胡小梅 科技创新论文（改）

第三届“挑战杯”首都大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品 XLA-1低直链淀粉基因的遗传分析与分子定位胡小梅 彭景芳 赵娟 陈月柳 邓杏摘要：利用特异性引物（484/485）分析低直链淀粉突变体与野生型Wx基因的多态性关系，根据已知已公布的Wx基因序列设计引物，扩增测序获得突变体Wx基因的全序列，与报道的进行比对分析，明确其序列变化。用突变体XLA-1分别与原种、高直链淀粉亲本、糯稻配制杂交组合，分析F1,F2,BCF1直链淀粉性状分离情况，明确突变基因遗传机理。用XLA-1分别与中高直链淀粉亲本构建F2大群体，采用隐形群体法进行突变基因与分子标记的连锁分析，对F2群体中所有低直链淀粉单株进行标记基因型分析，计算标记与突变基因的遗传距离，达到分子定位的效果。关键词： XLA-1 直链淀粉含量 隐形群体 分子标记 遗传分析 Abstract : using specific Primer (484/485) to analysis the polymorphism relations between low level amylose mutant and wild-type Wx gene,according to the known sequence of Wx gene to design primers, amplifing and sequencing to get the whole WX gene sequence of mutant,comparative analysis to the known sequence and identify their sequencedifference.using mutant XLA-1 to respectively make hybrid with original generation 、high-level amylose parent generation and glutinous rice, analysis the segregation amylose traits of F1, F2, BCF1, clear mutant gene genetic mechanism. Use XLA-1 respectively and high amylose parents build F2 large groups, use of stealth Group method mutant genes and molecular marker linkage analysis, all groups for F2 low amylose individual genotype analysis mark, calculation of the mark and the mutant gene genetic distance, to the effect of molecular orientation.Keywords： XLA-1 amylose recessive groups molecular markers genetic analysis 水稻是我国第一大粮食作物，其总产量与播种面积列世界第一，二位【1】。近年来农产品的产量不断提高，人们对于大米的品质的要求越来越高。而影响大米口感的一个重要因素就是水稻中直链淀粉含量，相对来说，直链淀粉含量越低，食味品质较好。研究表明除栽培条件对稻米中直链淀粉含量有影响外，直链淀粉在不同品种之间的含量差异是可遗传的特性【2】，即水稻中直链淀粉含量是由基因控制的。直链淀粉含量在 5%-15%之间的低直链淀粉水稻，是介于一般粘米和糯米之间的中间类型，具有食味好、冷不回生、膨化性好等特点，是改良稻米直链淀粉含量和食味品质的理想材料。目前已经报道了20多种低直链淀粉突变体,其直链淀粉均低于15%，胚乳外观表型多为半透明或不透明，少数为透明的3。日本、韩国等东亚国家偏食软性粳米，故对低直链淀粉含量水稻育种非常重视。日本自20世纪80年代中期开始进行低直链淀粉突变体诱变筛选和育种计划，相继育成Milky Queen、Sari 等一系列优质低直链淀粉含量品种，深受商家和消费者欢迎。Milky Queen是日本在1991年育成的低直链淀粉水稻品种，它是用N甲基N 亚硝基脲（MNU）处理“越光”的受精卵，获得的低直链淀粉含量突变体,其直链淀粉含量为9%-12%。我国对低直链淀粉含量水稻品种选育的重视程度相当不够。我国云南地区特有的软米品种,是野生稻中自然发生的低直链淀粉含量突变体，直链淀粉含量在8%-15%之间4。目前我国发现的低直链淀粉突变体大多数为粳稻类型，有关籼稻类型的低直链淀粉突变体报道较少。根据与Wx基因等位性关系的不同，可将目前已报道的低直链淀粉含量突变体分为与Wx等位和非等位两大类。其中Wx-mq，Wxop等属于与Wx等位的低直链淀粉含量基因，而du,lam(t)等属于与Wx非等位的基因。Wx-mq发现于日本培育的低直链淀粉栽培品种Milky Queen中,经研究控制Milky Queen的低直链淀粉含量的基因是1个Wx的等位基因,并命名为Wx-mq5，Wx-mq基因已被克隆。在尼泊尔水稻品种中发现的不透明胚乳自然突变体,籽粒外观与糯稻相似,直链淀粉含量在10%左右,研究发现其低直链淀粉含量由1个隐性单基因控制,与Wx基因等位,将其命名为Wxop6。 du基因是独立于Wx的隐性单基因，该类型突变基因表型胚乳均为半透明，现已发现8个du基因,分别命名为du-1,du-2,du-3,du-4,du-5,du(EM47),du(2120)和du(2035)，其中du(2035)， du(EM47)位于第6染色体，du-4 du-1 du(2120)分别位于第4,7,9染色体上7-9。lam(t)基因来源于北海道品种Shiokari，该基因为与Wx不等位的隐性单基因，位于第9染色体10。我国云南软米品种毫屁、毫皮、毫木细和毫安闷的低直链淀粉性状均由Wx复等位基因Wxhp控制11。目前du-1基因已被克隆12，尚未见到其它与Wx非等位低直链淀粉基因的克隆报道。对于水稻直链淀粉含量变化的分子机理，目前的研究主要集中于Wx复等位基因，有关非Wx低直链淀粉基因的调控机理研究较少。水稻中主要存在Wxa和Wxb两种等位基因13，Wxa等位基因广泛存在于籼稻，而Wxb等位基因主要存在于粳稻中。已有研究表明Wxa和Wxb的蛋白积累量主要和第一内含子的剪接效率有关14，Aryes等15设计了SNP标记484/w2r用于分析直链淀粉含量变异。另外，该剪接位点上游存在一个(CT)n重复序列，序列重复次数与直链淀粉含量具有很高的相关性,籼稻品种(CT)n重复次数相对较少，粳稻相对较多，并根据此序列设计了特异性微卫星引物484/48516。上述研究主要针对直链淀粉含量介于15-25%之间的常规水稻品种，但这些结果仍不能很好解释直链淀粉含量水平的多样性，尤其是低直链淀粉含量形成机制，郭涛等17的研究表明，籼型低直链淀粉突变体XLA-1,XLA-2（CT）n多态性与糯稻相同，但其直链淀粉含量明显高于糯稻，说明还存在其它直链淀粉调控机制。在有关低直链淀粉合成调控机理方面，Zeng等18通过图位克隆的方法得到了Du-1基因的全长序列，分析表明，du-1基因与其野生型在第一外显子（+1742）处存在一个碱基替换（碱基G突变为A），从而导致了氨基酸序列错义突变（丝氨酸突变为天门冬氨酸），功能研究表明du-1可能是一个淀粉合成的调节因子，通过影响Wxb基因前体mRNA的剪接效率而降低直链淀粉含量。Isshhiki等19的研究表明，du-1和du-2不能形成类似于SR蛋白的剪接蛋白因子，使Wxb基因前体mRNA的正确剪接过程受到一定影响，从而导致直链淀粉含量降低。Sato等20克隆了Wx-mq全长cDNA，与野生型Wxb基因相比，在编码区发生了2个碱基的替换，497位的G变为A，595位的T变为C，从而使相应的氨基酸序列产生了2个错义突变，推测这2个错义突变是造成直链淀粉含量下降的原因。马晓东18的研究表明，四个云南软米低直链淀粉基因均由Wx复等位基因Wxhp控制，该基因编码区第四外显子（+497个）处存在一个单碱基突变（碱基A突变为G），编码子由GAC突变为GGC，导致了天门冬氨酸突变为甘氨酸，单核苷酸突变可能导致其空间构象发生变化，不能充分结合在淀粉粒上催化直链淀粉的形成，从而导致直链淀粉含量降低。以上研究均来源于粳稻低直链淀粉突变体，由于籼型非Wx低直链淀粉突变基因的克隆尚未报道，因此籼稻低直链淀粉合成机制有待进一步研究。综上所述，低直链淀粉合成、加工和沉积途径的分子机制目前仍尚未明晰，因此获得各种类型的直链淀粉含量突变体（特别是籼型低直链淀粉突变体），通过各种方法克隆控制突变性状的基因是解决上述问题的一个有效措施，并可为稻米直链淀粉改良提供优良的遗传资源。本实验室利用空间诱变技术，已经得到多个籼型低直链淀粉含量突变体21，这些突变体的获得为深入阐明籼稻直链淀粉调控机理奠定了材料基础。空间条件诱导的低直链淀粉变异是复杂的，产生的低直链淀粉既有质量性状也有数量性状，需要通过从不同水平上进行研究。目前利用遗传学、生理生化及分子生物学研究籼稻低直链淀粉突变体的研究较少。韦璇21对空间诱变材料籼小占的低直链淀粉突变体XLA-1、XLA-2与高直链淀粉品种华航一号杂交的遗传分析表明，XLA-1与高直链淀粉亲本杂交的F2代籽粒直链淀粉出现高低分离，且分离比例不符合3：1的分离模式，初步推测XLA-1低直链淀粉遗传特性受2对隐性基因控制，它们具有连锁关系和互补作用，这2对基因1对可能是Wx的等位基因，另一对可能是与Wx不等位的基因，两者均控制直链淀粉合成过程中的某一个环节，任何1对基因隐性纯合都将导致直链淀粉含量降低，而XLA-1与糯稻的杂交后代出现许多介于双亲之间及超亲的高直链淀粉含量籽粒，初步证明另1对突变基因为非 Wx的基因位点。XLA-2与高直链淀粉亲本杂交，其F2代籽粒直链淀粉分离比例符合1对基因3：1的分离模式，XLA-2与糯稻杂交后代也出现了非糯粒与糯粒的比例符合3：1分离模式，初步表明XLA-2低直链淀粉遗传特性受1对隐性主效基因控制，且该基因可能为Wx的等位基因，同时受微效基因的修饰21。研究结果表明，XLA-1、XLA-2确实受Wx主效基因影响其直链的淀粉含量，而从淀粉合成关键酶的角度分析，XLA-1的直链淀粉含量下降的主因与SBE酶活性的增大相关，结合上述的研究，XLA-1低直链淀粉遗传特性受2对隐性基因控制，因此把非Wx突变基因进行定位，对改良高直链淀粉材料的育种实践中具有一定的价值。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1水稻供试材料XLA-1/华航一号F2代群体中低直链淀粉含量个体（双隐性个体，基因型为WxWxaa）,暂命名为HXLA。高直链淀粉个体：籼小占（WxWxAA）1.2 实验方法1.2.1 杂交设计2009年早造，选取HXLA与籼小占作为杂交亲本的目的为了排除Wx基因的影响，且两亲本在第六染色体的SSR多态性高，杂交实验在华南农业大学农场进行，以低直链淀粉种质HXLA为母本与高直链淀粉亲本籼小占为父本杂交，获得F1种子，2009年晚造自交得到F2籽粒群体。1.2.2 杂交方法采用温烫去雄法杀雄，上午8时至11时进行。首先在保温瓶中灌满45的温水，在稻穗开花前半小时左右，把稻穗压弯轻轻浸入温水中浸泡5-8min，然后取出稻穗，将闭合的小穗全部除去，防止假杂种；凡开花的小穗，其雄蕊没有活力，而雌蕊仍保持活力，去除雄蕊，为方便授粉将其尾部三分之一的颖壳剪去，套袋。待父本开花后，剪取正在开花的稻穗，采用震动授粉法对母本授粉。授粉后将纸袋折叠，套上标签，约一个月后收取杂交种子。1.2.3 稻米直链淀粉含量的测定方法集团法：参照GB-7648-87法，用SDM-A型旋风式磨粉机将待测试样的整经米磨成粉，称取1000.5mg米粉样品加入100mL容量瓶，加入1.0mL=95%酒精使其分散，9.0mL 1mol/L NaOH煮沸10min，冷却定容，吸取5.0mL样品溶液移入另一100mL容量瓶（同时吸取5.0mL 0.09mol/L NaOH作为对照），加入1.00 mL 1mol/L乙酸、1.50mL I2-kI溶液，定容，20min后用分光光度计测定620nm下吸光值（OD620nm）。集团法标准曲线绘制：称取与待测样品保存在同样的条件下三天以上的高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品各100mg，用上述方法与待测样品同时进行测定。以标样的直链淀粉为纵坐标，以相应的吸光值为横坐标，绘制标准曲线和列出曲线的回归方程式。重复测定一次，两次结果的误差应在1.0%，取平均值即为直链淀粉含量。单粒法：将单粒去壳去胚后，放入25mL容量瓶，加入0.25mL=95%酒精及2.25mL 1mol/L NaOH后，置于恒温箱26糊化24h，使胚乳完全溶解。之后将容量瓶取出，振荡摇匀后煮沸10min，冷却定容吸取1.25mL样品溶液移入另一25mL容量瓶（同时吸取1.25mL 0.09mol/L NaOH作为对照），加入0.25 mL 1mol/L乙酸、0.375mL I2-kI溶液，定容，20min后用分光光度计测定620nm下吸光值（OD620nm）。 单粒法标准曲线绘制：称取高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品各0.0100g，用上述方法与待测样品进行测定。以表样直链淀粉质量分数为纵坐标，以相对应的吸光值为横坐标，绘制标准曲线和列出曲线的回归方程式。亲本的直链淀粉含量及HXLA/籼小占F1单株测定采用集团法，HXLA/籼小占F2的遗传分析采用单粒法。1.2.4 作图群体的DNA获得HXLA/籼小占的F2籽粒群体采用单粒法测定，把单粒分成两部分，胚乳用于直链淀粉含量的测定，保留胚，并编号一一对应。把小于13.5%及大于22.5%的籽粒胚置于恒温箱发芽，用营养液浇灌至三叶期，长出足够多的叶片可提取DNA，用于构建作图群体。1.2.5 水稻基因组总DNA提取采用Murray CTAB方法提取。1.2.6 SSR标记筛选及候选基因标记确定韦璇21等利用XLA-1/华航一号杂交构建F2代群体，经遗传分析和蜡质基因Wx的(CT)n多态性分析表明，控制XLA-1低直链淀粉特性的另一对基因与Wx基因连锁。根据上述研究，为快速确定该低直链淀粉基因，首先采用分离群体法（Bulked Segregant Analysis, BSA）筛选与低直链淀粉基因连锁的微卫星标记，即利用HXLA与籼小占及高直链淀粉池与低直链淀粉池作为筛选模板进行扩增，待筛选出合适的SSR标记后进一步对高直链淀粉个体及低直链淀粉个体进行确定，确保标记的准确性。候选标记确定后，再根据隐性群体法（Recessive-class analysis, RCA）对F2作图群体的低直链淀粉个体进行确定，确定连锁位置与遗传距离。1.2.7 近等基因池的构建从HXLA/籼小占F2代定位群体中随机选取10个高直链淀粉籽粒个体的DNA等量混合成高直链淀粉基因池，同样方法选取10个低直链淀粉籽粒个体的DNA等量混合成低直链淀粉基因池。1.2.8 电泳检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，大约3-4小时，结束后，双蒸水洗胶两次，每次约1分钟，再用1g/L的AgNO3溶液染色约10分钟，用双蒸水洗胶两次，用显影液摇动显影然后观察分析。1.2.9 连锁分析本研究采用隐性群体法进行连锁分析，重组率按Kosambi作图函数转换成遗传距离（里摩尔根cM）。2 结果分析2.1 F1代直链含量测定结果从表5.1可以看出，HXLA与籼小占杂交得到的F1代籽粒直链淀粉含量居于双亲之间，其籽粒直链淀粉含量平均值低于中亲值（20.95%21.65%），且多数偏向于高直链淀粉含量亲本，说明高直链淀粉含量对低直链淀粉含量表现完全显性，控制XLA-1低直链淀粉含量的突变基因属于隐性基因。表5.1 HXLA/籼小占F1代及亲本直链淀粉含量表现值组合直链淀粉含量（%）F1MPF1-MPHXLA /籼小占17.4124.3720.9521.650.182.2 F1代真种的分子标记鉴定XLA-1低直链淀粉遗传特性受2对隐性基因控制，因此要排除Wx基因的影响，此外还要验证杂交是否成功，本研究采用分子标记辅助的方法，对F1的植株逐一进行检测，保证遗传分析及分子定位的准确性。首先采用特异引物484/485特异引物进行(CT)n多态性鉴定，如图5.1所示，选取只有和双亲相同带型的植株，即编号为1、2、3、8、9；接着用双亲具有多态的引物RM225进行鉴定，如图5.2所示，选取杂合带型的植株，即编号为1、4、5、6、7、9、10。综合筛选满足条件的有1号植株，因此选取1号进行遗传分析及分子定位。P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图5.1 HXLA/籼小占的F1在 484/485特异引物扩增表现注：P1代表HXLA，P2代表籼小占，标号110代表HXLA/籼小占F1单株M P1 P2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图5.2 HXLA/籼小占的F1在RM225引物扩增表现注：P1代表HXLA，P2代表籼小占，标号110代表HXLA/籼小占F1单株2.3 F2代低直链淀粉基因的遗传分析HXLA与籼小占杂交组合F2代籽粒群体的直链淀粉含量频次分布图如5.3，分离情况见表5.2。由图5.3可以看出，HXLA与籼小占杂交F2代籽粒群体直链淀粉含量出现明显3个峰，结合表5.2可知，低直链淀粉分界点为15%，高直链淀粉分界点为19%，其分离范围为5.79%27.50%。图5.3 HXLA/籼小占杂交组合F2代籽粒群体的直链淀粉含量频次图表5.2 HXLA/籼小占杂交组合F2代籽粒群体变异范围组合F2平均值分离范围低AC分界点（%）高AC分界点（%）HXLA/籼小占16.76%5.7927.501519卡平方检测结果表明（见表5.3），HXLA/籼小占杂交组合F2代籽粒群体的直链淀粉含量分离比例符合1：2：1遗传分离模式，即低直链淀粉含量个体：高直链淀粉含量个体为1：3遗传分离，且2=2.0720.05，根据孟德尔基因分离规律可知，低直链淀粉性状符合一对基因遗传分离模式，说明控制XLA-1低直链淀粉特性的基因是由一对隐性基因控制。表5.3 HXLA/籼小占杂交组合F2代籽粒群体卡平方检测结果组合AC分组总数实际比例2低中高HXLA/籼小占1363534892.59：12.0720.05=3.84（df=1）2.4 作图群体的构建根据遗传分析的结果，在F2代籽粒分离群体的136个低直链淀粉个体中随机选取直链淀粉含量小于13.5%的个体60个，构建作图群体，利用隐性群体法对低直链淀粉基因进行连锁分析及初步定位。2.5 与低直链淀粉基因连锁的SSR标记连锁分析及分子定位为了确定低直链淀粉突变基因的位置，我们在Wx上端及下端处选取40对SSR引物，对亲本HXLA和籼小占进行多态性筛选，在Wx基因上端处发现RM19254-RM19271-RM19283-RM19288-RM19289-RM19297出现连续的多态，通过近等基因池的鉴定，电泳检测结果表明位于第六染色体的标记RM19288和RM19297在高直链淀粉基因池、低直链淀粉基因池以及两亲本中存在多态性，因此将这两对标记确定为候选基因。接着用作图群体来确定这两个标记与低直链淀粉基因的连锁关系，我们用这两个标记分别对作图群体中的60个体分别检测，同时检测双亲和近等基因池作为对照。结果表明在RM19288位点上鉴定到6个重组体，RM19297位点上鉴定到5个重组体（图5.4和图5.5）。重组率按Kosambi函数转为为遗传距离（里摩尔根cM），计算结果得出该低直链淀粉基因位于RM19288、RM19297之间，与RM19288的距离为5.05cM，与RM19297的距离为4.1cM（图5.6），该突变基因暂命名为lac。M47913P1P2HL1235681011121415161718192021222324252627282930454644P1L343740P2H31323335363839414243M5358474849505152545556575960图5.4 SSR标记RM19288对60个F2代低AC个体的检测结果注：M代表100bp ladder, P1代表籼小占，P2代表HXLA，H代表高池，L代表矮池，160带代表60个F2作图个体M47913P1P2HL1235681011121415161718192021222324252627282930454644P1L343740P2H31323335363839414243M5358474849505152545556575960图5.5 SSR标记RM19297对60个F2代低AC个体的检测结果注：M代表100bp ladder, P1代表籼小占，P2代表HXLA，H代表高池，L代表矮池，160带代表60个F2作图个体图5.6 低直链淀粉基因lac的局部分子标记连锁图3 小结与讨论迄今为止，已报道的非Wx主效基因控制直链淀粉含量的基因都来自于粳稻，而来自籼稻尚未报道。籼稻低直链淀粉含量主要是有Wx基因的复等位基因控制，例如Wx-mq、Wxop、Wxmp。位于第6染色体染色体控制低直链淀粉含量的基因主要是du-2、du(2035)，都是由亲本Sasanishiki通过EMS突变方式定位出来。国内外许多学者对水稻直链淀粉的遗传机理进行了不少研究，但由于直链淀粉直链淀粉含量遗传的复杂性，使得研究结果众说纷纭。多数研究者认为稻米直链淀粉含量受控于一个主效基因和几个微效基因，不同品种所带的主效基因不同。李广贤23等报道在第1、3、4、5、6、7、8、9、12染色体上均有检测到该性状的QTL报道。综合前人的研究，水稻第6染色体上存在一个控制直链淀粉含量的Wx基因位点，黄祖六24等对稻米直链淀粉含量基因座位进行分子标记研究，表明位于第6染色体的Wx基因与R1962紧密连锁，距离为3.6cM,另外还在第3染色体上检测到一个与R2170紧密连锁的主效基因，且两个基因之间的作用是独立的。本研究结果表明，低直链淀粉基因lac位于第6染色体上端的SSR标记RM19288、RM1929下端，分别相距5.05cM和4.1cM，且位于Wx基因的下端。通过与du-2、du(2035)相比对，发现XLA-1产生的低直链淀粉基因与du-2、du(2035)不等位，结合遗传分析结果表明lac为一新的低直链淀粉含量基因。通过对该基因的获得，丰富了水稻的低直链淀粉基因资源，也为该基因的精细定位和图位克隆研究打下了良好的基础。参考文献1 沈镇昭, 梁书升. 中国农业年鉴. 北京: 中国农业出版社, 2006:30-39.2 蔡秀玲 刘巧泉 顾铭洪 等 用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记 植物生理与分子生物学学报 2002.28（2）：137-144 3 朱昌兰，沈文飚,翟虎渠,等.水稻低直链淀粉含量基因育种利用的研究进展. 中国农业科学 2004，37(2):157-162.4 曾亚文,申时全,杨忠义,等.云南稻种资源的蒸煮食味品质研究.西南农业大学学报,2001,23(5):408-41.5 Sato H, Suzuki Y, Okuno K, et al. 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