生化药物制造工艺多肽与蛋白质类药物

第二节多肽与蛋白质类药物一、多肽与蛋白质类药物概述多肽和蛋白质是生物体广泛存在的重要生化物质。具有多种多样的生理生化功能，也是一类重要的生物药物。（一）多肽类药物活性多肽是生化药物中非常活跃的一个领域。动物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生获得的。从植物中发现和研究新的活性多肽也引起了人们广泛的注意。,许多活性蛋白质、多肽都是由无活性的蛋白质前体，经过酶的加工剪切转化而来的。从寻找新药的角度看，研究活性多肽结构与功能的关系，有助于了解多肽中哪些氨基酸序列是活性所必需的，以便以更短的多肽来代替。用不同的氨基酸去置换活性多肽中的有关氨基酸，可以提高其生理活性，减少临床的不良反应。同时，对氨基酸排列形式立体结构的研究，有助于设计新的活性多肽类药物。,目前，主要的多肽类药物有以下几种：1、多肽激素（1）垂体多肽激素（2）下丘脑激素（3）甲状腺激素（4）胰岛激素（5）胃肠道激素（6）胸腺激素,2、多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。3、含有多肽成分的其他生化药物（二）蛋白类药物蛋白质生化药物除了蛋白质类激素和细胞生长调节因子外，还有像血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等大量的其他生化药物品种。作用方式也从生化药物对机体各系统和细胞生长的调节扩展到被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋白酶的抑制剂等多种领域。,自20世纪70年代后期开始，人们首先把目标集中在应用基因工程技术制造重要的蛋白质药物上。现正从微生物和动物细胞的表达向转基因动植物发展。鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的抗原性、容易失活、在体内的半衰期短、用药途径受限等难以克服的缺点。对一些蛋白质类生化药物进行结构修饰、应用计算机图像技术研究蛋白质与受体及药物的相互作用、发展蛋白质工程及设计相对简单的小分子来代替某些大分子蛋白质类药物并且起到增强或增加选择性疗效的作用等。,主要蛋白质类药物有以下几种：1、蛋白质激素（1）垂体蛋白质激素。（2）促性腺激素。（3）胰岛素及其他蛋白质激素胰岛素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素。2、血浆蛋白质3、蛋白质类细胞生长调节因子4、黏蛋白5、胶原蛋白,6、碱性蛋白质硫酸鱼精蛋白等。7、蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂等。8、植物凝集素二、多肽与蛋白质类药物的制造方法目前用于多肽和蛋白质类药物的制造方法主要有三种：提取分离纯化法、化学合成法和基因工程法。这里重点介绍提取分离纯化法。（一）蛋白质与多肽类药物提取、分离纯化,1、材料选择采用提取分离纯化法获得的多肽及蛋白质类药物，其原料的主要来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。对天然蛋白质类药物，为提高质量、产量和降低生产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍。,（1）种属牛胰含胰岛素单位比猪胰高。抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。由于种属特异性的关系，用猪垂体制造的生长素对人体无效，不能用于人体。由动物细胞产生的干扰素与人干扰素抗原有交叉反应，而对一些非同源性动物的某些细胞抗病毒活性作用并不下降。,（2）发育生长阶段幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采用幼龄动物。HCG在妊娠妇女6070d的尿中达到高峰，到妊娠18周已降到最低水平。然而HMG必须从绝经期的妇女尿中获取。肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎猪或胎牛肝中获得的，若用成年动物，必须经过肝脏部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因子的原料。（3）生物状态动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。,（4）原料来源血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。（5）原料解剖学部位猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多，如分别摘取则可提高各产品的收率：胃膜素以采取全胃黏膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部黏膜为好，因胃底部黏膜富含消化腺。,2、提取提取的总要求是最大限度地把有效成分提取出来，关键是溶剂的选择。提取所用溶剂的选择标准，首先对被制备物具有最大溶解度，并在提取中尽可能减少一些不必要的成分。为了更好地达到以上两个目的，常用的手段是调整溶剂的pH、离子强度、溶剂成分配比和温度范围等。,3、分离纯化多肽及蛋白质的分离纯化是将提取液中的目的蛋白质与其他非蛋白质杂质及各种不同蛋白质分离开来的过程，常用的分离纯化方法有：（1）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质。其净电荷为零，此时环境的pH即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质等电点时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。,两性物质的等电点会因条件不同（如在不同离子强度的不同缓冲溶液中，或含有一定有机溶媒的溶液中）而改变。蛋白质在介质中的等电点是和介质中其他成分的存在有关系的。用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作，而除去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作。等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外，也可用于测定蛋白质的等电点。,（2）根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大，而且不同种类的蛋白质分子大小也不相同。由此可以用凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。用超滤法时，超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线性溶质或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结果。葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团，故有较弱的离子交换作用，此外还有吸附作用。可采用低浓度的盐溶液，或者用与待分离蛋白质相同的标准蛋白质预先使凝胶柱平衡，以期不损失所分离的蛋白质。,（3）根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度等多种因素的影响。适当改变外界条件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度，达到分离的目的。属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶与盐析法、结晶法和低温有机溶剂沉淀法。乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂，由于丙酮的介电常数小于乙醇，故丙酮沉淀能力比乙醇强。根据实践，乙醇沉淀的物质，改用丙酮可减少l0左右。,（4）根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团。它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲和力，从而使这些物质分离提纯。对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维素或以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂。主要是取其有较大的蛋白质吸附容量、较高的流速和分辨率等优点。可按不同情况选择离子交换条件：如果吸附得太牢，可改用交换当量较小的交换剂，或改变条件降低交换剂上带电基团的解离度。,（5）根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质主要的手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异的、非共阶键的可逆性结合而达到纯化的目的。用亲和层析纯化某种蛋白质，有时并不能取得预期的效果。原因之一就是非专一性吸附问题，非专一地吸附一些无关的蛋白质而与专一吸附的蛋白质相混杂，影响了分离效果。非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团和疏水基团。固相化金属亲和层析（IMAC）蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些金属元素形成配位结合。,（6）根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质蛋白质分子上有疏水区，这些疏水区，能够与吸附剂上的疏水基团结合，再通过降低介质的离子强度和极性，或用含有去垢剂的溶剂，提高洗脱剂的pH等方法将蛋白质洗脱下来。（7）根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程，称之为逆流分溶，利用逆流分溶技术分离垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。,（8）根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷酸钙（羟灰石）、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。（9）根据蛋白质的某些特殊性质进行纯化如：白蛋白在弱酸性条件下加辛酸钠可耐受67的温度，而其他蛋白质将变性。球蛋白或白蛋白在碱性条件下，可以和利凡诺作用，形成络合物而与其他蛋白质分离。细胞色素C和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉淀，而保存其活力。又如：酶蛋白超氧化物岐化酶（SOD）能抵抗蛋白水解酶的水解，因而可用蛋白水解酶降解其他蛋白质，以便于SOD进一步的纯化。,4、分离纯化方法的选择分离纯化是整个生化制备过程的核心部分。对于某一物质，究竟选用什么分离纯化方法最理想，主要是根据该物质的物理化学性质和具体实验条件而定。认真参考借鉴前人经验可以避免许多盲目性，节省实验摸索时间。即使是分离一个新的未知组分，通过分析预试验的初步结果，参考别人对类似物质分离纯化经验，也可以帮助少走些弯路。,5、溶液中蛋白质浓度的测定在蛋白质分离纯化过程中，蛋白质浓度的测定是不可缺少的手段。溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理、化学性质，如折射率、相对密度、紫外光吸收来测定；可用化学反应方法，方法中，紫外吸收法、双缩脲法、福林酚试剂法、考马斯亮蓝染色法最为常见，它们操作简单，不需要昂贵的设备。以下主要介绍这几种方法。,（1）紫外吸收法280nm光吸收法。在280nm处测定光吸收值。通常以浓度是1mg蛋白质ml溶液的A280为1.0进行估算。若已知该蛋白质的文献值，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。280nm和260nm的吸收差法。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的核酸类物质，在用A280来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。由于核酸在260nm的光吸收比280nm更强，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的浓度。2l5nm和225nm的吸收差法蛋白质的肽键在200250nm有强的紫外光吸收，用215nm和225nm光吸收差值。减少非蛋白质成分引起的误差。,（2）双缩脲法常量双缩脲法。蛋白质含有多个肽键、因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫红色化合物、可在540nm处比色测定。微量双缩脲法。由于铜与蛋白质复合物的最大吸收峰在260280nm。在310330nm测定干扰因素少一些，因此。选用310nm进行比色测定。（3）福林酚试剂法本方法首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质复合物，然后该复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸磷钨酸试剂（福林试剂），产生深蓝色。本法可用750nm比色测定，或500nm比色测定，本法的标准曲线线性较差，样品浓度需按标准曲线校正。,（4）考马斯亮蓝G250染色法考马斯亮蓝G250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色，可在595nm比色测定。但不同蛋白质之间的差异较大，且标准曲线线性较差。,6、纯度检查蛋白质的纯度是化学和物理学的概念，蛋白质的聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地影响其生物活性，而这些因素的影响往往是用一般纯度检查的方法所查不出来的，这是值得注意的一种情况。常用蛋白质纯度检查的方法有：,（1）HPLC或FPLC这是蛋白质纯度检查常用的有效方法。美国药典已规定把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中。（2）电泳法凝胶电泳呈现单一区带，是纯度的一个重要指标，说明样品的荷质比（电荷质量）是均一的。如果在不同的pH下进行凝胶电泳都是一条区带，则结果更加可靠。,（3）免疫化学法主要有免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳扩散、放射免疫分析、酶标免疫分析等。此法适用于能产生特异性抗体的蛋白质，无论是检查所需要的或者是被污染的蛋白质都适用。（4）生物测定法利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物效价的测定，这种方法接近动物临床所产生的生物学效应，因此实际意义也更大。,（5）分光光度法紫外分光光度法。不同的蛋白质在紫外区的吸收峰有微小的差别。由于其特异性，可作为定性或定量测定的参考。红外分光光度法。由于蛋白质的分子结构有一定的能级而有别于其他非蛋白质物质，故红外光谱为人们提供了“分子指纹”。,（二）多肽与蛋白质的化学合成多肽的合成是20世纪50年代开始获得重大发展的。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；同时也是多肽药物制备的有效方法。多肽合成一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）进行。,早期的多肽合成是在溶液中进行的，称为液相合成法。现在多采用固相合成法，与液相法相比，固相法大大地降低了每步产品提纯的难度。近几十年来，固相法合成多肽以其省时、省力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的优势而成为多肽与蛋白质合成中的一个常用技术。应该指出的是人们还只能合成一些较短的肽链，对于合成蛋白质还有诸多的困难，而在生物体内，核糖体上合成肽链的速度和产率都是惊人的。那么，是否能从生物体合成蛋白质的原理上得到一些启发，应用在多肽合成上，这是一个令人感兴趣的问题，也许是今后多肽合成的发展方向。,对于多肽合成一般需要以下几个主要步骤：氨基保护和羧基活化；羧基保护和氨基活化；接肽和除去保护基团。1、基团保护要实现控制多肽合成，必须做到事先把不应与接肽反应试剂发生作用的官能团，如N末端氨基酸残基的自由NH2、C末端氨基酸残基的自由COOH以及侧链上的一些活泼基团，特别是SH等，加以封闭或保护。待肽链形成之后，再将保护基除去。作为保护基，必须既能在接肽时起到保护作用，而在接肽以后，又能很容易地除去，且不致引起肽链的断裂。,常用的氨基保护剂有苄氧羰基（需要用较强的酸解条件才能脱除）、叔丁氧羰基（Boc，可用三氟乙酸TFA脱除）和9芴甲氧羰基（Fmoc，可用哌啶CH2Cl2，或哌啶DMF脱除），其中Fmoc最常用。羧基的保护通常是用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化，使羧基接上烷基。除去保护基可在常温下用氢氧化钠皂化法。其他功能基团，例如组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基等，都可用苄基（Bz）保护，用钠氨法除去。谷氨酸和天门冬氨酸的及羧基可用及苯甲酯保护，用催化氢化法除去。精氨酸的胍基用对甲基磺酰基（Tos）保护。,2、肽的液相合成法接肽反应除用缩合剂合成外，还可以用分别活化参与形成肽链的氨基和羧基的方法来完成。因活化氨基的反应激烈，而且常常产生消旋化，所以，总是采用羧基活化的方法，也就是说，合成肽的常规方法是从C端向N端进行。肽的合成法可分为阶梯伸长法和片断缩合法。阶梯伸长法是合成比较小的肽或肽段常采用的方法：片断缩合法是由小肽缩合成大肽的方法，为了避免消旋，常用叠氮法接肽。,3、肽的固相合成法1963年，RBMerrifield创立了将氨基酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸、延长肽链合成蛋白质的固相合成法在固相法中，每步反应只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的，为自动化合成肽奠定基础。今天，固相法得到了很大发展。除了Merrifield所建立的用Boc（叔丁氧羰基）保护氨基的Boc固相合成法之外，又发展了氨基用Fmoc（9芴甲氧羰基）保护的Fmoc固相合成法。,在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护。这种处理带来了一些问题。如在肽与树脂的接头处，当每次用50TFA（三氟乙酸）脱Boc基时。有约14的肽从树脂上脱落，此外，酸催化会引起侧链的一些副反应。Boc合成法尤其不适于合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。1978年，报道的Fmoc（9芴甲氧羰基）基团作为氨基保护基，成功地进行了多肽的Fmoc固相合成。Fmoc法与Boc法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmoc为氮基的保护基。,4、合成肽链的纯化多肽合成以后，由于在介质中存在着副产物，因此仍然有分离、纯化的问题，但这比在天然原料中进行纯化要方便得多。蛋白质分离纯化的一般技术手段都可以酌情配合使用，如结晶法、超滤法、高效液相色谱、亲和层析等。（三）基因工程法自20世纪70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往从自然界很难或不能大量获取的蛋白质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。,基因工程蛋白质药物的生产是一项十分复杂的系统工程。可分为上游和下游两个阶段。上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。下游阶段是从工程菌（细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。下游阶段主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。,工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，以便获得较高产量的目的基因表达产物。为了获得合格的目的产物，必须建立起系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。,三、重要的多肽与蛋白质类药物的制备（一）多肽类药物1、胸腺激素胸腺是一个激素分泌器官，对免疫功能有多方面的影响。胸腺依赖性的淋巴细胞群T细胞直接参与有关免疫反应。胸腺对T细胞发育的控制，主要通过由胸腺所产生的一系列胸腺激素，促使T细胞的前身细胞分化、增殖、成熟为T细胞的各种功能亚群，由此控制调节免疫反应的质与量。现已知某些免疫病变等皆与胸腺功能的减退及血中胸腺激素水平的降低有关。,（1）胸腺素胸腺激素制剂总的说来，都与调节免疫功能有关。在所有胸腺激素制剂中，对来自小牛胸腺的胸腺素组分5（即以小牛胸腺为原料，按一定的方法提取、纯化胸腺的第5种组分）的基础理论和临床研究最多。结构和性质：胸腺素组分5是由在80热稳定的4050种多肽组成的混合物，分子量在100015000之间，等电点在3.59.5之间。,根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序，共分三个区域：区包括等电点低于5.0的组分，区包括等电点在5.07.0之间的组分，区则指其等电点在7.0以上者（此区内组分很少）。对分离的多肽进行免疫活性测定，有活性的称为胸腺素，无活性者则称之为多肽。现已清楚，胸腺素组分5中，胸腺素1、5、7、3和4等是具有调节胸腺依赖性淋巴细胞分化和体内免疫反应的活性组分。,工艺路线,工艺过程提取匀浆、离心加热去杂蛋白提取液80加热15min，沉淀-10丙酮，超滤取分子量在15000以下的超滤液。脱盐、干燥超滤液经SephadexG-25脱盐后，冷冻干燥得胸腺素。（3）检验方法：活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10；分子量15000以下。（4）作用与用途：为免疫调节剂。,2、胸腺肽（Thymuspeptides）（1）结构和性质：胸腺肽中主要是分子量9600和7000左右的两类蛋白质或肽类，还含有RNA0.20.3mgmg，DNA0.120.18mgmg。对热较稳定，加温80生物活性不降低。经蛋白水解酶作用，生物活性消失。（2）生产工艺：工艺路线,工艺过程超滤、提纯、分装、冻干加3甘露醇作赋形剂。（3）检验方法：活力测定同胸腺素。分子量10000以下。（4）作用与用途：胸腺肽可调节细胞免疫功能，有较好的抗衰老和抗病毒作用。无过敏反应和不良的副作用。,2、降钙素（1）结构和性质降钙素是一种调节血钙浓度的多肽激素，由甲状腺内的滤泡旁细胞（C细胞）分泌或鱼、鸟等其他脊椎动物的后腮腺分泌。是由32个氨基酸残基组成的单链多肽，N端为半胱氨酸，它与7位上的半胱氨酸间形成二硫键，C端为脯氨酸。如果去掉脯氨酸，生物活性完全丧失。降钙素分子量约为3500，溶于水和碱性溶液，不溶于丙酮、乙醇、三氯甲烷、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳等，难溶于有机酸。25以上避光保存可稳定两年，水溶液于210可保存7d。,降钙素广泛存在于多种动物体内，在人及哺乳动物体内主要存在于甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺等组织中，鱼类则在鲑、鳗、鳟等的终鳃体里含量较多。由鲑鱼中获得的降钙素对人的降钙作用比其他哺乳动物中分离出的降钙素要高2550倍，各种不同动物来源的降钙素，其氨基酸排列顺序有些差异。（2）生产工艺制造降钙素的原料主要有猪甲状腺和鲑、鳗的心脏或心包膜。下面介绍基因工程技术生产降钙素的工艺。工艺路线：,鲑鱼降钙素甘氨酸（sCTGly）基因的获取采用人工合成DNA序列的办法，合成含有鲑鱼降钙素基因的DNA序列，基因的设计选用大肠杆菌偏爱密码子。在基因的两端引入Sau3A酶切位点，以便于基因插入到克隆及表达载体中。在基因的3端CT基因后加入一个甘氨酸密码子和一个终止密码，加入甘氨酸密码子可使CT基因表达产物在C末端酰化酶（CAB）作用下C末端羧基转化成酰胺，以获得生物活性降钙素，加入终止密码使翻译终止。在5端CT基因后加入一个蛋氨酸以便使用BrCN对融合蛋白进行化学切割，从而分离SctGly。,产物纯化采用AmberchromCG300M离子交换柱，去除未反应的SO3sCT和SO3sCTGly等物质。洗脱液冻干得sCT粉末。（3）检验方法生物活性测定方法：血样品的血清钙值采用原子吸收光谱法测定。根据标准品测定样品的生物活性：由第一次世界卫生组织专业会议确定的降钙素标准品为猪2000Umg、鲑2700Umg。,（4）作用与用途降钙素的主要功能是降低血钙。由于降钙素有抑制破骨细胞活力的作用，所以能抑制骨盐的溶解吸收，从而阻止钙从骨中释出。血钙高可促使降钙素分泌增加，使血钙降低，血钙低时可促使甲状旁腺素分泌增加而使血钙升高，两者互相制约，共同维持血钙平衡。,（二）蛋白质类药物1、胰岛素胰岛素是世界上第一个人工合成的蛋白质。胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛。胰岛由、和三种细胞组成，其中细胞制造胰岛素，细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在的，进而分解为胰岛素进入血液循环。,（1）结构和性质胰岛素由51个氨基酸组成，有A和B两条链，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，两链之间由两个二硫键相连，A链本身还有一个二硫键。不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个氨基酸及B链C末端的一个氨基酸上。它们随种属而异。但它们的生理功能是相同的。,胰岛素的性质有：牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784。胰岛素的等电点为5.305.35。胰岛素在pH4.56.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。在高浓度锌的溶液中，pH68时胰岛素溶解度急剧下降。2、生产工艺胰岛素在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定。,说明和讨论原料质量和预处理问题工业生产用的原料主要是猪、牛的胰脏。采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。由于胰脏中含有多种酶类，离体后，蛋白水解酶类能分解胰岛素使之失活。因此，要立即深冻，先在30以下急冻后转入20保存备用，如用液氮或干冰速冻，效果更好。浓缩近年来，对改进浓缩设各研究须采用离心薄膜蒸发器，在第一次浓缩后，浓缩液用有机溶媒去脂，再进行第二次浓缩，浓缩溶液受热时间极短，避免了胰岛素效价的损失。,产品纯度在常规的结晶胰岛素中，纯度还是不够的。除了胰岛素主成分外，尚含有其他一些杂蛋白抗原成分。美、英药典主要控制两个指标，即分子量大于胰岛素的蛋白质和胰岛素原。我国常规生产的胰岛素结晶中胰岛素原含量约为20000ppm，而国外一般要求胰岛素原和脱酰胺胰岛素含量应为10ppm和1000ppm以下，因此还有一定差距。用超细SephadexG50凝胶过滤，可使结晶胰岛素进一步纯化。,利用重组DNA技术生产人胰岛素利用重组DNA技术生产人胰岛素已获得成功，目前采用基因工程技术制备人胰岛素有AB链合成法和反转录酶法两条途径。AB链合成法以人工合成的人胰岛素A链和B链基因，分别插入克隆载体质粒所携带的半乳糖苷酶基因中，再将重组质粒导入大肠杆菌，在细胞中进行复制。并在半乳糖苷酶基因的信号序列的控制下，合成mRNA，再翻译出A链和B链蛋白，用溴化氰（CNBr）将A链和B链联接起来组成人胰岛素。,反转录酶法通过胰岛素原的cDNA合成人