基因工程制药

内容,第五节基因的表达第六节基因工程菌的稳定性第七节基因工程菌的发酵(自学)第八节基因工程药物的分离纯化(自学)第九节基因工程药物的质量控制第十节基因工程药物制造实例,第五节基因表达,1、概述2、基因工程对宿主细胞的要求3、宿主细胞的种类,概述,1、基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。2、基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。3、克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。4、进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。,最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。,基因工程对宿主细胞的要求,宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA技术操作；产物的产量、产率高，且易提取纯化。,大肠杆菌枯草芽胞杆菌链霉菌常用有酵母丝状真菌哺乳动物细胞,原核细胞,真核细胞,宿主细胞的种类,主要基因工程表达体系比较,大肠杆菌,特点：1、分子遗传学研究深入，生长迅速,是基因工程研究中采用最多的原核表达体系;2、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，因而造成提取困难;3、真核蛋白质常形成不溶性的包涵体;,4、大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，在应用上受到一定的限制。5、目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。6、大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。,真核基因在大肠杆菌中的表达形式,1、以融合蛋白的形式表达药物基因2、以非融合蛋白的形式表达药物基因3、分泌型表达药物基因,以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。,非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。,优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；缺点：产量不高，信号肽不被切割,1、分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。2、产物蛋白质不能糖基化。3、有很强的胞外蛋白酶对产物降解。因此，它的应用也受到限制。,枯草芽胞杆菌,链霉菌,1、不致病、使用安全；2、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中；3、表达产物可糖基化；4、作为外源性基因表达受到重视。,1、基因组小，世代时间短，无毒性；2、繁殖迅速，可廉价的大规模培养；3、能外分泌，简化了分离纯化工艺；4、产物可糖基化；5、已有不少真核基因成功表达。（干扰素、乙肝抗原）,酵母,1、分泌能力强；2、能正确进行翻译后加工（肽剪切和糖基化），而且糖基化方式与高等真核生物相似；3、有成熟的发酵和后处理工艺；4、丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠。,丝状真菌,1、使产物纯化变得容易。2、产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。3、动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。4、表达的外源细胞均为传代细胞，表达产物是否致癌尚有疑问。,哺乳动物细胞,主要基因工程表达体系比较,什么是包涵体？,第六节基因工程菌的稳定性,一、质粒不稳定产生的原因分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。(常见)结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。二、工程菌的质粒不稳定因素：1、含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；2、这两种菌的生长速率差异的大小。,质粒稳定性的分析方法,样品,不含抗性标记抗生素平板培养基,10-12h,100个菌落,含抗性标记抗生素平板培养基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值(稳定性),工程菌的培养过程：通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案和顺序。,第七节基因工程菌的发酵（自学）,菌种一级种子摇瓶二级种子罐培养扩大培养原料发酵培养灭菌发酵生产代谢产物分离基配制微生物工业发酵过程简图,一、基因工程菌的培养方法,1.补料分批培养：将种子介入反应器中进行培养，经过一端时间后，间歇或连续加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。通常把溶氧控制与加补料结合起来进行。2.连续培养：将种子借入发酵反应器中，搅拌培养基至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释进行不间断的培养。,3.透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养基中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。4.固定化培养：将固定化技术用于工程菌的培养，质粒稳定性大大提高，特别是对分泌型菌种。,二、基因工程菌的发酵工艺,1、培养基的影响碳源对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响。如以甘油为碳源，菌体得率较大，而以葡萄糖为碳源菌体产生的副产物较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用,采用流加措施,控制培养液中葡萄糖的较低浓度,可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。,碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等。,2、接种量的影响接种量：指移入的种子液体积和培养液体积的比例。比例大小响发酵的产量和发酵周期。接种量：量过小，延长菌体延迟期，不利于外源基因的表达，采用大接种量，由于种子液中含有大量水解酶，有利于对基质的利用；量过大，使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。,3、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成水平上。4、溶解氧的影响溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。维持较高水平的DO2值（40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋白产物的形成。,5、诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达。6、pH的影响如采用两段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件。细胞生长期的最佳pH范围在6.8-7.4，外源蛋白表达的最佳pH为6.0-6.5。,三、基因工程菌的培养设备发酵罐组成：发酵罐体、搅拌器、温度控制系统、灭菌系统、空气过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制及连续操作装置。,第八节基因工程药物的分离纯化,一、概述二、基因工程药物的特点三、分离纯化工艺的根据（自学）四、分离纯化的技术,概述,由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。,(1)目的产物在初始原料中的含量较低;(2)含目的产物的初始物料组成复杂；除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；,基因工程药物（生物技术）的特点,(3)目的产物的稳定性差；具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性(4)产物种类繁多；包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。(5)应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。,分离纯化工艺的根据,1、含目的产物的起始物料的特点：利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。（1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；（2）原材料和培养基的来源及其质量；,（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。,3、目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。4、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。,分离纯化的技术,一、分离纯化技术要求二、分离纯化的技术1、细胞破碎与固液分离2、目的产物的分离纯化3、非蛋白质杂质的去除三、常用分离方法的比较,分离纯化技术要求,（1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；（2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；（3）收率要高；（4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；（5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。,（1）细胞收集：离心和膜过滤（2）细胞破碎：机械法-高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。非机械法-酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。（3）固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜过滤。,1、细胞破碎与固液分离,分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术（离子交换层析、反相色谱、亲和层析、凝胶过滤等）。,2、目的产物的分离纯化,离子交换层析（ionexchangechromatographyIEC）离子交换层析的基本原理:通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。,反相色谱（reversedphasechromatography，RPC）和疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）,反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。,常用固定相为硅胶烷基键合相。流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。,疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH68盐水溶液。,在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。,亲和层析（affinitychromatography，AC）,亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。,配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析大体可分三步：配基固定化吸附目的物样品解吸,凝胶过滤,凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。,根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：脱盐和更换缓冲液蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。,3、非蛋白质杂质的去除,DNA、热原质和病毒的纯化方法：DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。,热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除。,第九节基因工程药物的质量控制,一、原材料的质量控制二、培养过程的质量控制三、纯化工艺中的质量控制四、目标产品的质量控制五、产品的保存,一、原材料的质量控制,确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。（1）明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等予以确证；（2）提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分（如启动子、复制子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物；,（3）提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性；（4）阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数，并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；（5）提供插入基因与表达载体两侧端控制区的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。,二、培养过程的质量控制,在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。（1）生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库；,（2）原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性；（3）对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；（4）提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；,（5）培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；以宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品；（6）培养周期结束时，应检测宿主宿主细胞载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。,三、纯化工艺中的质量控制,1、产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热原质都控制在规定限度以下。2、在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。,1、产品的鉴别表4-3重组蛋白质药物产品常用的鉴别方法,四、目标产品的质量控制,（1）肽图分析法（2）氨基酸成分分析（3）部分氨基酸序列分析：N-端15个氨基酸（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定（5）蛋白质二硫键分析2、纯度分析（1）目的蛋白质含量测定（2）杂质：分蛋白类杂质和非蛋白类杂质。见表4-43、生物化学测定4、稳定性考察5、产品一致性的保证,五、产品的保存,1、液态保存（1）低温保存：液态蛋白质样品在-10-20C以下冰冻保存。（2）在稳定pH条件下保存：蛋白质较稳定的pH一般在等电点，且多数蛋白质只有在很窄的pH范围内才稳定。因此对保存液态蛋白质样品时小心调到其稳定的PH范围内。（3）高浓度保存：一般蛋白质在高浓度时比较稳定，因为液态蛋白质容易受水化作用的影响，浓度太低易引起亚基解离和表面变性。（4）加保护剂保存：多元醇、有机溶剂、巯基乙醇、二硫苏糖醇等。,2、固态保存一般蛋白质含水量超过10%时容易失活。含水量降到5%时，在室稳或冰箱中保存均比较稳定，37保存时活性明显下降。长期保存蛋白质的最好方法是制成干粉或结晶。冻干粉或结晶都具有强抗热性和稳定性，放在干燥器中在4可保存相当长的时间。,例如：专利技术生产重组类人胶原蛋白，采用瑞士比欧生物工程公司的发酵灌成套设备，严格按GMP标准生产，年产100公斤医用级人胶原蛋白纯品，100吨化妆品级胶原蛋白水溶液（1%），产品可供医药和医疗器械诸如可注射产品、创伤等药物以及化妆美容产品、保健食品大量之需。,第十节基因工程药物制造实例,一、人干扰素的基因工程制备二、人胰岛素融合蛋白重组菌株的组建（自学）三、乙型肝炎表面抗原重组酵母的组建（自学）四、基因工程在抗生素生产中的应用五、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用六、基因工程在生物制品制造中的应用七、基因工程在新药研究中的应用,一、人干扰素的基因工程制备,一、概述二、基因工程菌的构建三、发酵四、产物的提取和纯化五、质量控制标准和要求,一、概述,干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要，现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。,二、基因工程菌的组建,诱生的白细胞,提取总RNA,通过寡dT-纤维素柱获得寡A的mRNA,蔗糖密度梯度离心提取12s的mRNA,双链cDNA接上dT或dG尾,逆转录成cDNA,pBR322质粒加上dA或dC,pBR322质粒,退火获的杂交质粒转化大肠杆菌扩增杂交质粒筛选抗青霉素但对氨苄用杂交翻译法挑选青霉素敏感细菌克隆含干扰素cDNA克隆将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达,三、发酵,启开种子制备种子液发酵培养粗提精提半成品制备半成品检定分装冻干成品检定成品包装,工程菌：SW-IFN-2b/E.coliDH5，质粒用启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1%蛋白冻0.5%酵母提取物0.5%NaCl。摇床培养30，10h，发酵种子。15L发酵罐培养，30，8h。然后42，3h。离心去上清。,四、产品的提取与纯化,超声破碎，离心，上清超滤浓缩，葡聚糖凝胶分离，经SDS-PAGE检查。在经DE-52纤维柱纯化。,五、质量控制标和要求,半成品检定干扰素效价测定蛋白质含量测定比活性纯度测定相对分子量测定,残余外源性DNA含量测定残余血清IgG含量测定残余抗生素活性测定紫外光谱扫描肽图测定等电点测定除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、