DNA重组技术的基本工具(动画很经典)_-_副本.ppt

设想一,能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？,胰岛素是治疗糖尿病的特效药,长期以来只能从猪、牛等动物的胰腺中提取，产量低成本高。而微生物生长迅速，容易控制。于是科学家设想，若能将人的胰岛素基因导入微生物体内，并得以表达，就不仅能解决产量问题，还能大大降低生产成本，使药品价格大幅下降。,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素等珍贵药物？,这些定向改造基因的设想能实现吗？,经过多年的努力，科学家终于在20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程,生长快、肉质好的转基因鱼(中国),乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),转基因实例,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,专题1基因工程,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞中，定向地改造生物的遗传性状。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,定向改造生物性状或获得基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,一、基因工程的概念,优点：,定向改造生物性状,克服远缘杂交不亲和的障碍,育种周期短,二、基因工程的诞生,（一）基础理论：,1、DNA是遗传物质的证明2、DNA双螺旋结构和中心法则的确立3、遗传密码的破译,（二）技术发明：,1、基因转移载体的发现2、工具酶的发明3、DNA合成和测序技术的发明4、DNA体外重组的实现5、重组DNA表达实验的成功6、第一例转基因生物的问世7、PCR技术的发明,（二）技术发明：,1DNA重组技术的基本工具,培育抗虫棉需要哪些工具？,细菌,供体细胞,取出质粒,取出DNA,用限制酶切断DNA,用连接酶连接目的基因,将重组DNA导入受体细胞,扩增,基因工程图解,限制性内切酶作用过程,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是原核生物,约4000多种。,4、来源：,5、种类：,1、作用：,2、结果：,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,3、特点：,具有专一性（特异性）,G,A,3,5-磷酸二酯键,3端,5端,3端,5端,磷酸二酯键,17,仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列,中轴线,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,EcoRI限制酶的作用,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,思考,在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？那么这类生物为什么没有在长期的进化过程中被外源DNA的入侵而灭绝，它们有何保护机制？,限制酶切割外源DNA,使之失效，从而达到保护自身的目的！,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,基因的针线：DNA连接酶,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键,DNA连接酶的作用,限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？,连接黏性末端,连接黏性末端和平末端,分类,作用,E.coliDNA连接酶,连接酶,T4DNA连接酶,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,二、“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,是磷酸二酯键（扶手）不是氢键（梯子）,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,AATTG,C,A,A,T,T,A,A,T,T,DNA聚合酶的作用,返回,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,基因进入受体细胞的载体,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入细胞的工具就是载体。,基因工程的载体被喻为：,分子运输车,作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？,议一议,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链DNA,不能,不能进行DNA的重组,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,载体的作用,载体的必要条件,载体的种类,阅读课本第6页“分子运输车”运载体的相关内容，填写下表,自主学习,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）对受体细胞无害。,1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制,质粒病毒：噬菌体衍生物、动植物病毒等。,有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,最常用运载体质粒,实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,课本知识回顾,基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种提取出来，加以_，然后放到另一种生物的细胞里，改造生物的遗传性状。,基因拼接技术,DNA重组技术,基因,修饰改造,定向地,DNA重组技术的基本工具,“分子手术刀”,“分子缝合针”,“分子运输车”,限制（性核酸内切）酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,主要是从的一种酶。识别双链DNA分子的某种，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开。形成两种末端,原核生物中分离纯化出来,特定的核苷酸序列,磷酸二酯键,粘性末端,平末端,二、“分子缝合针”DNA连接酶,1、种类：2、作用部位：,两类,连接黏性末端,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,磷酸二酯键,连接黏性末端和平末端,基因进入受体细胞的载体,通常有三种:作为载体的条件：在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在,质粒,噬菌体衍生物,动植物病毒,天然质粒,人工改造,的,能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离,基础上进行过,练习,在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶,不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,练习,3)基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达,C,练习,限制性内切酶的识别序列和切点