新型PCV Ⅱ whn株核酸疫苗的构建

猪传染病 新型P C V I I w h n 株核酸疫苗的构建 陈娜锐 王红宁 2 罗昊 黄勇 柳萍 ( 1 .四川 农业大学动物科技学院， 雅安 四川 6 2 5 0 1 4 ; 2 . 四川大学 “ 9 8 5 工程” 西南资 源环境与灾 害防治 科技创新平台， 成都， 6 1 0 0 6 1 ) 摘 要:目 的 :用C p G 序列与 猪国 环病 毒P C V w h n 株编 码C A P 蛋白 的 基因( O R F 2 ) 共同 构 建核酸 疫苗， 为下 一步 在猪群上 进行临 床实 脸英定 基拙. 方法: 用P C R 方 法 扩增O R F 2 ，同 时 人工 合成一 段C p G 序列， 利用上下游引物进行扩增.定向插入到真核表达载体 p c D N A 3 . 1 ( + ) 中断型构建核酸疫苗 ( p c D N A - P C V - O R F 2 - I S S ) .利用P C R方法 和双酶切检测 质粗p c D N A - P C V - O R F 2 - I S S ;并送上海菌菌生物 公司 测 序. P M 醉 切 和 测 序结 果 均 与 预 期 结 果 一 致。 成 功 构 建 含C p G 免 疫 刹 激 序列 的 猪圆 环病 毒I I 型 核 酸疫苗.为今后动物实脸打下良 好基础. 关 键词: 猪国 环病 毒核酸 疫苗 C p G 免 疫刺激 序列 核酸疫苗 ( n u c le i c a c i d v a c c in e , N A V ) ， 又 称 D N A疫苗 ( D N A v a c c i n e ) 或基因 疫苗 ( G e n e v a c c i n e ) ，是指把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒D N A通过肌肉 注射、 基因枪轰入、鼻粘膜滴入、 静脉注射等途径将其接种到动物体内， 使外源基因在活体 内表达， 产生的抗原激活机体的免疫系统， 引发免疫反应。 最早在1 9 9 0 年， W o l f 等人在一 次试验中发现，纯化的D N A重组表达载体，能在小鼠 局部肌肉 细胞内表达，这种表达至少 可持续数月，随后又发现这种表达甚至可持续终身， 而没有检出注射的D N A与宿主染色体 整合。 于是核酸疫苗就应运而生， 是继病原体疫苗、 亚单位疫苗之后的第三代疫苗， 开辟了 免疫学上的新纪元，目 前已成为分子生物学研究的重点方向之一。 近年来对 D N A的免疫学特性研究发现，来源于不同物种的D N A免疫原性不同，细菌 质粒D N A的回纹结 构中 含有以 非甲 基 化的 胞喀陡鸟 Of 吟二核昔酸序列 ( C p G ) 为核心的 免疫 刺激 序 ( I S S ) ， 与 脊椎 动物D N A 有显 著 差 别， 所以 脊 椎动 物身 体 视非甲 基 化的C p G 序列为 一种外来抗原， 刺激机体的 免疫系统。 I S S 绝大部分是由C p G为 基元的 寡聚体 构成， 又称 C p G D N A ， 不 少 研究 显 示C p G O D N直 接 注 射 可作为 感 染性 疾病 和肿 瘤D N A疫苗的 免疫 佐剂。 其刺 激免 疫反 应的 最理 想的D N A 序 列是p u r - p u r - C p G - p y r - P y r 。 含有 一定 数 量C p G结 构的细菌质粒D N A能通过一系列的连锁反应， 放大抗原的免疫效应， 激活B细胞，巨噬细 胞和自 然杀伤细胞，增强其功能和细胞因子的分泌，促进T H 1 型应答。能否将人工合成的 C p G O D N插入表达载体内， 作为免疫佐剂， 增强D N A疫苗的免疫反应， S a t o 进行了 这项 开拓性的工作，结果显示含I S S 的质粒D N A与不含I S S 的对照组相比，可显著增强针对质 粒D N A编码抗原的免疫应答，并且随着质粒D N A中I S S 数量的增加，免疫应答也增强， 呈现一定的 剂量反 应关系，同 时 提示了I S S 插入的 位置 效应。 C p G序列 作为分子免疫增强 剂在多种动物传染性疾病和寄生虫病的防治中己经取得成功， 但是在猪传染性疾病的研究中 尚未见报道。 迄 今， 已 发 现D N A 接 种 对 许多 病 毒、 、 细 菌、 寄 生 虫 感 染以 及 肿 瘤 的 预 防 均 有 一 定 的 效 果， 猪圆环病毒1 1 型 ( P C V 2 ) 能 够引起的 猪的断奶仔猪多系统衰竭综合症 ( P M WS ) 、 猪皮 炎和肾病综合症 ( P D N S )等疾病，并可导致猪的免疫功能下降，引发其他各种继发感染， 给养猪业造成了严重损失， 成为养猪业的主要疾病。 到目 前为止还没有有效的疫苗能够预防 该 类 疾病的 发生。 研究表明 该 病 毒唯 一的 核 衣壳 蛋白( C a p ) 是能 够诱导 猪 体产 生 特异性 抗 体。 本研究就是利用四川分离株 ( P C V w h n ) 编码C A P 蛋白的基因 ( O R F 2 ) 构建核酸疫苗， 同时在多克隆位点上引入I S S 免疫刺激序列。 本试验的目的在于研究猪圆环病毒核酸疫苗联 合C p G序列的构建， 为研制新型、高效、安全的核酸疫苗、免疫佐剂奠定基础。 1 . 材料与方法 1 . 1 病毒 病毒为猪圆环病毒P C V w h n ，四川农业大学预防医学生物工程实验室分离保存 1 . 2 质粒、菌种和实验动物 p U C M - T 购自 上海生物工 程公司， 真核表达载体p D N A 3 . 1 ( + ) 购自I n v i v o g e n 公司、 第六届理.会第二次会议盛教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 感受态细胞J M 1 0 9 由四川农业大学预防医学生物工程实验室制备保存。 1 . 3 试剂与仪器 T a q P l u s D N A聚合酶、 d N T P、 U N I Q - 1 0 柱式D N A胶回收 试剂盒等为上海生物工程公 司， X - G a l , I P T G , A m p 等购自 博瑞克公司， 限 制性内 切酶( B a m H I , K p n I . E c o R I , N o d ) , T 4 D N A L ig a s e 、 等购自 宝生物公司。 1 . 4 引物 根据G e n e B a n k 上公布的P C V序列利用P r i m e r 5 . 0 设计两条特异性引 物: 上游: Z 1 5 G TTC A G G T A T G A C G C C A A G 3 下游: Z 2 5 0 0 0 A T G C C C T G A A TT T C C 3 扩增片段为7 8 4 b p 包含主要 编码 蛋白C a p 基因。 R F 2 的 全部 基因( 7 0 5 b p ) ， 引 物由 上海生工公司 合成， 加灭菌超纯 水溶解， 浓 度为2 0 p m o l/ m l o 根据文献自 行设 计含1 1 个C p G m o t if 的C p G序列， 全长9 2 b p 。 并设计上下游引 物， 由 上海生工公司 合成， 加灭菌超纯 水溶解， 浓度为2 0 11 m o l/ m l o 1 . 5 真核表达载体的构建. 插入片段的引物位置和酶切位点见下图: O R F 2 ( 7 8 4 b p ) _C p G ( 9 2 b p ) K 户 n l Ba r h HIc o RI No t l 1 . 6 病毒D N A的提取及P C R扩增 按常规 方法培养病毒， 收 集病毒液， 提取病毒总D N A ， 建立5 0 g lP C R反 应体系， 反 应 结束后取5 11 IP C R 产物用0 .8 % 的 琼脂糖进行 凝胶电 泳观察结果。 1 . 7 构建编码O R F 2 基因的 ，组质粒 用U N I Q - 1 0 柱式D N A胶回收 试剂 盒回收P C R 产物， 建立1 0 11 1 的 连接反应体系: 1 0 x b u f f e r 2 11 1 p U C m - T 载体1 p 1 T 4 D N A L i g as e ( S u / g l ) 1 11 1 目 的 基因3 .5 p 1 最后补水至总体 积1 0 闪 ， 用加样枪轻轻打匀， 1 6 连 接过夜。 按分子克隆实 验指南的 方法转化J M 1 0 9 感受态细胞， 涂板进行蓝白斑筛选及菌落P C R鉴定，最后提取质粒酶切鉴 定。 送上海茵俊公可 测序， 并确定目 的 基因的 插入方向。 利用B a m H I 和K p n I 对P U C m - O R F 2和p c D N A 3 . 1 ( + ) 进行双酶切， 回 收目 的 片 段， 做连接反 应、 转化感受态细胞， 并 进行A m p 抗性、 菌落P C R以 及酶切鉴定， 筛选阳 性克隆。 1 .8 p c D N A - P C V O R F 2 - I S S 的 构建 设计并人工合成寡核甘酸片段 ， P A G E 胶纯 化后， 分别将上下游引 物等p m o l 混合， 建立 5 0 u l P C R反应体系，胶回收P C R产物，经沉淀后由E c o R I 和N o d 切成两个粘端的片段。 用E c o R I 和N o d 双酶切p c D N A - P C V O R F 2 ， 以同 样的 方法回收 酶切 后的p c D N A - P C V ORF 2 0 ZullPllPI.5Pl 建立 l o u t 的连接体系: 1 0 x b u ff e r 线性化的p c D N A - P C V O R F 2 T 4 D N A L i g as e ( 5 u / g l ) C p G 双蒸水 2 . 5 u 1 1 6 连接过夜。按分子克隆实验指南的方法转化J M 1 0 9 感受态细胞 筛选及菌落P C R鉴定， 最后提取质粒酶切鉴定。 送上海茵 俊公司 测序， 插入方向。 ，涂板进行蓝白斑 并确定目的基因的 猪传染病 2结果 2 . 1 O R F 2 的P C R扩增 以P C V w h n 株D N A为模板， 经P C R扩增， 将P C R产物用0 . 8 % 的琼脂糖进行凝胶电 泳 观察， 可清晰的 看到 在7 8 0 b p 附 近有特异 性条带， 大小与预期的结 果相符。 2 . 2 P C R产物的克隆及鉴定 经菌落P C R 扩增初步 筛选，再 经碱裂解法 提取克隆 质粒， 用B a m H I 和K p n I 双酶切 鉴定， 得到8 9 0 b p 的片 段，与 预期结果相符合。 筛选获得的阳 性克隆 质粒， 命名为 p U C m - O R F 2 0 2 .3 p c D N A - P C V - O R F 2 的 酶切鉴定 经B a m H I 和K p n I 双酶切 ( p U C m - T 与p c D N A 3 . 1 ( + ) 共有) 鉴定表明O R F 2 基因正确 的 插入 真 核 表达 载 体p c D N A 3 . 1 ( +) 中。 2 .4 p c D N A - P C V O R F 2 - I S S 的 酶 切鉴定 和测 序 结 果 酶切和测序结果与预期结果完全一致， 成功构建p c D N A - O R F 2 - I S S 新型质粒。 3 . 讨论 D N A免疫是近年来在免疫学和分子生物学迅速发展的基础上出现的新技术。 D N A免疫 的概念和实验诞生于9 0 年代初，作为新一代疫苗，由于其独特的理化特性及诱导免疫反应 的全面性，已 经引起了) 泛的重视， 并用于多种传染病、 肿瘤的实验研究， 有的己被批准用 于人体实 验 1 8 - 1 9 o D N A疫一苗 虽然 有广 泛的 优越性， 但其免 疫效力上 还不及活疫苗有效， 如何提高基因疫苗的效率， 优化D N A疫苗的设计仍是当前基因免疫研究中面临的重要课题。 在 众 多 的 文 献 中 ， 我 们 特 别 注 意 到 C p G 序 列 的 免 疫 增 强 作 用 。 C p G D N A 序 列 可 诱 导 细 胞 产 生大量的a . p 干扰素和I L - 1 2 等细胞因子的分 泌， 促进T H l 型免 疫应答。 3 . 1 P C V结 构蛋白 ( c a p ) 的 功能 研究证实， 病毒的结构蛋白 ( c a p ) 是由 位于负 链上的阅 读 框。 R F 2 编码， 大小 为2 7 .8 k D a 8 。对P C V病毒的O R F 2序列分析表明:P C V 2的O R F 2编码2 3 4个氨基酸残基。 序列比较显示P C V 2 O R F 2基因核普酸序列同 源性在9 1 % - 1 0 0 % 之间， 氨基酸同 源性在 9 7 . 1 % - 9 9 . 7 % 之间。 序列分析结果还表明 猪圆 环病毒O R F 2蛋白的N末端为碱性氨基酸富 集区， 序列高度保守。 此外， 用P E P S C A N 的方法对O R F 2 和O R F 1 进行分析， 发现了5个 主要的免疫反应区，其中4个位于O R F 2中。O R F 2编码的病毒结构蛋白与从纯化的病毒 粒子中检测到的蛋白 大小相似， 在电子显微镜下观察， 这个重组蛋白 可自 我组装为核衣壳样 粒子， 用P C V 2实验感染猪， 在接毒后3周就可于血清样品中 检测到抗这个重组蛋白的抗 体 1 0 。 本实验室根据病毒的结构蛋白 的良 好的免疫原性， 通过P C R 扩增出蛋白的编码基因 O R F 2 ， 构建核酸疫一苗( p c D N A - P C V O R F 2 ) ， 以 前的 实 验中已 证实 将其通过 肌肉 注射入小鼠 体内， 在细胞中 可表 达主要抗原蛋白( C a p ) , 通过各种途径 刺激机体产生免疫反应， 抗体 水平可持续至8 0 天。 3 . 2重组质粒的构建. 本 研究 采用的I n v it r o g e n 公司 的p c D N A 3 . 1 质 粒 载体， 是 适 用 性 很 广的 真 核细 胞高 效 表 达载体， 它具有C M V早 期启动子循强子和B G H的p o ly A序列， 可以 保证插入基因用自 身 起始 密 码子 在哺 乳动 物细 胞体内 高 效 表达:它 有原 核 筛 选标 志A m p e n i c i l l i n 抗 性 基因 和 真核 筛选标志N e o m y c in 抗性基因;C o l E . l 序列可使质粒在大 肠杆菌中多 拷贝的 复制; 它 还带有 可 供重组质粒体外转录/ 翻译的T 7 噬菌体启动子。 本实 验构建的 重 组质粒p c D N A - P C V O R F 2 - I S S 均采用P C R 产物直接克隆的 方法， 通过 P C R 可以 扩增大量的目 的 基因。 重组质粒是否正 确地 插入了C p G 序列是本实验成功的 关键。 我们采用酶切鉴定法， P C R法和T 7 p r o m o t e r 直 接测序法证实插入片 段无移码突变和碱基错 配，成功地构建了所设计的重组质粒。 一一一一一一止些通竺堕竺边鱼丝鱼2 胚年 愈 婆 诊 冬 丛 “二 _ _ ll _.1 _. 3 .3 C p G的免疫刺激 作用 2 0 世纪8 0年代中 期， T o k u n a g a 等从牛分 枝杆菌卡介苗中 分离的D N A中 发现具有特征 性结构的 免疫序列 ( C p G序列 ) 有很强的 抗肿瘤活性， 刺激作用的研究。近年来人类医学的大量研究证实. 自 此人们开展了 大量的 有关C p G免疫 C p G序列能 直接促进树突状细胞、巨 噬 细胞等抗原提呈细胞的成熟与分化。诱导B细胞增殖、分化和分泌免疫球蛋白. 诱导I L - 1 2 及其他T h l 型细胞因子的免疫效应。 发机体产生免疫应答的能力。 机体先天性的免疫保护效应。 从 而诱导 特异性C T L 应答反 应。 C p G序列这种迅速激 推测可能是宿主细胞识别特异的D N A特征结构，从而唤醒了 我 们选用的C p G免疫 刺激基序含有A A C G T T , G T C G T T , G A C G T T , A T C G A T四 种不 同 构型的C p G m o t if ， 有 报 道 表明A T C G A T 是 对 猪具 有 很 好的 免 疫 刺 激作 用的C p G O D N . 但在设计时我们把能 很好的引 起高 等动物免疫 刺激作 用的C p G O D N ， 共同 组合在一起，同 时在考虑量效关系上， 应当 注意的是 超过1 1 个C p G m o t if 的 组合有可能 会引 起免疫的负效 应。 所以 在设计中 考虑到以 上的 几种因 素， 我 们选取了9 个C p G的 免疫 刺激序列。 在构建中由于插入的序列是在载体的多克隆位点上， 所以我们在猪圆环病毒抗原基因的 下游加入C p G O D N 。 有报道表明 在上游和下游分别加 入C p G O D N对抗原基因的 表达影响 不大， 但是又有 人对其有异议， 认为如果在上游引 入C p G O D N则 会对抗原 基因的 表达有很 大影响。由 于目 前C p G的 插入位点与 抗原基因的 相互作用 机理研究尚 不清楚， 所以 本实验 在构建时采取了比较保守的方式， 即在抗原基因的下游引入， 不影响抗原基因在体内的正常 表达。 4展望 实 验结 果 表明， 本实 验 成功 构 建了 新 型的 猪圆 环 病毒 核 酸 疫苗( p c D N A - P C V O R F 2 - I S S ) ， 本实 验室以 前构建的p c D N A - P C V O R F 2 核酸疫苗在小鼠 上能 够引 起免疫原性的反 应， 但是能否在猪体内刺激机体产生特异性抗体以 及能否诱导细胞免疫， 我们正在进行当中。 本 次 实 验的目 的 是 将目 前研究 最多的C p G 佐剂 和核 酸 疫苗 共同 作 用， 准备 在 猪上与 不 加佐 剂 的核酸疫苗进行比较研究，看是这种新型的核酸疫苗能否提高本动物的免疫原性。 参考文献略 猪I I 型圆环病毒O R F 2 基因的表达及小鼠免疫试验 林彦星 ， 刘 镇明“ ， 孙彦伟2 ( I . 华南农业大学 兽医学院，广东 广州，5 1 0 6 4 2 ; 2 . 广东 徐铮 ，龚善中 省动物防疫监赞总所，广东 广州，5 1 0 2 3 0 ) 摘 要:重组原核表