H5N1亚型高致病性禽流感病毒人工感染家猫的病理学研究

禽类传染病H 5 N 1 亚型高致病性禽流感病毒人工感染家猫的病理学研究 常爽1 , 2 ，夏咸柱 1 ，丁壮2 ，高玉伟 1 ， 杨松涛I ，邹啸环 1 ，王铁城 1( I . 军事医学 科学院1 1 所，长春1 3 0 0 6 2 ; 2 . 吉 林大 学畜 牧兽医学院，长春1 3 0 0 6 2 ;摘 要: 本研究 应用经S P F 鸡胚增殖的 虎源高 致病性禽流 感病 毒A / T i g e r / H a r b in / 0 1 / 2 0 0 3 ( H 5 N 1 ) 株， 其对M D C K细 胞的T C I D 5 0 为1 0 - 7 .3 6 / 0 .0 5 m l ， 经气管 接种人工 感染家 猫， 对感染 致死的家猫和对照组1 只家 猫采取肺脏进行组织病理学观察和免疾组织化学染色， 同时进行病毒分离 和对耐过家猫与对照组家猫进行H I抗体检测。结果表明:剖检感染的死亡家 猫发现以 肺脏的 损害最为明显， 肺叶上有大片暗红色实变灶，光镜观察见有弥漫性肺泡损伤，融合性炎性病变，浸润的主要为单核细胞，病灶与周围 肺组织分界清楚， 肺泡腔内可见较多量巨 噬细胞浸润及少童蛋白 样浆液渗出。免疫组织化学染色 发现在支气管上皮细胞和少数肺泡上皮细胞、单核细胞胞浆中可见到该病毒的抗原阳 性染色 颗粒.用S P F 鸡胚从2 只死亡家猫肺标本中均分离回收到了 所接种的H P A I V ;在耐过康复家猫血清中， 检出1 : 3 2 的该病毒H I 抗体。关键词:高致病性禽流感病毒 ( H P A I V);家猫;组织病理学;免疚组织化学; 禽流感是由A型流感病毒引 起的、 主要流行于动 物和人类中的一 种传染 快、 死亡率高的急性、高度传染性疾病，广泛发生于世界各地，对养禽业危害很大. 专家警告:当前流行于亚洲的高致病性禽流感已经突破种间屏障， 可能在人间大流行， 并将导致世界数百万人发病死亡 1 0 1 9 9 7 年在香港发现禽 流感 病毒可 使人感染致死 2 a H P A I V 感染患 者的 共同 特征是发热、 淋巴 细胞减少， 多半死于 进行性 肺炎( 以 间质 性肺炎为主的 弥漫性 肺损伤) 3 , 4 5 ,6 ， 死于 禽流感病毒感染的 虎同 样表 现出 严重的 肺炎， 这与 人流感病毒 感染所致的 病理变化不同。 近年来， A型禽流感病毒与其宿主之间的关系存在着明显的变化， 严重影响人类的健康。 2 0 0 3 - 2 0 0 4 年在 亚 洲 爆发的A型 禽 流 感 ( H 5 N 1 ) ， 不 但导 致 家 禽的 极高 死 亡率， 而 且导 致了3 4 人感染， 其中2 3 人死亡。 在这次的爆发过程中， 致病性H 5 N1 亚型禽流感病毒在家猫和动物园内的猫科动物之间传播。家猫通常对A型流感病毒具有抵抗力。为弄清A型禽流感病毒感染家猫的病理特征， 本试验通过气管内接种途径人工感染3 月龄健康家猫进行病毒学和病理学技术检测， 进而为禽 流感的 诊断 和发病机制提供病理学依据。1材料与方法1 . 1实验室设备 本研究中有关H 5 N l 流感病毒的 操作均在3 级生物安全实验室内 进行， 其它实验操作在常规实验室 ( 2 级生物安全实验室)内进行。1 .2病毒 虎源H P A I V A / T i g e r / H a r b in / 0 1 / 2 0 0 3 ( H 5 N 1 ) 毒株，由 本室分离、 鉴定并 纯化， 在一 7 0 0C保 存备用。 其 对M D C K 细 胞的T C I D 5 o 为1 0 / 0 .0 5 m l o1 .3试验动物 选取对该病毒H I 抗体小于 1 : 2 的3 月龄健康家猫6 只，饲料、饮水高压消毒。1 .4试验设计 将试验的家猫 6 只随机分为2 组，接种组3 只，每只家猫气管内接种该病毒的稀释液l m l ， 含毒量为1 0 “ 个T C I D 5 o ， 对照组3 只，同 样 途径接种生理盐水I m l 。 接种组和对照组饲养于不同的隔离器中， 严格隔离饲养， 每天观察记录及死亡情况， 对感染致死的家猫及对照组 1 只家猫，取其肺脏进行病毒分离和病理学检测，耐过家猫与对照组家猫进行H I 抗体检测。1 . 5 病理组织学观察与免疫组织化学染色 1 . 5 . 1 病理组织学检测方法 按常规方法7 进行， 采集发 病死亡家猫和 对照组l 只家猫， 取其肺组织固定于4 % 多聚甲醛中，经过梯度乙醇逐级脱水、二甲苯透明、经苏木精一 伊红染色 ( H E 染色) ，石蜡浸透、 包埋、 制备4 g m厚的 石蜡切片。光镜观察家猫的病理组织学变化。1 . 5 . 2免疫组织化学染色方法第六届理事会第二次会议盛教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 采用 S P免疫组化试剂盒 ( 由 武汉博士得公司提供) ，所用的一抗为小鼠抗虎源流感病毒单克隆 抗体( 由 本室制备并保存) ， 稀释度为l : 2 0 0 。 二抗为生 物素标记的山 羊抗小鼠I g G o载有样品的玻片经常规脱蜡至水化后，用 P B S ( 0 .0 1 M, P H 7 .4 ) 冲洗三次，每次 3 分钟。对组织抗原进行相应的修复后，P B S 冲洗三次，每次3 分钟。每张切片加 1 滴或5 0 u l 过氧化酶阻断溶液 ( 试剂A) ，室温下孵育 1 0 分钟， P B S 冲洗三次，每次3 分钟。除去P B S 液，每张切片加 1 滴或5 0 u l 正常非免疫动物血清 ( 试剂B ) ，室温下孵育 1 0 分钟。除去血清，每张切片加 1 滴或5 0 u 1 第一抗体，4 过夜。 P B S 冲洗三次， 每次3 - 5 分钟。除去P B S 液，每张切片加 1 滴或5 0 u 1 生物素标记的第二抗体 ( 试剂C ) ，室温下孵育 1 0 分钟。P B S 冲洗二次， 每次3 分钟。 除去P B S 液， 每张切片加 1 滴或5 0 u 1 链霉菌抗生物素一 过氧化物酶溶液 ( 试剂D ) ， 室温下孵育 1 0 分钟。 P B S 冲洗三次， 每次3 分钟。 除去P B S 液， 每张切片加2滴或I 0 o u l 新 鲜配 制的D A B 溶液， 显微 镜下观察3 - 1 0 分钟。自 来水冲洗， 苏木精复染， 中性树胶封片， 显微镜观察并拍照。 试验切片出现棕色或棕黄色颗粒则判为阳性， 无此反应判为阴性。2结果2 . 1临床症状观察及剖检变化 实验组的3 只家猫在接种后的3 - 4 天，开始出现精神沉郁， 食欲下降和体温升高， 感染家猫分别于第7 天和第 1 0 天各病死l 只，余下1 只耐过。剖检感染的死亡家猫发现以肺脏的损害最为明显，肺叶上有大片暗红色实变灶。( 图1 略)健康对照组家猫均无异常变化。2 . 2组织病理学变化 病毒对家猫的损害主要见于肺脏， 见有弥漫性肺泡损伤， 融合性炎性病变， 浸润的主要为单核细胞， 病灶与周围肺组织分界清楚。 肺泡腔内可见较多量巨噬细胞浸润及少量蛋白 样浆液渗出。( 图2 略)健康对照组家猫各种细胞层次清晰，未见病理改变。2 .3免疫组织化学染色结果 肺脏中的病毒主要分布在少数肺泡上皮细胞、 单核细胞中， 大部分位于胞浆， 在核内可以见到该病毒的阳性染色颗粒， 在支气管上皮细胞可见到阳性染色颗粒。 ( 图3 , 4 略) 健康对照组家猫在肺组织中未检测到该病毒的阳性染色颗粒。2 .4感染家猫的H I 抗体检测及病毒回收 用S P F 胚从2 只死亡家猫肺脏组织中均分离回收到了所接种的H P A I V ，健康对照组家猫肺组织中未分离到病毒。在耐过康复家猫血清中，检出1 : 3 2 的该病毒H I 抗体效价，而对照组家猫未见异常。3讨论 本试验通过气管内接种途径人工感染3 月龄健康家猫进行病毒学和病理学技术检测， 发现剖检感染的死亡家猫发现以肺脏的损害最为明显， 肺叶上有大片暗红色实变灶。 通过病理学观察家猫肺脏的组织切片见有弥漫性肺泡损伤， 融合性炎性病变， 浸润的主要为单核细胞，病灶与周围肺组织分界清楚， 肺泡腔内可见较多量巨噬细胞浸润及少量蛋白样浆液渗出。 免疫组织化学染色结果观察， 肺脏中的病毒主要分布在少数肺泡上皮细胞、 单核细胞中， 大部分位于胞浆， 在核内可以见到该病毒的阳性染色颗粒，粒。 K u ik e n T IB l通过不同 途径实 验室感染4 - 6在支气管上皮细胞可见到阳性染色颗月龄的欧洲短毛猫并通过病毒学和病理学技术进行检测， 剖检发现肺脏实变， 多发性坏死灶， 组织学观察肺泡弥漫性破裂， 通过病毒学和免疫组织化学分析， 证实组织损害是由H 5 N 1 型病毒感染引起， 可感染与虎同为猫科动物的家猫，引起弥漫性肺泡损伤以及导致临床疾病或死亡。 2 0 0 3 年1 2 月泰国动物园的两只虎和两只豹死于H 5 N 1 流感病毒感染， 临床病状主要为高热、 呼吸窘迫。 剖检呈现严重的肺组织实变和) 泛性出血， 病理组织学检杏见细支气管和肺泡上皮细胞消失和肺泡壁增厚， 肺泡腔中 有包含纤维蛋白 、 嗜中 性粒细胞和巨 噬细胞的 浆液性渗出 19 1 。 本试验采用了 光镜和免疫组织化学的方法进行组织病理学观察， 结果均表明H 5 N 1 流感病毒可以感染家猫并引起与人和虎感染相似的临床症状与病理变化。 研究人类H 5 N 1 引起的病毒性肺炎时， 家猫可作为研究禽类传染病H 5 N 1 高致病性禽流感的动物模型，进而为研究禽流感的诊断，防治提供更多依据。参考文献略高致病性禽流感病毒人工感染小鼠组织病理学研究 常夹1 , 2 , T壮2 ， 杨松涛1 ，高玉 伟1 ， 王承宇1 ， 邹啸环1 ， 王铁城1 , 夏咸柱I *( 1 军事医学科学院军事兽医 研究所，长春 1 3 0 0 6 2 ; 2 吉林大学畜牲兽医学院，长春 1 3 0 0 6 2 )摘 要: 本研究 应用经S P F 鸡胚增殖的虎源高 致病 性禽流感病 毒A / T i g e r / H a r b in / 0 1 / 2 0 0 3 ( H 5 N 1 ) 株， 其对MD C K细胞的T C I D 5 0 为 1 0 - 7 .3 6 / 0 . 0 5 m 1 ， 经滴鼻接种途径人工感染小鼠， 无菌采取感染致死的小鼠 和对照组小鼠肺、脑等脏器进行组织病理学观察和免疚组织化学染色以及透射电 镜观察。结果表明:感染死亡小鼠以 肺脏的损害最为明显. 病理组织学光镜观察， 肺泡腔不同 程度的缩小， 胞腔内 有少量蛋白 样装液渗出，肺泡间隔不同 程度的增宽， 肺内小血管及肺泡间隔的毛细血管扩张、淤血，支气管内充血.免疫组织化学染色 发现， 在支气管上皮细胞和较多的肺泡上皮细胞和浸润的单核细胞胞浆内 可见到该病毒的抗原阳性染色 颗粒。电镜超微结构观察， 在小鼠 肺泡扁平上皮细胞表面和肺泡腔中 可见到短杆型和圃 型的流感病毒样粒子。关键词:高 致病性禽流感病毒 ( H P A I V ) ;小鼠;组织病理学;免疫组织化学 高 致病性禽流感 ( H ig h ly p a t h o g e n ic A v ia n I n fl u e n z a , H P A I ) 是由A型流感病毒中的一些H 5 和H 7 亚型病毒引起的、具有高度传染性、危害机体多种器官、高死亡率的一种禽类烈性传染病， 由高致病性禽流感病毒引发的禽流感给养禽业造成了毁灭性的打击， 被国际兽医疫局列为A类烈性传染病。禽流感被认为是人流感病毒发生变异的最大新基因库，与人 类流感的关系非常密切， 禽流感的暴发和流行， 将增加禽流感病毒与人流感病毒发生基因重排的机会，增加新流感病毒产生的机率，对人类的健康构成潜在的威胁，1 9 9 7年香港禽流感事件， 首次表明禽流感毒株可直接感染人并致人死亡， 成为首次发生的禽流感病毒直接感染人的事件 11 ， 特别是近年来越来越多的个案说明 禽流感病毒已 突破种间屏障向 人传播，据世界卫生组织调查统计，截至2 0 0 6 年3月，已有 1 7 4 人确诊被H 5 N 1 高致病性禽流感病毒感染，并己有9 4 人死亡，病死率高达5 0 。有关专家认为，禽流感对人比非典更具有威胁性。H P A I V感染患者的共同特征是发热、淋巴细胞减少，呈现不同程度的急性呼吸窘迫综合征( A R D S ) ， 多半死于 进行性肺炎( 以 间 质性肺炎为 主的弥漫性肺损伤) 2 . 3 . 4 . 5 1死于 禽 流感 病毒 感染的 虎同 样 表 现出 严重的 肺炎 6 1 ， 这与 人 流 感 病毒 感染 所 致的 病理 变 化不同。 为弄清虎源H 5 N 1 高致病性禽流感病毒感染小鼠的致病机理， 本试验通过滴鼻接种途径人工感染小鼠进行病理学检测，以期为禽流感的诊断和发病机制提供病理学依据。1材料与方法1 . 1实验室设备 本研究中有关H 5 N 1 流感病毒的操作均在3 级生物安全实验室内进行， 并且操作人员必须穿戴合适的防护用品。其它实验操作在常规实验室 ( 2 级生物安全实验室)内进行。1 .2材料 1 . 2 . 1病毒 将本实 验室分离