硕士研究生分子生物学实验步骤.ppt

实验内容,感受态细菌的制备质粒转化、平板筛选质粒的扩增、质粒提取（碱裂解法）质粒DNA的限制性内切酶酶切及电泳鉴定真核细胞基因组DNA的分离纯化（蛋白酶K法）DNA紫外定性、定量分析及电泳鉴定真核组织总RNA提取（TRIzol试剂法）RNA紫外定性、定量分析及甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增目的基因mRNA的反转录PCR及鉴定,一、感受态细菌的制备,1.取出液氮或低温冰箱中贮存的大肠杆菌在LB琼脂平板上划线,37过夜至长出单菌落。2.挑选琼脂培养平板上的单菌落,接种到含有3m1LB培养基的试管内，37振摇过夜。次日取菌液1m1接种至含有100m1LB培养基的500m1烧瓶中，37剧烈振摇（200300rpm）培养约23h，待OD600值达到0.30.4时将烧瓶取出立即置冰浴1015min。自该步骤起皆需无菌操作。3.将细菌转移到一个预冷的1.5ml灭菌的离心管中。于4离心，8000g1min回收细胞。4.弃去上清，将管倒置于滤纸上1min。5.加1ml4预冷的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，冰浴30分钟。6.4离心1min,回收菌体。弃去上清，将管倒置于滤纸上1min。7.加0.1ml4预冷的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，置4冰箱过夜。即可应用于转化。,注意事项,洁净是最重要的。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。预冷是必要的。,二、质粒转化、平板筛选,制备含含100g/ml氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上（50时加入Amp）取感受态细菌100l置于无菌EP管中；加入重组质粒DNA10l，轻轻旋转混匀，冰上放置30min，42热休克90sec（勿超时！），冰浴速冷1-2min。加入无抗生素的LB培养基400l，于37摇床（100-150rpm）温和振摇45min，使细菌复苏并表达质粒的抗性基因。取100l菌液均匀涂铺于含Amp的LB琼脂平板上，3720min后，倒置平板继续培养10-16h(小于20h)挑取单菌落置5mlLB培养基中（含Amp）37摇床培养8-12h后，提取质粒，限制酶切鉴定。,质粒提取（碱裂解法）,原理：EDTA和表面活性剂存在下，经碱处理溶菌，同时pH12.012.6的碱性环境使细菌线性大分子染色体DNA氢键断裂，双链解开变性，而质粒DNA的超螺旋共价闭合环状的双链并不完全分离，在恢复中性pH并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA又呈天然构型，而细菌染色体不能复性，相互交联形成不溶性网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起，通过离心沉淀而除去。再经酚、氯仿抽提方法进一步纯化质粒DNA。,操作步骤,(收集菌液于Ep管中，10000rpm30s，弃上清，用1mlSTE漂洗12次,离心弃上清)1细菌沉淀加预冷的溶液I100l重悬菌体，强烈振荡混匀。2加溶液200l，快速颠倒46次混匀内容物，冰上35min（勿超时）。3加溶液150l，反复颠倒数次混匀，冰上5min。4离心12000rpm5min，转上清至新Ep管中。rpm5.室温下加等体积饱和酚至样品处理液中，缓慢颠倒混匀10min。6.离心14000rpm5min，取上层水相到新Ep管中（5，6步可不做）。7.加等体积氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀，离心14000rpm5min，取上层水相到另一管中。8加1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，置-2010min。8离心14000rpm10min，弃上清。9沉淀用1ml70%预冷的乙醇洗一次，离心12000rpm5min，弃上清。10将Ep管倒置于滤纸上吸净液体，室温下敞口蒸发痕量乙醇1015min或真空抽吸2min。11加无菌双蒸水40l溶解沉淀。12加RNaseA12l（此步省略）,混匀，置37水浴30min后进行限制性内切酶酶切实验（见实验六十七），或于-20保存待用；1%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取质量,质粒DNA的限制性内切酶酶切,反应体系如下：灭菌双蒸水6l10限制酶buffer2l质粒DNA10lBamH1lHind1l总体积20l，混匀，37水浴1-3h，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。,RT-PCR扩增目的基因,第一步：RT（总体积25l）RNA模板2lOligo(dT)151.5l65,5min;4,1min;DEPC处理水14l5xRTbuffer5ldNTP1.5lRT酶1l,2000rpm离心20sec后,42,60min逆转录；85，5min终止反应；4，3min，防止二级结构形成。,RT-PCR扩增目的基因,第二步：PCR（总体积50l）灭菌双蒸水31.5l10 xTaqbuffer5lMg+24ldNTP