基因重组与基因工程(2).ppt

第十七章基因重组与基因工程(geneticrecombinationandgeneticengineer),基因重组(geneticrecombination)是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆(genecloning)将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程(geneticengineering)是将不同来源的DNA片段与载体分子连接形成重组DNA分子，再导入宿主细胞内进行表达，也称重组DNA技术。,本章主要内容重要的工具酶基因克隆常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中的应用,第一节重要的工具酶,工具酶基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。,一、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶作用特性，一般分为、和型，其中常用的是型限制酶。,限制酶（型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构：5粘性末端3粘性末端平端或钝端回文序列(palindrome)是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复;粘性末端(stickyend)是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出和3末端突出的碱基序列相互间具有互补性。,产生5-粘性末端,产生3-粘性末端,产生平(头末)端/钝端,其它特殊性质的型限制酶,同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶,同裂酶,又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。,同裂酶同识同切,同裂酶同识异切,同尾酶,同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。,可变酶,可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，Bstp，其识别顺序为GGTNACC。,常用限制性核酸内切酶的特性,15,限制性内切酶的应用通过切割不同来源DNA双链的特异碱基序列，产生含有黏性末端或平端的、长度不同的DNA片段。用于DNA重组、制备探针、分子杂交、DNA序列分析等。,二、DNA聚合酶,（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶（全酶）DNA聚合酶大片段Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶,DNA聚合酶,E.ColiDNA聚合酶（DNApol）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：53DNA聚合酶活性53核酸外切酶活性35核酸外切酶活性,DNApol应用,常用来催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；cDNA第二条链的合成；对DNA3突出末端进行标记；DNA序列分析。,E.coliDNApol.催化缺口平移,Klenow片段（DNApol.大片断）,Klenow片段用途,补齐双链DNA的3末端；用标记碱基补齐3末端；,用于cDNA克隆中第二股链的合成；DNA序列分析。,TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）,作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075，2）95以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。,三、逆转录酶(reversetranscriptase),特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA以DNA为模板，催化合成cDNA双链。,逆转录酶的应用：将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；补平和标记5-末端突出的DNA片段；代替Klenow酶用于DNA序列分析；制备杂交探针等。,四、DNA连接酶(DNAligase),催化双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO3H2形成磷酸二酯键，从而构成完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5-ACGAATTCGT-3T4DNA连接酶5-ACGAATTCGT-33-TGCTTAAGCA-53-TGCTTAAGCA-5（2）修补带有缺口的双链DNA分子,五、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）,能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。用途制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。用32P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。,六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT),作用将标记或未标记的dNTP加到DNA的3OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用探针标记,P32-.dGTP,G32G32G32G32,G32G32G32G32,在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接,3,3,重要的工具酶,第二节基因克隆常用的载体,载体(vector)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接起来，并运送到宿主细胞的运载工具。其化学本质为DNA分子。,本节主要内容载体必须具备的基本条件载体的分类常用的载体,一、载体必须具备的基本条件,具有独立复制能力具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)具有遗传表型或筛选标记有足够的容量以容纳外源DNA片段可导入受体细胞。,二、载体的分类*,（一）克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体。有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA三类。（二）表达型载体为了使插入的外源DNA能够表达为多肽链而设计的载体称为表达型载体。表达型载体除需载体必备条件外，还需相应的启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等表达调控构件。,三、常用的载体,（一）质粒(plasmid)：,是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数；2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选；3.具有多克隆位点。,总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等,pBR322质粒,4363bp含一个复制点含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)一个抗四环素基因(tetR)ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外源基因插入抗药基因内后，抗药基因失活。AmpRAmp敏感(AmpS)、TetRTet敏感(TetS).,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampR和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有1个来自E.coli的LacZ基因片断,编码半乳糖苷酶，便于蓝白筛选,(二)噬菌体,组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。,噬菌体两种生长途径（示意图）,噬菌体感染细菌后的两种生长途径溶菌性生长噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。,第三节重组DNA基本原理,（DNA重组基本程序包括下列过程）分获取目的基因和载体接目的基因与载体的连接转重组DNA导入宿主细胞筛重组DNA的筛选与鉴定,一、目的基因的获取（分）,目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。目的基因来源1）制备基因组DNA2）制备cDNA3）聚合酶链反应4）人工合成基因,（一）制备基因组DNA（基因文库，genomiclibrary）分离、纯化基因组DNA在EDTA等存在下，用蛋白RE酶K消化细胞、酚抽提；大小不同酶切片段常用蔗糖梯度离心或电泳分离酶切片断；分别与同样RE酶切的载体连接常用噬菌体载体或质粒载体DNA连接酶连接；导入宿主细胞、扩增导入宿主细胞内培养、扩增；得到分子克隆混合体用分子杂交等方法进行鉴定、（基因文库）筛选、再扩增，分离、回收。,（二）制备cDNA（cDNA文库）,分离目的基因的mRNA逆转录生成cDNA单链水解去除mRNA，合成cDNA双链水解回折处单链得到平端双链cDNA,与载体连接，导入宿主细胞扩增构建cDNA文库。,（三）聚合酶链反应(PCR),在体外，以目的基因为模板，在DNA引物、dNTP、TaqDNAPol等存在下，构成一个反应体系。经94变性、54退火及72延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因（见18章）。（四）人工合成基因应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。（一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段）,二、目的基因与载体的连接（接）（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法,（一）粘性末端连接将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。（二）平头末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。,（三）人工接头法合成连接子与DNA平头末端连接限制酶切割,产生粘性末端连接，构建重组DNA。,（四）同源多聚尾连接法,三、重组DNA导入宿主细胞（转）,无性繁殖体外重组后的DNA导入受体细胞，然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。克隆从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞进行无性繁殖时所采用的受体细胞.,重组DNA导入宿主细胞的类型转化以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。感受态细胞用特殊方法处理（CaCL2）后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力，这种细胞称感受态细胞。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。,四、重组DNA的筛选与鉴定（筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法）1）平板筛选2）限制酶切图谱筛选3）PCR筛选重组体4）原位杂交技术,插入失活蓝白筛选,（一）平板筛选是指利用载体的遗传性标记在平板上直接筛选的方法。具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。插入失活当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。,抗生素平板筛选（插入失活）,2.蓝-白筛选利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。,载体：编码-半乳糖宿主：编码-半乳糖苷酶N端序列苷酶C端序列,-互补,细菌表达：-半乳糖苷酶活性,5-溴-4-氯-3-吲哚（X-gal）形成蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主-半乳糖苷酶的C端进行-互补产生白色菌落。,（IPTG存在下）,蓝白筛选示意图,(二)限制性内切酶图谱鉴定,（三）PCR筛选重组体抽提少量重组DNAPCR扩增电泳鉴定序列分析。,（四）原位杂交技术,1、获取,DNA重组基本过程(小结),2、重组,3、转化,体,4、筛选,5、克隆,6、表达,表达产物分离纯化,五、重组体在宿主细胞中的表达和调控基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。克隆基因表达有三个条件基因的编码区不能被插入序列中断;基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA聚合酶有效地识别;mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。,第四节重组技术在医学和制药工业中的应用,一、疾病基因的发现1990年美国科学家率先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成；2001年2月12日由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因；整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。,人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。如已知人类遗传性疾病约有3000种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明遗传病的分子机制，这对遗传病的基因治疗将起到不可估量的推动作用。,产品名称治疗功能与医药范围1.人胰岛素治疗糖尿病2.人生长激素治疗侏儒症，加速创口愈合3.干扰素治疗癌症、病毒感染4.干扰素治疗带状疱疹，眼结、角膜炎5.干扰素治疗癌症、病毒感染6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞7.红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平8.超氧化物歧化酶清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死9.凝血因子治疗A型血友病10.乙型肝炎疫苗防治肝炎11.神经生长因子维持神经元细胞存活、生长和分化12.脑啡肤镇痛13.降钙素治疗骨质疏松症,二、生产蛋白质和多肽类活性物质,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,三、制备基因工程疫苗基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的一些特殊的病原体疫苗。如，（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫苗（HCV）等；（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4）制备一些多价疫苗等。,四、改良物种特性,动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因把YFG放在乳球蛋白的启动子下注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内YFG在乳腺中表达乳汁中提纯YFG蛋白。