P R - V P 2 , 这为经同源重组获得表达P P V V P : 基因重组病毒，研制基因工程二价疫苗奠定了基础。 参考文献略 H 9 N 2 亚型猪流感病毒H A基因的克隆及体外表达 韩庆功 z 乔传玲 ”杨焕良 陈 艳 辛晓光 陈 化兰 赵玉军2 ( 1 .中国 农业科学院哈尔滨兽医 研究所农业部动物流感重点开放实 验室赞兽医 生物技术国家重点实 验室 哈尔滨 黑龙江1 5 0 0 0 1 ; 2 沈阳农业大学畜软兽医学院 沈阳 辽宁1 1 0 1 6 1 ) 摘要从2 0 0 4 年全国动物流感调查分离到的一株猪流感病毒经亚型鉴定确定为H 9 N 2 ，命名为 A / S w i n e / Z h e j ia n g / 7 / 2 0 0 4 ( H 9 N 2 ) ， 利 用R T P C R 扩 增H A 基因 ， 测 序后 将其克隆 到 真核 表达载 体 p C A G G S 上， 转染 2 9 3 T 细 胞， 经 W e s t e rn - b l o 港测 所 克隆 的 载 体 p C A G G H A 在 体外能 够 瞬时 表达 具 有 免疫学 活 性的 H A 蛋 白， 这将为下一步开展D N A 疫苗的免疫莫定基础. 关健词 猪流感病毒;H A 基因;克隆;表达 猪流感( S w in e I n fl u e n z a , S I ) 是由 正 粘 病毒科流感 病毒引 起的 一种急性、 高 度接触传染性 的群发性猪呼吸道疾病， 是猪的主要免疫抑制病之一。 临床以突发、 高热、 咳嗽、 呼吸困难、 衰竭、 高发病率、 低死亡率为特征， 单纯S I 的病理变化主要表现为病毒性肺炎及其它呼吸器 官的炎 性变化， 但有其它病原继发或混合感染时， 病理变化会严重而复杂( 1 . H 9 N 2 亚型流感病毒为低致病性流感病毒，目 前流行于世界各地， 其不仅给养禽业带来 严重威 胁， 而且 还可以 感 染 猪 及人 类 2 . 3 1 ， 同 时 还是 引 起 9 7 年 香 港 流感的H 5 N 1 亚型A I V 的 内部 基因的 供体4 1因 此， 对H 9 N 2亚型流感病毒研究近几年倍受世界流感研究工作者的 瞩 目 。 本试验拟将 A / S w i n e / Z h e j i a n g / 7 / 2 0 0 4 ( H 9 N 2 ) H A 克隆、 测序后， 构建真核表达载体研究 其体外表达的情况，用以 研究D N A 疫苗的免疫效果。 1 材料与方法 猪传染病 1 . 1病毒 猪流感病毒A / S w i n e / Z h e j ia n g / 7 / 2 0 0 4 ( H 9 N 2 ) 是采 集健 康猪鼻腔拭子后， 按流感病毒分离 的常规方法进行，分离到的。经S P F 鸡胚增殖、纯化后，收集尿囊液。 1 . 2载体 p C A G G S 质粒含鸡R - a c t in 启动子和 C M V 增强子，由 本实验室 保存。 1 .3 P C R引物 根据已 发表的 H 9 亚型流感 病毒 H A 基因的 序列， 利用 O l i g o 6 软件设 计引 物， 上游引 物: 5 A G C A A A A G C A G G G G A A T T T C A C 3 ;下游引物:5 A A G G G G T G T T T T T G C C A A T T AT 3 ，由上海英骏生物技术有限公司合成。 1 .4 H A基因的克隆、 测序 病毒R N A 的 提取及R T P C R 均按常规方法进行， 将扩增的 H A 基因 克隆到 载体 p M D - 1 8 T 上，采用双脱氧终止法在C E Q 8 0 0 0 测序仪上进行测序。 1 .5 H A墓因 真 核表达 载 体p C A G G H A的 构建 利用限 制性内 切酶 S a c I 和 S p h I 将 H A 基因从 p M D - 1 8 T 载体上切下， 定向 克隆到 真核表 达载体 p C A G G S 中，经酶切和P C R 检测确证克隆 正确。 1 .6 H A基因的体外表达及检测 按 照 L i p o f e c t a m i n e 妈0 0 0 试剂 盒的 转染 方 法 将己 构 建的 表 达载 体 p C A G G H A 转染 2 9 3 T 细胞，用质粒转染后4 8 小时的2 9 3 T 细胞及未转染质粒的细胞裂解后制备的样品进行 S D S - P A G E ，之后用H 9 亚型禽流感病毒特异性多克隆血清进行W e s t e rn - b l o t 检测H A 蛋白的表 达情况。 2结果 2 . 1 H A基因的克隆、 测序 提取猪流感病毒 A / S w in e / Z h e j ia n g / 7 / 2 0 0 4 ( H 9 N 2 ) 的 R N A , R T P C R 扩增H A 基因， 之后 将其克隆、 测 序。 结 果 获 得的目 的 基 因 核 昔酸 长 度为1 7 4 2 b p ， 开 放阅 读 框 编 码5 6 0 个 氨 基酸。 将测得的H A 基因序列与已知序列进行同源性分析，结果与A / Q u a i l/ S h a n g h a i/ 8 / 9 6 / , A / S w i n e / H o n g K o n g / 2 1 0 6 / 9 8、 A / D u c k / H o n g K o n g / Y 2 8 0 / 9 7 分别具有9 9 .4 % , 9 8 .3 % 和9 7 .6 % 的同源性。 2 .2 H A墓因真核表达载体的构建 将H A 基因定向 克隆到 真核表达载体p C A G G S 中，经酶 切鉴定 和P C R 鉴定， 结果表明 H A 基因己正确克隆到载体中。 2 .3 H A基因的体外表达及检测 收集质粒转染后4 8 小时的2 9 3 T 细胞及未转染质粒的细胞样品，裂解后进行S D S - P A G E , 之后行W e s t e rn - b l o t 检测。结果转染质粒的细胞样品检测到分子量大小约为7 5 K D a 的表达产 物， 证实 H A 蛋白 在表达 载体p C A G G S 中 获得了 体外 表达。 3 讨论 M a r k w e l l 等在 1 9 9 8 年 4 月， 从香港的 家猪体内 分离 到了 两株 H 9 N 2流感病毒，这是首 次从哺乳动物体内 分离到 H 9 N 2 亚型的 流 感病毒5 ， 说明H 9 N 2亚型 流感病毒 可以 感染猪 一这个种间传播的中间宿主，经过在这个“ 混合器” 中适应或与其他亚型的流感病毒杂交后， 第六届理事会第二次会议盛教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 有可能产生可以在人体内进行良 好复制性的人流感病毒，从而导致人类流感的大流行。 常规的流感灭活疫苗是通过抗体介导的免疫来抵抗流感病毒的感染， 但由于流感病毒的 抗原漂移和转变常常使接种流感灭活疫苗失败，导致流感的流行。目 前D N A 疫苗和活载体 疫苗是流感疫苗的研究热点。D N A 免疫类似活病毒疫苗，经体内抗原提呈细胞 ( A P C ) 加 工 处 理 刺 激机体 产生 细 胞 和体 液免 疫 反 应， 从 而达 到 抗 病 毒作 用16 1 。 近年来， 流感 病毒 D N A 疫苗 研究的 基因 主 要 集中 在 H A , N A , N P , M 2 基因 7 1 0 本试验通过对H 9 N 2 亚型S I V H A 基因 进行克隆、 测序， 构建了 真核表达载体， 通过转染 细胞体外检测表达情况，结果表明本研究所构建的表达载体能够很好的表达H A 蛋白，从而 为研究H 9 N 2 亚型D N A 疫苗预防流感的可行性奠定了基础。 参考文献略 日 本脑炎病毒E 基因 抗原域I I I 和猪I g G C H 3 融合表达* 魏建超 ，宋大 伟8 .2 ， 郑其升 ， 周斌 ，曹 瑞兵 ，陈 游言 . ( I . 南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点实 验室，江苏南京2 1 0 0 9 5 2 . 宁夏大学农学院，宁夏银 川 7 5 0 0 0 1 ) 摘 要:根据已 发表文献及D N A s t a r 软件分析， 选取日 本脑炎病 毒 ( J a p a n e s e e n c e p h a l i t i s v i r u s , J E V) 囊 膜蛋白E 基因 域川区 和猪I g G重 链- C H 3 可与S P A非特异性结合区 城作为目 的 基因 进行串 联表达E C H 3 片 段串 联克隆入原核表达载体p E T 3 2 a ( +) 中， 构建成重 组质粒p E T - E - C H 3 ， 对重组质粒诱导 表达，表达蛋 白 经纯化后标记于C o w a n I 株金黄色 葡萄 球菌S P A上与收集的1 4 4 份待检血清进行平板协同 凝集 试验， 结 果与现有诊断试剂盒检测结果具有较好的 符合性. 该方法具有简 单， 决 速，敏感， 易于 操作的特点. 关 键词: 流行性乙 型脑炎、 I g G C H 3 . S P A 协同 凝集 日 本 脑炎( J a p a n e s e e n c e p h a l it i s ) 是由日 本 脑炎 病 毒( J a p a n e s e e n c e p h a l it i s v ir u s , J E V ) 侵害中枢神经系统引起的急性传染病。 近年来随着全球气候的变暖，乙脑病例呈上升趋势。 在 动 物中 ， 猪 对J E V 的 感 染 最 普 遍， 它 与 蚊 形 成了 蚊牛猪 循 环 传 播 模 式， 并 对 病 毒 起 放 大 器作用。 此病引起妊娠母猪流产、 死胎; 公猪发生辜丸炎; 仔猪因脑炎死亡， 给养猪业发展 带来巨 大的 经济损失 1 ) 。 常用的 补体结 合试验、 血凝抑制 试验、中 和试验等血清学诊断方 法耗时费力， 不能早期诊断， 而且其抗原来自 于经纯化、 浓缩的完整的病毒。 获得该抗原存 在以下几个问题: 完整病毒不易生产、 纯化、 成本较高， 且存在感染性和容易散毒， 在应用 中存在局限性。 日 本脑炎病毒E 蛋白 含有3 个抗原域: 域I ， 也叫中心域， 由1 - 5 1 , 1 3 7 - 1 9 6 和2 9 3 - 3 1 1 位的1 2 8 个氨基酸残基组成， 含2 个二 硫键 ( C y s 3 - C y s 3 0 , C y s l 9 0 - C y s 2 8 7 ) ， 此 域有糖基化位点和带有血清学及生物活性的抗原表位; 域I I ，由5 2 - 1 3 6 和 1 9 7 - 2 9 2 位的 1 7 1 个氨基酸残基和3 个二 硫键( C y s 6 0 - C y s 1 2 1 、 C y s 7 4 - C y s 1 0 5 和C y s 9 2 - C y