DNA重组技术 (2).ppt

第六章DNA重组技术,佛山科学技术学院唐冬生广东医学院黄迪南,第六章DNA重组技术,DNA重组（DNArecombination）不同来源的DNA，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程。,DNA克隆（DNAclone）在体外对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子，再导入宿主细胞进行大量扩增，最终获得大量同一的DNA分子亦称分子克隆或DNA重组技术,第六章DNA重组技术,第六章DNA重组技术,第二节常用载体,第三节DNA重组与鉴定,第一节常用的工具酶,第一节常用的工具酶,第一节常用的工具酶,工具酶：DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对DNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被称为工具酶。,主要的工具酶:,限制性核酸内切酶DNA连接酶逆转录酶DNA聚合酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶,第一节常用的工具酶,第一节常用的工具酶,二、DNA连接酶,三、分子克隆中常用的其他酶,一、限制性内切酶,一、限制性内切酶,简称限制酶，是DNA重组技术的基本工具识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶,一、限制性内切酶,（二）命名,（三）类限制性核酸内切酶识别序列特点,（四）限制性内切酶的应用,（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力,（六）甲基化酶,（一）分类,（一）分类,根据酶的分子组成及裂解方式的不同，将限制性内切酶分为三类：1.类和类限制性内切酶,一、限制性内切酶,兼有修饰作用和依赖于ATP的限制活性在DNA重组技术中并不常用,一、限制性内切酶,2.类限制性内切酶能识别并切割特异性的核苷酸序列通常所说的限制性内切酶即指此类,（二）命名,通常由三个斜体字母表示1.第一个大写字母为微生物属名的第一个字母2.第二、三个小写字母为微生物种名的头两个字母3.如有株名则再加一个字母,一、限制性内切酶,一、限制性内切酶,4.同一株微生物发现几种限制性内切酶，根据其发现和分离的先后顺序，用罗马数字表示例如:淀粉液化芽胞杆菌（Bacillusamyloliguefaciens）H株第1种限制性内切酶，命名为BamH,(三)类限制性核酸内切酶识别序列特点,切口：平端切口-平末端粘端切口-粘性末端,回文结构,一、限制性内切酶,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,一、限制性内切酶,+,BamH,+,Bst,1.同功异源酶：来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,一、限制性内切酶,BamH,Bgl,+,+,2.同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。,一、限制性内切酶,（四）限制性内切酶的应用,主要应用：DNA重组克隆及亚克隆改造和构建质粒组建基因组DNA物理图谱基因组DNA同源性研究DNA杂交DNA序列分析,一、限制性内切酶,一、限制性内切酶,（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力,1.酶活力单位,2.星号活力,3.注意事项,1.酶活力单位在合适温度、pH值和离子强度等条件下，1小时内完全消化1g特异DNA底物所需的酶量，定义为一个活力单位。,（五）限制性内切酶的活力单位和星号活力,一、限制性内切酶,2.星号活性限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加“*”表示克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶的特异性,一、限制性内切酶,3.注意事项底物DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚溶液中不能含SDS和过量的盐，EDTA的含量不能大于10mmol/L,一、限制性内切酶,反应缓冲体系中一般可加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活加入牛血清白蛋白稳定酶活性操作时应注意混匀反应体系,一、限制性内切酶,一、限制性内切酶,2.类限制修饰系统,3.甲基化酶的应用,(六)甲基化酶,1.细菌的限制修饰系统,(六)甲基化酶,1.细菌的限制修饰系统限制（降解）外来DNA，并通过对自身DNA的修饰而起保护作用。,一、限制性内切酶,一、限制性内切酶,2.类限制修饰系统由两种酶分子组成的二元系统一种为限制性内切酶，另一种为甲基化酶两种酶识别序列相同大肠杆菌株一般有dam甲基化酶和dcm甲基化酶（Pst甲基化酶使A甲基化形成5-CTGCmAG-3）,3.甲基化酶的应用,当制备克隆用双链cDNA时，外源DNA片段可用EcoR甲基化酶处理，使双链cDNA内部EcoR位点因甲基化受到保护而不被切割,一、限制性内切酶,二、DNA连接酶,催化双链DNA中相互邻近的5磷酸末端和3羟基末端生成磷酸二酯键，从而封闭DNA双链中的切口或将二个DNA分子连接起来。,二、DNA连接酶,DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接DNA连接酶是重要的基因重组的工具酶应用DNA连接酶将具有相同粘性末端或平端的DNA分子连接起来,DNA连接酶的特点：T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端的DNA分子大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶,二、DNA连接酶,T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子连接反应需要ATP、Mg2+和二硫苏糖醇，最适pH为7.27.4，ATP为连接反应提供能量，二硫苏糖醇可提高连接效率,二、DNA连接酶,三、分子克隆中常用的其他酶,1.逆转录酶,2.TaqDNA聚合酶,3.T4多核苷酸激酶,4.末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）,5.碱性磷酸酶,6.DNA聚合酶,7.Klenow片段（DNA聚合酶大片段）,三、分子克隆中常用的其他酶,1.逆转录酶以RNA为模板逆转录合成cDNA2.TaqDNA聚合酶PCR扩增目的DNA片段DNA序列分析目的DNA片段3端加A，用于AT克隆,三、分子克隆中常用的其他酶,3.T4多核苷酸激酶催化多聚核苷酸5端羟基磷酸化标记探针5端4.末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）DNA片段3端加上同聚物尾标记DNA片段3端5.碱性磷酸酶去除多聚核苷酸5端磷酸基团,6.DNA聚合酶合成双链DNA分子缺口平移法，获得高比活性探针DNA序列分析补平3端,三、分子克隆中常用的其他酶,7.Klenow片段（DNA聚合酶大片段）具有完整的DNA聚合酶活性保留35外切酶活性无53外切酶活性,三、分子克隆中常用的其他酶,Klenow片段的主要应用：合成cDNA第二链补齐双链DNA分子3端或标记3端DNA序列分析,三、分子克隆中常用的其他酶,第二节常用载体,载体（vector）的概念携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。,第二节常用载体,第二节常用载体,常用的载体主要有：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等根据其用途不同分为：克隆载体（cloningvector）表达载体（expressingvector）,载体构建和选择的条件：,1.自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力2.合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入3.分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数,第二节常用载体,第二节常用载体,4.常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等5.配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等,第二节常用载体,二、噬菌体载体,三、穿梭载体,四、人工染色体,一、质粒载体,一、质粒载体,质粒载体是应用最广的载体质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复制,理想质粒载体的特点：,1.松驰型复制子（如ColE1）复制子（replicon）为质粒自我增殖所必需2.几个单一的酶切位点（或多克隆位点）以便目的DNA片段插入,一、质粒载体,一、质粒载体,3.插入失活的筛选标志具有两种抗生素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等。4.分子量相对较小和拷贝数较高5.缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的DNA,一、质粒载体,（一）pBR322质粒载体,（二）pUC质粒载体系列,（一）pBR322质粒载体,pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一pBR322载体的组成：来源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点来源于pSF2124质粒易位子Tn3的Ampr来源于pSC101质粒的Tetr,一、质粒载体,pBR322质粒载体的特点：,1.带有一个复制起始点（ori）2.抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标志3.数个单一的限制性酶切位点,一、质粒载体,4.较小的分子量易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。5.较高的拷贝数每个细胞达10003000个拷贝。,一、质粒载体,一、质粒载体,r,r,pBR332质粒结构示意图,（二）pUC质粒载体系列,在pBR322基础上改建而成,一、质粒载体,典型的pUC质粒载体有4个组成部分：来自pBR322质粒的复制起始点Ampr基因大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（LacZ）启动子及编码-肽链的DNA序列（LacZ基因）多克隆位点（位于LacZ基因中靠近5端）,一、质粒载体,pUC系列的优越性,最通用的大肠杆菌克隆载体之一优点具有更小的分子量和更高的拷贝数仅保留了pBR322的复制子和Ampr具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ基因，适应于组织化学筛选重组体,一、质粒载体,一、质粒载体,r,pUC18/pUC19质粒载体结构,二、噬菌体载体,噬菌体载体粘粒载体称柯斯质粒（cosmid）单链丝状噬菌体载体,二、噬菌体载体,gt10（插入型）结构,二、噬菌体载体,Charon40（替换型）结构,二、噬菌体载体,r,粘粒载体pJB8结构,二、噬菌体载体,M13mp18/M13mp19结构,三、穿梭载体,同时具有原核和真核细胞的复制起始点真核生物的克隆载体常构建成穿梭载体，使其先在大肠杆菌中扩增，再转入真核细胞若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因,三、穿梭载体,真核系统载体还必需具备适当的筛选标记使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）抗新霉素基因,三、穿梭载体,（二）逆转录病毒载体,（一）SV40（猿猴病毒）载体,（一）SV40（猿猴病毒）载体,真核表达载体中的调控元件大都来源于SV40的调控顺序和复制信号用SV40DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒重组子不包装成病毒颗粒，而在细胞中复制或整合到染色体组中,三、穿梭载体,例：PSVK3质粒,PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。,三、穿梭载体,PSVK3具有下列构件：1.原核系统构件：复制子和丝状噬菌体复制起始位点fl筛选标志（Ampr）启动子（T7启动子）2.真核系统构件：SV40复制起始点SV40早期启动子,三、穿梭载体,3.RNA修饰信号：SV40小T抗原拼接信号SV40早期区mRNApolyA加尾信号4.多克隆位点：SV40启动子下游有8个酶切位点,三、穿梭载体,三、穿梭载体,pSVK3质粒,（二）逆转录病毒载体,逆转录病毒载体的特点：具有广泛的哺乳动物细胞宿主较大的容量，能插入7kb甚至更大的外源基因,三、穿梭载体,病毒基因组自身含有完整高效的调控元件病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系,三、穿梭载体,逆转录病毒载体的局限性：逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并整合到分裂增殖期的细胞装载容量较小，仅8kb左右可能存在具有复制能力的野生型病毒,三、穿梭载体,常用外源DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，称为卸甲载体（disarmedvector）。,三、穿梭载体,四、人工染色体,酵母人工染色体（YAC）细菌人工染色体（BAC）噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC）哺乳动物人工染色体（MAC）,YAC主要调控元件,着丝粒：保证染色体细胞分裂过程中正确分配到子代细胞端粒：防止染色体被核酸外切酶降解复制起始点和限制性内切酶位点,四、人工染色体,筛选标志：酵母中一般通过色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活而进行筛选原核序列及调控元件：包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等,四、人工染色体,YAC作为载体的主要特点：,酵母是单细胞真核生物，培养方便酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因装载容量大，可达Mbp水平,四、人工染色体,DNA片段连接到YAC载体的（两）臂上形成重组体，将重组体通过常规方法导入酵母已广泛应用于各种生物基因组计划,四、人工染色体,第三节DNA重组与鉴定,第三节DNA重组与鉴定,将不同来源的DNA分子进行特异地切割获得的目的基因或DNA片段与载体连接重组的DNA分子导入相应的宿主细胞在宿主细胞中进行无性增殖,DNA重组(DNArecombination),第三节DNA重组与鉴定,第三节DNA重组与鉴定,二、重组子的筛选与鉴定,三、DNA序列测定,一、DNA重组,一、DNA重组,（二）重组DNA分子导入宿主细胞,（一）目的DNA片段与载体的连接,平接法平端连接法人工接头法同聚体加尾连接,一、DNA重组,（一）目的DNA片段与载体的连接,粘端连接法平端连接法,一、DNA重组,2.平端连接,3.同聚体加尾连接,4.人工接头连接,（一）目的DNA片段与载体的连接,1.粘性末端连接,1.粘性末端连接（cohesiveendligation）DNA插入片段与的载体存在同源粘性末端同源粘性末端包括相同一种内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端,一、DNA重组,（一）目的DNA片段与载体的连接,一、DNA重组,2.平端连接(bluntendligation)DNA连接酶可催化相同和不同限制性内切酶切割的平端之间的连接。,一、DNA重组,目的基因,一、DNA重组,3.同聚体加尾连接适用于外源DNA片段与载体均为平末端或为不匹配的粘性末端用末端转移酶使一个DNA分子3端接上多聚A,另一个DNA片段3端接上多聚T，按A-T配对原则相连,一、DNA重组,一、DNA重组,4.人工接头连接将目的基因或DNA片段的两端接上能够被某一限制性内切酶识别的DNA序列，酶切后和载体获得相同的粘性末端，再进行粘性末端的连接。,一、DNA重组,一、DNA重组,宿主细胞：原核细胞（大肠杆菌）真核细胞(哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞)重组DNA分子导入宿主细胞方式：转化、转染和感染,（二）重组DNA分子导入宿主细胞,一、DNA重组,一、DNA重组,（二）重组DNA分子导入宿主细胞,1.重组DNA分子导入原核细胞,2.重组DNA分子直接导入真核细胞,3.使用噬菌体或病毒将重组DNA分子导入细胞,1.重组DNA分子导入原核细胞将重组的DNA分子导入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化(transformation)转化的方法可分为CaCl2法和电穿孔法,一、DNA重组,细菌在生长过程中，只有某一状态的细菌才能成为转化的接受体，这种细菌称为感受态细菌感受态细菌表面正电荷增多，细胞壁和膜的通透性增加，有利于DNA分子的吸附与吸收,一、DNA重组,当细菌处于0、二价阳离子低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，在42短时间热冲击后DNA进入细胞转化效率为每微克DNA可获得105106转化子,CaCl2法,一、DNA重组,电穿孔法（electroporation）即电击法，利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后微孔复原转化效率高，每微克DNA可得到1091010转化子,一、DNA重组,将外源DNA直接导入真核细胞的过程称为转染（transinfection）常用的方法：电穿孔法磷酸钙共沉淀法脂质体法DEAE-葡聚糖介导显微注射法等,2.重组DNA分子直接导入真核细胞,一、DNA重组,磷酸钙共沉淀法将被转染的DNA和正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉淀后，磷酸钙和外源性DNA形成沉淀颗粒附着在细胞表面，在钙、磷的诱导下通过内吞作用被细胞摄取。,一、DNA重组,脂质体法是一种人造膜泡，它带有正电荷，与DNA或RNA上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹DNA的颗粒。脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细胞。,一、DNA重组,显微注射法将外源基因的重组体通过显微注射装置直接注入细胞核中并进行表达，但显微注射法需要一定的仪器和操作技巧。,一、DNA重组,3.使用噬菌体或病毒将重组DNA分子导入细胞重组DNA分子在体外包装成具有感染能力的噬菌体或病毒颗粒，然后感染适当的细胞，这种使用噬菌体或病毒将重组DNA分子导入细胞的方法为感染(infection)效率较高，每微克可得到107转化子,一、DNA重组,二、重组子的筛选与鉴定,（二）根据重组DNA的分子生物学特征进行鉴定,（一）根据遗传学性状进行筛选,二、重组子的筛选与鉴定,（一）根据遗传学性状进行筛选,1.抗性标志筛选,2.抗性标志插入失活筛选,3.互补筛选,4.标志补救筛选,（一）根据遗传学性状进行筛选1.抗性标志筛选当带有完整抗药性基因的载体转入无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。,二、重组子的筛选与鉴定,2.抗性标志插入失活筛选选用含有两个以上的抗药基因载体，外源DNA片段插入其中一个基因，导致这个基因失活，用两个含不同抗生素的平板互相对照，筛选含重组DNA的菌落。,二、重组子的筛选与鉴定,二、重组子的筛选与鉴定,3.互补筛选含有编码LacZ基因的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列当宿主细胞含有-半乳糖苷酶C端编码序列时，此酶的N端序列与宿主细胞的C端序列互补，产生具有活性的-半乳糖苷酶，从而使宿主细菌在含有IPTG/X-gal