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DNA重组,第六章,DNA的重组,DNA分子内或分子间遗传信息的重新组合。重组产物为重组体DNA(recombinantDNA)。DNA的重组广泛存在于各类生物。真核生物基因间重组多发生在减数分裂(meiosis)时同源染色体之间的交换（crossover)。细菌及噬菌体的基因组为单倍体，来自不同亲代两组DNA之间可通过多种方式进行遗传重组。DNA重组对生物进化起着关键的作用。生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程。生物进化以不断产生可遗传的变异为基础。首先有突变和重组，由此产生遗传的变异，然后才有自然选择(naturalselection)，才有进化。可遗传变异的根本原因是突变。然而，突变的机率很低，而且多数突变是有害的。如果生物只有突变没有重组，在积累具有选择优势的突变同时不可避免积累许多难以摆脱的不利突变，有利突变将随不利突变一起被淘汰，新的优良基因就不可能出现。重组的意义在于，它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)；使有利突变与不利突变分开(separation)；通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程。它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受DNA重组的调节。,三、转座重组(transpositionrecombiation)DNA上的核苷酸序列可以从一个位置转移到另外一个位置,一、同源重组(homologousrecombination)2个DNA分子之间具有同源序列,二、位点特异性重组(site-specificrecombination)重组发生在特异性位点，需要专门的酶识别和结合特异性位点,DNA重组的主要形式,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称一般性重组。真核生物同源染色体的非姊妹染色单体的交换，姊妹染色单体的交换，细菌的接合、转化和转导等都属于这类型。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,第一节同源重组,真核生物同源染色体的非姊妹染色单体的交换,1.任意两个同源DNA片段在细胞内均可能重组，但是要做到这一点，两个同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应的顺序方能交换，这就称为联会。,2.重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失（称为空隙gap）因此许多DNA损伤因素，像UV，X光和诱变剂等均可使重组频率增高。,DNA重组的条件：,3.重组酶（或重组蛋白质）催化重组反应的发生,Holliday结构,如果是两个DAN双螺旋分子进行交叉重组，则将形成一个四螺旋作为中间物，这样的中间物的存在是RH在六十年代首先提出来的，称为Holliday结构或交叉结构。,1.Holliday结构的概念,2.Holliday结构的形状,图6-2电镜下的Holliday连接,3.两个双链DNA的重组Holliday结构的形成,一、同源重组的分子机制Holliday模型,十字型两臂旋转，异构化形成中空的十字型结构,Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤,两个同源染色体DNA排列整齐一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。切开的方式不同，所得到的重组产物也不同。,片段重组体(patchrecombinant)切开的链与原来断裂的是同一条链(见Holliday模型左边的产物)，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA,拼接重组体(splicerecombinant)切开的链并非原来断裂的链(模型右边产物)，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动。DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。,同源重组的双链断裂模型1个DNA分子上的双链断裂才能启动链的交换。产生断裂的链被称为受体双链，不产生断裂的链被称为供体双链。随后发生DNA修复合成以及切口连接导致Holliday结构。,二、参与同源重组的主要蛋白质,已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促进同源重组各步骤有关的酶，研究最多的还是大肠杆菌的酶。保守的8碱基非对称序列大肠杆菌DNA每5-10Kb自然发生一次被recBCD酶所识别刺激重组重组热点,1、chi位点,2、recBCD酶,解旋酶活性：在SSB存在时解开双螺旋ATP酶活性核酸外切酶活性核酸内切酶活性产生DNA单链,3、RecA,主要功能是促进同源序列配对和链交换，RecA含有2个DNA结合位点，能分别结合单链DNA和双链DNA，当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝(helicalfilament)。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。,RecA蛋白的另外一个结合位点与双链DNA作用，部分解旋以便阅读碱基序列，迅速扫掠寻找与单链互补的序列。互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋以允许转换碱基配对，使单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来(图6-4)。交换沿单链53方向进行，直至交换终止，在此过程中由RecA水解ATP提供反应所需能量。,图6-4RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换,三个条件三个步骤,4、RuvAB复合物置换RecA,RuvA（四聚体）识别Holliday连接体的结构在交换点处与DNA四条链结合RuvB（六聚体）ATP酶，有解旋酶活性为分支迁移提供动力,图6-7RuvA、RuvB和RuvC在同源重组中的作用,分支迁移,核酸内切酶切开Holliday连接体识别不对称位点ATTG,5、RuvC,图6-6RuvC的作用模型,RecBCD同源重组途径,RecBCD蛋白在chi位点3侧的一条链上产生切口。RecBCD蛋白同时具有解螺旋酶的活性，使chi位点附件切口的DNA解链单链区被RecA蛋白和SSB蛋白覆盖RecA蛋白使单链DNA取代双链DNA中的同源部分Dloop区域的DNA产生切口，新切口的3端（thetailofnewlynickedDNA）与另一条DNA的单链区互补配对DNA连接酶封闭切口，形成HollidayjunctionRuvA和RuvB发动迁移反应RuvC拆分重组中间体,真核细胞利用同源重组参与DNA损伤修复,第二节位点特异性重组,同源重组一般都在染色体内仍然保持各DNA序列的原来排列次序，但是在所谓位点特异性重组中，DNA节段的相对位置发生了移动，从而得到不同的结果DNA序列发生重排。,位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性，而依赖于能与某些酶结合的DNA序列的存在。这些特异的酶能催化DNA链的断裂和重新连接，它们能发动位点特异性重组作用。而在同源重组中，DNA链的切断是随机的，结果暴露出一些能与RecA这样的蛋白质相结合的顺序，从而发动重组。,图6-10位点特异性重组图解,重复位点方向相反（反相重复）,重复位点方向相同（直接重复）,（特异性整合位点在B与C交界，红色BA基因移动）,噬菌体DNA的物理状态裂解状态（phage）：为独立分子形式在受侵染细菌中为环状溶原状态（Prophage）：细菌染色体的整合部分,（原噬菌体）,整合,切除,整合在附着位点（attachmentsites）上发生,例（一）噬菌体DNA的整合,图6-11噬菌体的位点特异性整合,整合宿主因子：IntegrationHostFactor，IHF,图6-12噬菌体重组整合或切除时切点的序列,图6-13酪氨酸重组酶的作用机制,2条DNA链如何整合连接？,图4-19DNA拓扑异构酶的催化的转酯反应,在att位点的整合和切离并不涉及反应序列的同源部分。整合需识别attP和attB；而切离时需要attL和attR。整合和切离这两个反应所依赖的蛋白不完全相同。整合（attBattP）反应需要噬菌体Int酶（Integrase，Int）和宿主的整合因子（integrationhostfactor,IHF）。切离（attLattR）反应需要噬菌体Xis，Fis基因的产物以及Int和IHF蛋白的参与。两个反应都需要Int和IHF，而Xis在控制方向上起到重要的作用。它是切离所需要的，对整合起抑制作用。,第三节转座重组,一.转座重组的概念,所谓的转座重组是指DNA上的核苷酸序列从一个位置转移到另外一个位置的现象。发生转位的DNA片段被称为转座子、转座因子或移动基因等。,与前2种重组不同的是，转座子的靶点和转座子之间序列不需要同源性，接受转座子的靶位点绝大多数是随机的。,目前已知转位因子的大小为75040000bp。,二、原核生物的转座因子,1、第一类转座子即插入序列（InsertionSequence，IS）是简单转座模序只编码起始自己转座的蛋白转座频率各异结构特点：两侧末端为反向重复序列（invertedrepeats，IR）,图6-15第一类转座子的结构,2、第二类转座子（复杂性转座子）带有编码转座功能酶的基因及抗性（或其他标记）基因,复杂性转座子的结构,(transposon，Tn),3、第三类转座子（复合性转座子）由2个IS和一段带有抗性（或其他标记）基因组合而成,复合性转座子的结构,4.可转座的噬菌体,可转座的噬菌体包括Mu噬菌体和D108两种。性质类似于温和噬菌体。（但温和噬菌体的插入位点是专一的。）这类噬菌体插入位点几乎是随机的。（也可以插入到结构基因的内部。）当细菌感染了这类噬菌体以后，可以引起一系列的插入突变。特点是在插入部分的两侧有短的直接重复顺序。（一个拷贝留在原位，另外一个新合成的，拷贝插入到新的位点中去引起宿主基因组突变。）Mu不含末端反向重复顺序。,三、真核生物的转座子,玉米地中的先知BarbaraMcClintock（芭芭拉麦克林托克）Hello,IamBarbaraMcClintock.EversincegradateschoolIhadbeeninterestedinCorn.Itriedtocorrelatechromosomebehaviorwiththeresultofbreedingexperimentsincorn,若玉米带有野生型C基因，则胚乳呈紫色；C基因的突变阻断了紫色素的合成，那么胚乳呈黄色。McClintock推测原来的C突变（无色素）是由一个“可移动的控制因子”引起的，称解离因子（dissociator，Ds），它可以插入到C基因中（即转座）。另一个可移动的控制因子是激活因子（activator，Ac），它的存在可激活Ds转座，进入C基因或其他基因，也能使Ds从基因中转出，使突变基因产生“回复突变”，这就是Ac-Ds系统,Ac-Ds系统,图6-21Ac和Ds的结构比较,图6-22玉米的Ac-Ds系统,现在已经证明转座事件是真核生物极为普遍的现象，人、小鼠和水稻的基因组有40的序列由转座子衍生而来。,以上2种转座子都有自主型和非自助型两种，自主型转座子携带有编码转座所必需的酶或蛋白质，能独立地进行转座；非自助型转座子不具备编码转座所必需的酶或蛋白质的基因，但是保留了转座所必须的顺式作用元件，可以在自主型的帮助下进行转座。,真核生物转座子可以分为保留型转座子和复制型转座子，保留型转座子在转座前后，原有的拷贝被原封不动地转移保留到新的位点。而复制型转座子是将转座子序列复制一份，并转移到新的位子，原位置上的拷贝没有消失。,四.转位因子的转位机制,1、保留型转座（conservativetransposition）,缺口不被修复后果严重,靶位点序列上出现重复序列,2、复制型转座（replicativetransponsition）,转位因子转位的结果是原来位置上的转位因子仍然留在原位，而把新合成的DNA复本插入到另外一个位置上去,根据转座的机制，分为需要RNA中间体的逆转座和无RNA中间体的转座。,2.1复制型转座的机制需要RNA中间体,逆转座子的转座机制,2.2复制型转座的机制不需要RNA中间体,(五).转位作用的某些遗传效应,1.基因重排,基因重排：基因在DNA分子上有一定排列和组合。但是这种排列和组合不是一成不变的，在生活的细胞中以至在个体发生和种系进化过程中，基因重排经常发生，转位作用则是基因重排的重要机理之一。,2.引起突变,转位可能引起多种基因突变，如果转位因子插入一个基因的内部，就会引起