基因重组和基因工程(2).ppt

基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering王海河中山医学院,第14章,DNA克隆、测序与重组技术的历史,1973年，StanleyCohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆1977年，AllanMaxam和WalterGilbert的化学裂解DNA测序问世不久，Sanger等的双脱氧测序法20世纪90年代启动人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)重组DNA技术学(RecombinantDNATechnology),第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransferinNature,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。,一、同源重组,E.Coli的同源重组机制,RecBCD复合物具有三种酶活性：核酸外切酶、核酸内切酶、解螺旋酶Chi位点：序列为5GCTGGTGG3，是目前发现的主要重组热点RecA酶：E.coli同源重组过程中最重要的酶，又称为重组酶。可结合单链DNA，并将此DNA插入双链DNA分子的同源区，完成DNA分子间单链交换的重组过程。,Holliday模型的4个关键步骤：,两个同源染色体DNA排列整齐；,一或两个DNA中的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；,通过分支移动产生异源双链DNA；,Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,Holiday中间体,5,拼接重组体,片段重组体,Holliday模型,异源重组体的修复,异源双链重组体内不配对片段的DNA修复,二、细菌的基因转移与重组,（一）接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,可接合质粒如F因子(Ffactor),细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。,质粒,（二）转化作用,通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。,噬菌体的生活史,溶源菌生长途径(lysogenicpathway)“和平共处”溶菌生长途径(lysispathway)“杀死宿主”,三、位点特异重组,(site-specificrecombination),位点特异性重组发生在特殊序列对之间，这一重组型式最早在噬菌体的遗传学研究中发现。噬菌体有两种存在型式：裂解状态和溶源状态。两种类型间的转换通过位点特异性重组实现。,溶源菌生长途径,溶菌生长途径,噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。,（一）噬菌体DNA的整合,噬菌体DNA的整合与切除为了进入溶源状态，游离的DNA必须整合（intergrate）到细菌DNA中去；而为了从溶源状态向裂解状态转化，原噬菌体DNA则必须从细菌染色体DNA上切除（excise）。整合和切除均通过细菌DNA和DNA上特定位点附着点（attachmentsite，att）之间的重组而实现。,细菌染色体上的附着点（att）称为attB，含有B、O、和B三个序列（BOB），长度约25bp。attB突变后可以阻止DNA的整合。,O序列15bp,噬菌体的附着位点称attP，由P、O和P三个序列组成，长度约为240bp。其中O序列是attB和attP所共有的，序列完全一致，长度15bp,称核心序列（coresequence）。是位点特异性重组发生的地方。,O序列,IntegrationHostFactor,2.-DNA从E.coli的切离：,噬菌体的整合和切除1.-DNA对E.coli的整合：,BOPPOB（原噬菌体）,BOB（细菌）,+,POP（噬菌体）,Int,IHF,BOPPOB（原噬菌体）,BOB（细菌）,+,POP（噬菌体）,Int，Xis,IHF,整合过程,整合后的附着位点为attL（BOP）attR（POB）,整合位点-attB、attP切除位点-attL、attR,整合过程需要Int和IHF共同作用切除过程还需要Xis蛋白，Xis通常抑制整合。,反转录病毒基因组结构,产生p60src蛋白质，靶蛋白磷酸化,（二）细菌的特异位点重组,沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。,鼠伤寒沙门氏菌有两相:相：由H1基因表达产生H1鞭毛蛋白相：由H2基因表达产生H2鞭毛蛋白,两相细菌在进行细胞分裂时，以大约1/1000的频率产生另一相的后代，此过程称为相变（phasevariation）。,相变的实质是Hl或H2基因选择性表达的结果,沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变,H抗原刺激机体后主要产生IgG，H抗原分析是沙门氏菌定型的依据。,自然界中存在着数以百万计的各种抗原物质，若一种抗体分子特异性识别和结合一种抗原，体内如何产生这么多种类的抗体分子呢？,免疫球蛋白的基因重排,（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,免疫球蛋白（Ig）的结构,Ig由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。,7bp,9bp,切割位点,重组酶识别位点,此重排的重组酶共有两个，分别由基因rag1、2(recombinationactivatinggene)编码。,RAG1：识别9bp信号序列。,RAG2：结合于RAG1，并在7bp序列处切割。,免疫球蛋白基因重排过程,切割位点,重组酶识别位点,基因拼接过程中的转酯反应,7nt切割位点,9nt重组酶识别位点,H重链,L1V1LnVnD1-12J1-4CC,L1V1LnVnJ1-4C,轻链,转录、加工,AAA,L1V1LnVnD2J1CC,L1V1D2J1CC,L1V1D2J1C,L1V1J1C,组合成Ig分子,小鼠Ig胚系基因片段和重链、轻链配对的多样性基因片段数可变区基因经重排和随机配对后多肽链VJ重组方式推算的多样性数目重链1000124V-D-J4.8104轻链2504V-J1.0103,概念：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。指DNA从一个位置移动到基因组上另一个位置。这些可移动的DNA序列包括：,（一）插入序列(insertionsequences,IS)（二）转座子（transposons）,四、转座重组,插入序列(insertionsequences,IS)组成：,（一）插入序列转座,二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列,特有的正向重复序列,一个转座酶（transposase)编码基因,保守性转座(conservativetransposition),复制性转座(duplicativetransposition),保守性转座(conservativetransposition),复制性转座(duplicativetransposition),插入序列的复制性转座,转座子(transposons)可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。,（二）转座子转座,转座子组成：,反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因,BarbaraMcClintock(1902-1992),Biologist.NobelPrizefordiscoveringjumpinggenesincorn-theninbacteriaandhumans.ColdSpringHarborLaboratory.,细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L,由转座子介导的转座,相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术与医学的关系,主要内容：,第二节DNA重组技术DNARecombinationTechnique,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）DNA克隆,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。,DNA克隆,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的：分离获得某一感兴趣的基因或DNA获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(geneticengineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶,（1）定义：识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。,限制性核酸内切酶存在于细菌体内，与细菌的甲基化酶构成限制修饰体系。,+,限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE),分子手术刀,（2）限制酶的分类:类、类、类,（3）限制酶的命名,EcoR,E：代表细菌的属名,co：代表细菌的种名,R：代表菌株,：发现次序,（4）限制酶的特点,识别序列：回文结构,5-GAATTC-33-CTTAAG-5,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,切割方式,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,BamH,+,Bst,同功异源酶：,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。,BamH,Bgl,+,+,同尾酶,限制性内切核酸酶,（三）目的基因,研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量DNA和蛋白质分子,首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。你所感兴趣和想研究的基因，称为目的基因。,基因组DNA(genomicDNA)cDNA(complementaryDNA),（四）基因载体,定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准：,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。,1.质粒(plasmid),特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。大小适宜，拷贝数多。易于从一个细菌转移到另一个细菌，即易转化。有利于筛选。质粒上常带有一个或两三个抗药基因。有限制性内切酶的切口。,噬菌体DNA改造系统gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,3.粘性质粒(cosmid),酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,克隆容量：质粒：10kb噬菌体22kbM13噬菌体1kb粘粒40-50kbYAC：0.5-2Mb,二、重组DNA技术基本原理,目的基因的获取,克隆载体的选择和构建,外源基因与载体的连接,重组DNA导入受体菌,重组体的筛选,克隆基因的表达,基因工程的基本过程,（一）目的基因的获取,化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR),化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,从cDNA文库获取目的基因,利用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)获取目的基因,（三）外源基因与载体的连接,方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,粘性末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,平端连接,限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,适用于：,优点：使用范围广缺点：连接效率较低,在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头(linker)连接,人工接头及其应用,受体菌条件：安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式：转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA导入受体菌,宿主菌细胞经适当的理化处理，处于最适于接受重组体的状态，称感受态细胞。比如大肠杆菌在低温下处于CaCl2溶液中一段时间，其膜通透性增加处于感受态。,E.Coli感受态细胞的制备,1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,（五）重组体的筛选,(插入失活法)抗药性标记选择,(2)标志补救(markerrescue),组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖乳糖类似物异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。LacZ基因编码的-半乳糖苷酶X-gal蓝色吲哚产物,蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）,ZYX,P,O,ZYX,P,O,乳糖,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,互补（蓝白筛选）,（LacZ基因N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因C端序列,LacZ酶,Southern印迹,（3）分子杂交法,原位杂交,当溶液中的DNA分子经高温或高pH处理后，DNA双链分子变性产生两条单链，如果将温度逐渐下降或pH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺序同源互补或者部分同源互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性分子杂交。,99,原位杂交技术将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。细胞原位杂交组织切片原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。,以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,免疫学方法,重组DNA技术操作过程为：,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立：表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)；很难表达大量可溶性蛋白。,1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用),大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,真核基因在原核系统表达的困难及其解决方法,将真核基因克隆到1个强大的原核promotor和SD的下游，使真核基因处于原核启动子的控制之下，转录物由于原核SD能与核糖体rRNA结合，可在原核表达.这是克服1、2困难的好办法。真核分离出mRNA并逆转录成cDNA，cDNA有完整的编码顺序，但无内含子。采用伪装办法：将真核基因插到原核基因某密码之后，其翻译产物N端有原核多肽，这样表达的融合蛋白，可躲避细菌蛋白酶降解作用。,1.细菌RNApol不能识别真核的promotor，故真核基因不能被该酶转录.2.从真核转录的mRNA缺乏SD序列,不能结合到细菌核糖体rRNA,因此不能被翻译成蛋白.3.真核基因有内含子,而原核细胞缺乏真核细胞转录后加工系统,成熟的mRNA不能形成,不能表达真核蛋白;4.表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定,易被细菌蛋白酶降解.,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济,转染将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射,2.真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞）,表达载体pFASTBACI的物理图谱,一、疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之,并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,疾病基因发现:,脆性X综合征,Kallmann综合征,第三节重组DNA技术与医学的关系,DNARecombinationTechniqueisClos