L05084朱睿-结题论文

海藻酸钠壳聚糖固定化木瓜蛋白酶合成镇痛多肽内吗啡肽-1作者：朱睿指导老师：何平 副教授（华南农业大学生命科学学院 广州 510642）1引言神经肽在痛觉感受及痛觉调制方面的研究一直是神经科学研究的热点之一。目前，已发现有许多种神经肽在痛觉信息的传递和调制过程中起重要作用，其中最为人们注意的就是内吗啡肽(endomorphin)。内吗啡肽是由美国都蓝大学神经生物学家Zadina等（1997）发现的存在于人体内的一类新的神经肽，共有两种，他们均为四肽结构。第一种是Endomorphixr l (EM-1)，其肽序列为:Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2；第二种是Endomorphixr 2 (EM-2)，其肽序列为:Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2. EM-1和EM-2是当今所知对-阿片受体亲和力和选择性最强的生物活性肽，由于他们同植物中提取的生物碱吗啡具有相同的作用，所以对它的研究可大大丰富人们对吗啡产生作用及成瘾性机制的认识，并很可能为寻找到控制疼痛及纠治某些系统疾病的高效、低毒的新药物提供依据（杨溢秦等，2002）。随着短肽在医学领域的广泛应用，短肽合成方法的研究越来越被人们重视。目前肽合成主要有3种方法:化学法、重组DNA技术、酶法.每种方法都有其优点和缺点。利用酶法合成多肽与化学法和重组DNA技术法比较有诸多优点。它的主要优点表现在：反应条件温和；立体专一性强，避免了在化学法合成中存在的产物消旋问题；不用侧链保护基，几乎无副反应；有机底物在有机溶剂中比在水中溶解性好，而酶不溶于有机介质，因此酶易于回收；由氨基酸合成肽的反应在水中热力学平衡是不利的，如果在有机溶剂中进行，则有利于平衡向形成肽键的方向移动；酶在有机溶剂中比在水中更稳定，而且不存在由于微生物污染而使酶失活的问题等（邢国文等, 1 9 9 8；张学忠，1998；王旭等,1995；Gill et al， 1996；Erbeldinger et al, 1998）。在本研究中，利用IPSAC，以乙腈作为有机介质，探讨Tris-Maleate缓冲液的pH、离子强度、反应温度、反应时间、酶用量等对合成内吗啡肽部分前体Boc-Trp-Phe-NH2二肽的影响和催化内吗啡肽EM-1（Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2）的合成方法。2 材料与方法2.1 试验材料与试剂PA粗酶由广西热带作物研究所提供，部分纯化。壳聚糖（脱乙酰度90）为国产试剂。Boc-Trp、Phe-NH2 、Boc-Tyr-Pro-oMe 、Trp-Phe-NH2、Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2均由西安华辰生物科技有限公司提供；其它试剂为国产分析纯。2.2 溶液配制（1）0.1mol/L pH 5.4 Tris-Maleate缓冲液；（2）0.1mol/L pH 6.0 Tris-Maleate缓冲液；（3）0.1mol/L pH 6.6 Tris-Maleate缓冲液。2.3 实验设备SHA-B型恒温振荡器，PHSJ-4A精密pH计，AB204-N万分之一精密电子天平，磁力搅拌器，LCQDECA液质联用仪（FINNIGAN，美国）。 2.4实验方法2.4.1海藻酸钠壳聚糖固定化木瓜蛋白酶（immobilized papain on sodium alginate - chitosan ,IPSAC）制备IPSAC制备参考郑婉玲等（1998）所述的方法进行。称取2g海藻酸钠溶于100mL pH 7.2 0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液中，再加入1g壳聚糖粉末，微波炉加热至80左右并搅拌均匀,冷却至40左右，加入PA，搅拌。将此混合液缓慢滴入0.5mol/L氯化钙溶液中形成小球，置于冰箱4下30min。使用前用蒸馏水洗涤3次，用粗滤纸吸干。2.4.2 Boc-Trp-Phe-NH2二肽的合成方法在100mL具塞三角烧瓶中，加入Tris-Maleate缓冲液（含0.6 mmol/L EDTA）、Boc-Trp-OH（143.5mg）、Phe-NH2 (81.5mg)、IPSAC、75L -巯基乙醇，用乙腈补齐至10mL。水浴恒温振荡后，过滤，得上清液。2.2.3 Boc-Trp-Phe-NH2二肽脱Boc基团此实验参考黄惟德等（1985）的方法脱Boc基团。将6.2.4.2所得的上清液减压抽干，加入1mL三氟乙酸，振摇溶解，室温下反应45min。减压抽去三氟乙酸，再溶于2mL 90%（v/v）乙腈溶液中，10000rpm离心10min，得上清液,进行HPLC和质谱分析（分析参数同2.2.4）。2.2.4 HPLC和质谱分析参数固定相：HYPERSIL ODS 2（250 mm 4.0mm，5um）；流动相：时间在25分钟之内，流速为1mL/min，1（v/v）甲酸所占流动相体积比例为80至60，乙腈所占流动相体积比例为20至40；紫外检测波长为280nm；进样量为10.0ul（进样前将处理好的样品用孔径为0.22um微孔滤膜过滤）。质谱参数：离子源ESI+，加热毛细管温度270，喷雾电压4.5 Kv，鞘气流速80单位，辅助气流速20单位， 加热毛细管电压15V。2.2.5 Trp-Phe-NH2二肽合成的动力学在100mL具塞三角烧瓶中，加入0.4 mL 0.4 mol/L pH 6.0的Tris-Maleate缓冲液（含0.6 mmol/L EDTA）、6g IPSAC、75L-巯基乙醇，用乙腈补齐至10mL；另加底物Boc-Trp-OH与Phe-NH2，它们浓度梯度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L，。30水浴恒温振荡12h后，过滤，得上清液，脱Boc基团（同2.2.3），10000r/m离心10min，取上清液进行HPLC分析（分析参数同2.2.4）。2.2.6 Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2的合成在5mL具塞离心管中，加入120L 0.4 mol/L pH 6.0 Tris-Maleate缓冲液（含0.6 mmol/L EDTA）、Boc-Tyr-Pro-oMe（2.3mg）、Trp-Phe-NH2 (2mg)、1gIPSAC、25L-巯基乙醇，用乙腈补齐至3mL。30水浴恒温振荡12h后，过滤，得上清液，脱Boc基团（同2.2.3），10000r/m离心10min，得上清液进行HPLC和质谱分析（分析参数同6.2.2.4）。3 结果与分析3.1IPSAC催化Trp-Phe-NH2二肽的合成标样的Trp-Phe-NH2 HPLC与质谱图见图1；IPSAC催化合成的HPLC与质谱图见图2。从HPLC与质谱图可以看出IPSAC成功合成了Trp-Phe-NH2二肽，其分子量为351.1，与标准的分子量一致。图1 Trp-Phe-NH2 标样的HPLC图（左）与质谱图（右）Fig.1 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of the standard sample of Trp-Phe-NH2 图2 IPSAC催化合成的Trp-Phe-NH2 HPLC图（左）与质谱图（右）Fig.2 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of Trp-Phe-NH2 synthesized by IPSAC从表1可以看出pH的R值（R12.9）最大，说明pH对Trp-Phe-NH2的合成影响最大。对Trp-Phe-NH2合成的影响力逐渐递减的因素分别为离子强度（R8.3）、反应时间（R4.7）、溶液含量（R3.6）、反应温度（R3.1）、IPSAC用量（R1.2）。说明IPSAC用量对Trp-Phe-NH2的合成影响最小。通过本试验可知，Trp-Phe-NH2的合成的最佳方案是：乙腈中加入0.4 mL 0.4 mol/L pH 6.0 Tris-Maleate缓冲液，反应温度为30，固定化酶用量为6g，反应时间为12h。以此方案进行实验，得Trp-Phe-NH2 48.7mg，产率为27.8%。表1 IPSAC催化Trp-Phe-NH2二肽合成的正交试验Table 1 The reciprocal cross trial of synthesizing Trp-Phe-NH2 by IPSAC瓶号Number Of bottlepH离子强度Ionic strength/(mol/L)溶液含量solution content/%（v/v）反应温度reaction temperature/酶用量enzyme loading /g反应时间reaction time/h产量yield/mg15.40.223031219.925.40.444062421.935.41.065094816.546.00.224064825.956.00.445091243.266.01.063032426.476.60.243092421.086.60.464034825.196.61.025061218.4105.40.265062417.4115.40.423094821.8125.41.044031220.4136.00.245034828.8146.00.463061244.8156.01.024092426.6166.60.264091215.8176.60.425032421.1186.61.043064820.2K1117.9128.8133.7154.1141.7162.5K2195.7177.9155.5135.7148.6134.4K3121.6128.5146.0145.4144.9138.319.721.522.325.723.627.132.629.725.922.624.822.420.321.424.324.224.223.1R12.98.33.63.11.24.73.2 IPSAC催化合成Trp-Phe-NH2二肽的动力学 IPSAC催化合成Trp-Phe-NH2二肽的动力学见图6.3。从图中计算出Km为3.17mmol/L，Vmax为3.90mgTrp- Phe-NH2/ mLh。图3 IPSAC合成Trp-Phe-NH2二肽的动力学Fig.3 The kinetics of IPSAC synthesizing Trp-Phe-NH23.3 IPSAC催化Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2的合成标样的Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 HPLC与质谱图见图4。IPSAC催化合成的HPLC与质谱图见图5；从HPLC与质谱图可以看出IPSAC成功合成了Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2四肽，其分子量为611.2，与标准分子量一致；得Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 1.23mg，产率为35.2%。图4 Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 标样的HPLC图（左）与质谱图（右）Fig.4 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of the standard sample of Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 图5 IPSAC催化合成的Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 的HPLC图（左）与质谱图（右）Fig.5 HPLC(left) and mass spectrum(right) map of Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 synthesized by IPSAC4 小结4.1IPSAC催化Trp-Phe-NH2的合成本试验以IPSAC作为催化剂，以Boc -Trp-OH和Phe-NH2为底物合成Trp-Phe-NH2，用乙腈作为有机介质，加入0.4 mL 0.4 mol/L pH 6.0 Tris-Maleate缓冲液，反应温度为30，IPSAC用量为2g，反应时间为12h；产率为27.8%。从表6.1可以看出pH的R值（R12.9）最大，说明pH对Trp-Phe-NH2的合成影响最大。对Trp-Phe-NH2合成的影响力逐渐递减的因素分别为离子强度（R8.3）、反应时间（R4.7