挑战杯-邹明ok

序号： 编码： 第七届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称： 畜禽产品中二氟沙星残留快速检测方法研究 学校全称： 华南农业大学 申报者姓名 （集体名称）： 邹 明 类别：自然科学类学术论文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作A类 科技发明制作B类 第七届“挑战杯”广东大学生课外学术科技作品竞赛组委会制二00二年九月说 明1申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情况填写C表。3表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4序号、编码由各高校根据作品种类填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，学术论文及有关材料在8000字以内，社会调查报告在15000字以内（文章版面尺寸14.522cm左右）。6各高校的作品（数量参照“作品数额分配方案”）各一式四份分别按规定的时间用特快专递寄至省竞赛组委会办公室。7作品申报书须按要求由各校竞赛组织协调机构统一寄送。8其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。9寄送地址：广州市东山区寺贝通津一号大院团省委学校部“挑战杯”竞赛组委会。联 系 人：唐 锐、黄廉东联系电话：（020）87778918、87185614传 真：（020）87778918、87185613邮政编码：510080 A1申报者情况（个人项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写 个人作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）； 2本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。姓 名邹 明性别男出生年月1974.10申报者情况学校全称华南农业大学现学历博士研究生专 业基础兽医学年级2000级学制 3 年入学时间2000.9作品全称畜禽产品中二氟沙星残留快速检测方法研究毕业论文题目抗二氟沙星单克隆抗体的研制及抗体重、轻链可变区碱基序列测定通讯地址华南农业大学兽医药理研究室邮政编码510642单位电住地通讯地址华南农业大学兽医药理研究室邮政编码510642住宅电作者情况姓 名性别年龄学历所在单位资 格 认 定学校学籍管理部门意见 是否为2003年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的各类高等院校中国学生（含专科生、本科生和研究生）。是 否若是，其学号为： 00123001 （部门盖章） 2002年11月7 日院系负责人或导师意见 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果 是 否 负责人签名：梁小伊 2002年11月7 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称作品分类（D ）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路通过本课题的研究，制备抗二氟沙星的单克隆抗体，建立二氟沙星残留检测的ELISA方法。DFX人工抗原的制备 定性判断交联成功 免疫BALB/c小鼠，制备免疫脾细胞 抗DFX单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 ELISA检测条件的建立作品的科学性、先进性及独特之处在国内乃至国际上首次报道利用单克隆抗体进行畜禽产品中二氟沙星残留的快速检测。该方案突破了原有检测方案的一些弊端与不足，如仪器设备昂贵、操作复杂以及检测速度慢等缺点，可在几小时内出具检测结果。作品的实际应用价值和现实意义作品成果经进一步优化后可作为一整套快速、准确、易于推广使用的检测方案提供给广大生产企业和屠宰场等相关行业。不仅利于保障人们的食品安全，同时对于打破新的非关税壁垒“绿色贸易壁垒”对我国畜产品出口的制约，促进经济发展具有重大意义。学术论文文摘二氟沙星(Difloxacin, DFX)是动物专用的氟喹诺酮类抗菌药。目前用于二氟沙星残留检测的方法有：微生物法、HPLC、LCMS、SDF等。这些方法的一个最大缺点是检测速度慢，生产上尚缺乏一种快速、准确、易于推广使用的检测手段。本研究采用两种方法合成了2种不同的二氟沙星人工抗原；利用杂交瘤技术建立了5株分泌抗二氟沙星单克隆抗体的细胞株：在此基础上建立了畜禽产品中二氟沙星残留的快速ELISA检测方法间接竞争ELISA（ci-ELISA）法。本研究绘制了DFX对单抗3d3的抑制曲线，单抗的工作浓度为1：1500，包被原DFXOVA的工作浓度为8g/mL。标准曲线在 25 000ng/mL之间线性关系良好（r= -0.9826），检测限（LOD）为2ng/mL，DFX的IC50为32.56ng/mL。交叉试验表明该株单抗与恩诺沙星的交叉反应率为10.28%，与沙拉沙星、环丙沙星、诺氟沙星以及氧氟沙星的交叉反应率接近0；与氯霉素、SMZ、四环素和阿莫西林的交叉反应率均为0。该株单克隆抗体经试验条件的进一步优化后可用于畜禽产品中二氟沙星残留的快速检测。 作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励鉴定结果请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录1 Watanabe H, Satake A, Kido Y, et al. Monoclonal-based enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic assay for enrofloxacin in biological matrices. Analyst. 2002. 127(1): 98-1032 蔡勤仁。恩诺沙星单克隆抗体的制备及初步鉴定。2001.华南农业大学硕士毕业论文3 Dixon-Holland DE, Katz SE. Competitive direct enzyme-linked immunosorbent screening assay for the detection of sulfamethazine contamination of animal feeds. J Assoc Off Anal Chem. 1991. 74(5): 784-94 Stanker LH, Buckley S, Muldoon M, et al. A monoclonal antibody-based immunoassay for the detection of ceftiofur in milk. Food Agric. Immun. 1998. 10(2): 121131申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）申报摘要一份。科研管理部门签章以上情况属实。 2002 年11 月8 日C.当前国内外同类课题研究水平概述 说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。随着集约化畜牧业的发展，兽药和饲料添加剂的使用越来越广泛并发挥了极其重要的作用；与此同时，兽药的不合理使用造成的药物残留问题也越来越突出。近年来，由于畜禽产品中兽药残留和其他有害物质超标造成的餐桌污染和引发的食物中毒事件时有发生。随着中国加入WTO，长期制约我国畜禽产品出口的“关税壁垒”已经打破。但是新的非关税壁垒“绿色贸易壁垒”将成为制约我国畜产品出口的主要屏障。氟喹诺酮类药物是70年代后期发展起来的第三代喹诺酮类抗菌药。近年来，对氟喹诺酮类药物在兽医和人医临床上应用时所产生的耐药性、残留毒性以及不良反应的报道越来越多。该类药物具有光半抗原特性，可导致T细胞介导的免疫反应发生；进入脑组织后，可产生神经系统反应。动物实验表明，氟喹诺酮类药物还可以引起幼畜的关节炎、跟腱炎，对幼畜的负重关节造成影响，引起过敏性休克、恶心、呕吐以及静脉炎等症状。二氟沙星最初是开发用于人医临床，但由于其毒性太大，而被人医临床淘汰，随在兽医临床中开始使用。因而急需制定一个切实有效的安全评价程序来适时监控动物性产品中氟喹诺酮类药物的残留。我国对二氟沙星在各种组织的最高残留限量标准已经有相应的规定，其ADI值为010g/kg；在牛的肌肉、脂+皮、肝、肾中的残留限量分别为400、100、800、800ppm；在鸡/火鸡牛的肌肉、脂+皮、肝、肾中的残留限量分别为300、400、1900、600ppm。目前，用于二氟沙星检测的方法有：微生物法、HPLC、LCMS、SDF等。上述检测方法均需要复杂的样品前处理过程且常常需要有机溶剂进行相关的药物提取工作，容易对环境造成污染，分析费时费力且需要专门的仪器设备和熟练的专业人员而不易推广。同时，上述方法存在的一个最大不足就是上述检测方法仅仅局限于对产生残留这一危害的终端结果进行检测，从而忽略了对残留形成过程的监督监管。国内目前还缺乏一种快速、准确、易于推广使用的检测手段提供给广大生产企业和屠宰场等相关行业。近年来，陆续有利用单克隆抗体进行检测同类药物的报道。Holtzapple (1997)报道利用抗沙拉沙星的单克隆抗体检测沙拉沙星在动物组织中的残留取得成功。方法检测限可达2ppb；在10、50、100ppb添加水平下，组织样本平均回收率为132、78和81% 。Sarafloxacin作抑制物时，IC50范围在7.3 48.3ppb间。蔡勤仁（2001）利用恩诺沙星的羧基与载体蛋白BSA、OVA的胺基反应形成酰胺键，借此将药物与载体蛋白交联，然后免疫BALB/c小鼠制备抗恩诺沙星的单克隆抗体取得成功。方法检测限可达0.13ppb；用 Enrofloxacin作抑制物时，IC50为21.67ppb。段九华等（2001）制备了抗环丙沙星的多克隆抗体。方法检测限为0.32ppb；在40ppb添加水平下，在猪肉、鸡肉和牛奶样本的平均回收率为75.58、81.29和84.3%。文献检索结果表明，目前还未见有关于利用单克隆抗体进行二氟沙星残留检测方面的报道，因而本课题具有一定的前瞻性和创新性。通过本课题的研究，在国内乃至国际上首次构建出分泌抗二氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株；从而建立检测二氟沙星残留的ELISA方法。并通过后续研究为临床提供一套用于二氟沙星残留快速检测方法，服务于生产。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写； 2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组集体推荐亦可）； 3推荐者填写此部分，即视为同意推荐； 4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名陈杖榴性别男年龄65职称教授工作单位华南农业大学兽医学院通讯地址华南农业大学兽医学院邮政编码510642单位电820住宅电话推荐者所在单位签章陈杖榴是我院教授 （签章） 2002年11月8日请对申报者申报情况的真实性作出阐述申报者申报的情况属实。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价二氟沙星是兽医专用的氟喹诺酮类药物，威力保证动物性食品安全，快速检测方法十分中药，目前的发展趋势是利用单克隆抗体制成ELISA检测方法。故本研究有重要的 理论与实践意义。方法成功应用有广阔的应用前景。技术水平达国内领先。其它说明推荐者情况姓 名杨桂香性别女年龄37职称副教授工作单位华南农业大学兽医学院通讯地址华南农业大学兽医学院邮编510642单位电话85280237住宅电话85282730推荐者所在单位签章杨桂香是我院副教授。 签章日期 2002年11月7日 请对申报者申报情况的真实性作出阐述情况属实。 请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价应用免疫检测法进行批量样品的筛选具有速度快、不需昂贵仪器、反应灵敏等特点，是目前兽药残留快速检测的一个发展方向。本研究的选取具有重要的理论和实践意义。方法经完善成功应用后具有非常广泛的市场前景。技术水平属国内领先，达到国际先进。其它说明 学校组织协调机构确认并盖章以上情况属实。 （团委代章） 2002年11 月9 日 校主管领导或校主管部门确认盖章同意上报。 2002年11月9 日 校评审委员会初评意见 评委签名： 年 月 日 校组织协调委员会审定意见 （签章） 年 月 日E全国组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日F参赛作品打印处摘 要二氟沙星(Difloxacin, DFX)最初开发应用于人医临床，但因其毒性较大而逐渐淘汰应用在兽医临床上成为兽医专用的氟喹诺酮类抗菌药物。近年来，对氟喹诺酮类药物在兽医和人医临床上应用时所产生的耐药性、残留毒性以及不良反应的报道越来越多。目前，用于二氟沙星残留检测的方法有：微生物法、HPLC、LCMS、SDF等。生产上尚缺乏一种快速、准确、易于推广使用的检测手段以提供给广大生产企业和屠宰场等相关行业。本研究以此为立足点，采用两种不同的方法合成了2种不同的二氟沙星人工抗原；利用杂交瘤技术建立了5株分泌抗二氟沙星单克隆抗体的细胞株。同时对5株单克隆抗体进行纯化和鉴定；在此基础上进一步建立了畜禽产品中二氟沙星残留的快速ELISA检测方法间接竞争ELISA（ciELISA）法。首先采用碳二亚胺法（活性酯法）将二氟沙星与牛血清白蛋白（BSA）交联制备免疫用抗原DFXBSA；采用活泼酸酐法将二氟沙星与卵清蛋白（OVA）交联制备包被用抗原DFXOVA。两种交联产物经FeCl3显色法、紫外扫描法和红外光谱法进行确认。结果表明：透析后的交联产物与FeCl3反应呈红色且略显浑浊，透析外液与FeCl3则呈现浅黄色；DFX与载体蛋白BSA和OVA的吸收光谱呈现明显的叠加现象；且在交联复合物中有DFX的特征性光谱峰出现，证明两步交联均获得成功，为下一步构建分泌抗二氟沙星单克隆抗体的细胞株打下坚实基础。细