动物细胞工程制药

第三章动物细胞工程制药,本章重点：动物细胞的生理特点；生产用动物细胞的要求和获取方法；动物细胞培养基的种类及各种培养基的特点；细胞计数的方法；动物细胞大规模培养的方法；难点：动物细胞生物反应器的类型及结构特点,第一节概述,细胞工程发展史（了解）18381839年提出细胞学说；1885年用生理盐水培养鸡胚组织，使之存活1897年证明从血液和结蒂组织中分离得到细胞可以在血清和血浆中存活1903年观察懂蝾螈细胞的分裂1907年无菌条件下培养离体的蛙胚神经组织90多年以来细胞培养工作已取得巨大的进展，尽管它还很年轻，但是已成为当今高科技生物工程研究领域不可缺少的一部分，已在国民经济的许多部门，包括制药工业中发挥了巨大的作用。,第一节概述1细胞工程的定义细胞工程(cellengineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖目的：获得新性状、新个体、新物质,2细胞工程的研究范畴,动物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程胚胎工程干细胞与组织工程转基因生物与生物反应器,思考题,名词解释细胞工程填空是一切动、植物生命体的基本组成单位。,第二节动物细胞的形态和生理特征,一、动物细胞的形态动物细胞比原核细胞复杂得多，各种细胞有明确的分工。为了适应其功能的需要，细胞的形态有了相应的变化，即分化。细胞性状各异，有纺锤形的、圆盘形的、立方形的等性状。,1.贴壁细胞生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型；上皮细胞型2.悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。3.兼性贴壁细胞生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。,二、动物细胞的生理特点,细胞的分裂周期长细胞分裂时间为1248h，细胞的分裂周期=间期+分裂期，间期（G1+S+G2），分裂期（M）G1期：46h合成DNA聚合酶RNA合成S期：68hDNA合成G2期：25hDNA量加倍,RNA合成M期：0.51h染色体分裂,2.细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。原代培养有限细胞系无限细胞系4.动物细胞对周围环境十分敏感;对理化因素敏感，如：渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。动物细胞对培养基要求高必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质的合成部位：游离核糖体；粗面内质网的核糖体,由此可见，动物细胞生产药物缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。,思考题,一、填空1.离体培养的细胞可分为两类：、2.所有的细胞都含有无机成分，如水和，以及有机成分，如蛋白质、和。二、问答简述动物细胞的生理特点。,第三节生产用的动物细胞的要求和获得,动物细胞培养是指首先在无菌条件下用消化酶将组织分散成单个细胞，再用培养基制成细胞悬液，使其在体外合适的条件下生长繁殖的技术。一般按以下几个步骤进行：取出细胞所在的组织培养液漂洗干净(用锋利小刀割掉多余部分）切成小组织块置与酶液中分散细胞低速离心洗涤细胞将目的细胞吸移至培养瓶中培养。一、生产用动物细胞的要求原代细胞：-最早使用二倍体细胞系：-以后放宽转化细胞系：-严格要求（担心细胞的核酸会影响人的正常染色体，有致癌危险）,二、生产用动物细胞的获得1、原代细胞：由体内直接取出组织或细胞称为原代细胞。（原代培养即第一次培养，原代培养的细胞大约可以增殖10代）。细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。是直接取自动物组织器官,经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。需要大量动物，费钱费劳力。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞,2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。包括几乎全部的动物，过半数的高等植物。二倍体细胞有正常细胞的特点：染色体组型是2n核型；贴壁依赖接触抑制；可传代培养50代；无致瘤性。,3、转化细胞系：通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。更适合大规模工业化生产特点：细胞分裂不受细胞密度影响，无接触抑制现象，性状不规则具有无限生命力，倍增时间短对培养条件、生长因子要求低获得常用的方法：物理因子：UV、X-射线辐射化学因子：致癌因子，如亚硝酸胍病毒感染：较少用,4.融合细胞系：指两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。如：受精过程。但通常情况下，两个接触的细胞并不会发生融合现象目前常用的融合方法有：（1）仙台病毒融合法：（很少使用）融合过程：病毒加入两种细胞（4）细胞聚集病毒与细胞膜反应，细胞膜被破坏（37）两个细胞连接穿通，周边修复细胞融合（2）聚乙二醇融合法:常用分子量=1000，浓度=50%，PH=8.0-8.2时融合率最高可达100%,（3）电融合法：利用短时间的强电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，而使相邻的细胞的细胞膜发生继发性融合。优点：操作简单，无化学毒性，融合同步，融合率高，可在显微镜下观察全过程。决定因素：电场强度、脉冲宽度、温度、缓冲液的性质（PH、I和渗透压）5.重组工程细胞系可采用基因工程的手段构建各种工程细胞。,四、细胞库的建立,生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（mastercellbank,MCB)生产用细胞库(manufacturerworkingcellbank,MWCB)一、原始细胞库贮存时须有该细胞的详细挡案包括：该细胞系的历史该细胞系的特性对各种有害因子的检查结果,二、生产用细胞库从原始细胞库来的，或从单一安瓿来，或从多个安瓿来即刻混合，经培养扩增再分装储存形成细胞库。需建挡案，进行无菌性无细胞交叉污染的检查。需确定最高使用的传代数。,思考题,一、填空1.常用的细胞融合的方法有、。2.电融合的成功与否取决于、和。3.按我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必需建立两个细胞库：、。二、问答1.生产用的细胞有哪些种类？各具有什么特点？2.什么叫转化细胞？有什么特点？可通过哪些方法获得？3.贮存于MCB的细胞应该有该细胞的详细档案，应包括哪些内容？,第四节动物细胞培养条件和培养基,动物细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,动物细胞在体外培养成功的基本条件：与细胞接触的所有设备、器皿、溶液保持绝对无菌必须有足够的营养供应有适量的氧气供给需及时清理细胞代谢的有害产物有良好的外界环境及时分种，保持合适的细胞密度,一、动物细胞的培养条件,1.器材的清洗和消毒（1）器材的清洗（了解）玻璃器皿的清洗浸泡刷洗浸酸冲洗,常用培养器皿及清洗橡胶制品清洗新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/LNaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/LHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。塑料制品的清洗塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水中过夜，用纱布或棉签和50清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液中15分钟，流水冲洗（15-20遍），蒸馏水浸洗三次，双蒸水中泡24小时，晾干备用。,（2）器材的消毒灭菌物理消毒：如紫外线、干热、湿热和过滤化学消毒：如化学消毒剂、抗生素2.水质细胞培养的水必须进行特殊的处理，才能使用。当前处理水质的方法有：蒸馏、离子交换、电渗透、反渗透、中空纤维过滤等。3.PH：最适PH：7.2-7.4,4.渗透压：最理想的渗透压为290-300mOsm/kg，为调整培养液的渗透压，一般采用加减NaCl的办法。在细胞培养操作中，为保持合适的渗透压和PH，一般都使用平衡盐溶液（BBS），它由无机盐和葡萄糖组成。5.温度：动物细胞最佳培养温度：（370.5）昆虫细胞：276.空气：细胞赖以生存的必要条件之一，故必须给以充足的氧气。当前生产中常常采用不同比例的O2、N2、CO2和空气，根据需要加以使用。,二、动物细胞培养基的种类和组成,动物细胞培养基的研究从发展历史来看，大致可分为3类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。1.天然培养基：是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。,2.合成培养基：人工设计、化学试剂配制的培养基。早期组织培养是利用天然培养基，目前合成培养基已经成为一种标准化的商品，从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的促进了组织培养技术的普及发展。优点：成分明确，组分稳定，可大量生产。尽管品种繁多，但其组成大致如下：（1）氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精、胱。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。,（2）维生素：主要是辅酶、辅基，必不可少。维持细胞生命活动的低分子活性物质。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。（3）糖类：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。（4）无机盐：保持细胞的渗透压，缓冲PH的变化，并积极参与细胞的代谢。细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。,（5）其他成分：有些合成培养基中还加有核酸的前体，氧化还原剂等。一般都需要加入5%-10%的小牛血清。血清的种类小牛血清取自出生1030天的小牛新牛血清取自出生24小时之内的新生牛胎牛血清取自剖腹产的胎牛，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。,血清作用机制：提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白；提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素；提供良好的PH缓冲系统。,3.无血清培养基随着细胞培养的逐渐扩大，无血清培养基的研究已提上日程。优点：提供了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批次之间差异的影响；减少了由血清带来病毒、真菌和支原体的危险；供应充足、稳定；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；较少了血清中蛋白对生物测定的干扰，便于实验结果的分析。,无血清培养基需添加如下几类物质：激素和生长因子：使用最多的是胰岛素结合蛋白：最经常补充的是铁传递蛋白和白蛋白；贴附和伸展因子：纤维结合蛋白、胶原其他有利于细胞生长的因子和元素：包括消除自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素。,培养基的配制（了解）目前在国内市场主要是干粉型，应正确配制，才能保证培养基质量。配制培养基要注意以下问题：认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，有些根据实验需要决定。配制时要保证充分溶解。配制所用的水应是双蒸水或三蒸水，离子浓度很低，三蒸水最佳。所用器皿应严格消毒。配制好的培养基应马上过滤除菌，无菌保存于4。,思考题,一、填空1.细胞培养器材和液体的灭菌方法可分为两类：物理消毒，如、和；化学消毒，如和。2.动物细胞培养最适PH为，最佳温度为。3.动物细胞培养基可分为3类：、二、问答1.要使细胞在体外培养成功要满足哪些基本条件？2.动物细胞培养所用合成培养基主要包括哪些成分？各起什么作用?3.无血清培养基有哪些优点？,第五节动物细胞培养的基本方法,细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种类分为原代细胞和传代细胞，又可根据培养基分为固定培养和液体培养；还可根据培养容器和方式分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、固定化培养等。不管用哪种方法，其基本技术大同小异。,动物机体组织,单个细胞,原代培养,旁栏思考1：,寻根问底,一、细胞分离为了进行细胞培养，首先要从生物体中取得细胞，主要有两种方法：1.离心分离法：一般800-1000r/min，5-10min2.消化分离法:常用胰蛋白酶、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA。二、细胞计数（了解）一般细胞分离制成悬液准备接种前都要进行细胞计数，然后按需要量接种于培养瓶或反应器中。目前常用的计数法有：,1.自动细胞计数器计数：原理：让一定体积的细胞悬液经一小孔，并在两个电极中通过，通过的细胞对电极间的电流产生干扰而使电压发生变化，形成信号被记录下来。优点：计数速度快缺点：无法分辨活细胞和死细胞；会误将细胞结团当作单个细胞，使计数值偏低。,2.血球计数板计数,原理：计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即1625=400小方格。,每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。以大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总细胞数为A，细胞液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总细胞数：1ml=1cm3=1000mm3，为了区别细胞的死活，在计数前可进行细胞染色，常用的染色液有如下几种：肽盼蓝，苯胺黑,3.结晶紫染色细胞核计数法原理：该染液由于具有低渗，并有螯合钙离子的作用，可使细胞分散解离和破碎，细胞核染成蓝色。染色后取样在血球计数板上镜检，计数细胞核即细胞数。常用与微载体细胞培养中4.MTT染色计数法原理：活细胞内的线粒体脱氧酶能将MTT（淡黄色)转化为不可溶的紫色的甲月替结晶，它可溶于脱色液，其色泽的深浅与或细胞的数量成正比，可通过比色法从标准曲线求出细胞数。,三、细胞传代,细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。一般来说，二倍体细胞只能传4050代，而异倍体细胞可无限制的进行传代。,1.悬浮细胞的传代悬浮细胞的传代比较容易，只要加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可。2.贴壁细胞的传代：需经消化液消化后再分种。注意事项：首先确定无污染；加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；消化时间不宜过长，一般室温静置2-5min终止消化要先去掉消化液，然后加入培养基；分钟以20-30万个/ml为宜，每次1传2或1传3；已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次；二倍体细胞传代时应写上传代次数传代后每天或隔一天换液，3-5d要传代一次。,四、细胞的冻存和复苏,1.细胞的冻存当温度降低时，细胞的代谢也降低，从而大大的延长了它的存活期。因此目前为了保存细胞，都采用液氮低温（-196）冻存的方法。该方法可保存几年，甚至几十年。需保护剂，如甘油和二甲基亚砜。注意事项：冻存前一天换液培养；细胞密度以1106-2106个/ml为宜；冻存用培养基应与实际使用的一致；检查安瓿的密封性；标签要写细胞名称，编号和冻存日,2.细胞的复苏（总的要求是快融）注意事项：操作中注意防护，戴面罩和手套；从液氮中取出后，立即丢入37-40温水的搪瓷杯中，并搅动加速融化；用乙醇消毒安瓿外表；尽早除去二甲基亚砜（离心，换新鲜培养液）；隔天观察细胞生长情况，再换液一次。,思考题,一、填空1.根据细胞的种类，细胞培养可分为：、。2.从生物体中获取细胞的方法有两种，即、。3.用血球计数板进行细胞计数时，为了区别细胞的死活，常用的染色液有：、4.细胞冻存时可添加一些保护剂，如：、。二、问答简述细胞冻存和复苏时的注意事项。,第六节动物细胞大规模培养的方法和操作方式,一、培养方法1.悬浮培养指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖性细胞培养，如杂交瘤细胞等。优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，易于扩大培养规模，可借鉴细菌的培养经验。不足：细胞密度较低。,2.贴壁培养必须让细胞贴附于某种基质上生长繁殖的培养方法。适合于一切贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞种类广，可达到高密度培养不足：操作麻烦，需合适的贴壁材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧差，扩大生产的“瓶颈”,3.贴壁-悬浮培养将悬浮培养和贴壁培养二者结合，优势互补，形成的一种培养模式。（1）微载体培养基本原理：利用固体小颗粒作为载体，细胞在载体的表面附着，通过连续搅拌悬浮于培养液中，并形成单层生长、繁殖。由于扩大了细胞的附着面，能充分利用生长空间和营养液，因此大大提高了细胞的生长效率和产量。,优点：具有较高的表面积体积比；生长环境均一，条件易于控制，放大容易；兼具贴壁培养和悬浮培养的优势，而且是均相培养；取样和细胞计数简单；细胞和培养液易于分离；大规模培养只需对微生物搅拌式或气升式培养系统稍加改进即可；适合于培养原代细胞、二倍体细胞株，它对生产重组产品来说是必不可少的有效方法。,理想微载体具备的条件：与细胞有良好的相容性；对细胞无毒性；惰性材料；材料比重为1.030-1.045g/ml；粒径60-250m（溶胀后）；具有好的光学透明性；基质的性质是软性的；可耐120高温，便于高压蒸气灭菌；原料充分，制作简便，价格低廉，可反复使用。,（2）包埋和微囊培养细胞被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内培养的方法。包埋细胞的材料有3大类A.人工合成的高分子聚合物：如聚丙烯酰胺，环氧树脂等。B.糖类：如纤维素，琼脂等。C.蛋白质：如明胶、胶原等。优点：细胞得到保护，避免剪切力的损害可获得较高的细胞密度可使产品浓缩于为囊内，有利于产物的纯化可采用多种生物反应器进行大规模培养。（3）结团培养利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养，可获得高密度的细胞。,二、操作方式无论是悬浮培养、贴壁培养或贴壁-悬浮培养，其操作方式一般可分为以下几种：1.分批式培养：将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出。对于分批式操作，细胞所处的环境时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优条件下，在这个意义上它并不是一种好的操作方式。但由于其操作简便，容易掌握，因而又是最常用的操作方式。,2.半连续式操作当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每隔一段时间取出部分培养物，再补充同样数量的新鲜培养基。总体积保持不变。这种操作方式可以反复收获培养液，对于培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒培养过程比较实用，尤其是微载体培养系统更是如此。例如，采用微载体系统培养基因工程rCHO细胞，待细胞长满微载体后，可反复收获细胞分泌的乙肝表面抗原（HBsAg）制备乙肝疫苗。,3.灌流式操作指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器。一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。优点：细胞处于较稳定的良好环境中；可极大提高细胞密度；产品在罐内停留时间短，可及时收获低温保存；培养基的比消耗率较低，产品质量提高，生产成本降低。,思考题,名词解释分批式操作半连续操作灌流式操作填空1.动物细胞大规模培养主要可分为：、。2.可用于包埋细胞的载体材料大致有3类，即、。问答1.理想的微载体材料应具备哪些条件？2.动物细胞培养的操作方式有哪几种？简述各种方法的特点。,第七节动物细胞生物反应器,动物细胞培养技术能否工业化、商业化，关键在于能否设计出合理的生物反应器。生物反应器是给动物细胞的生长代谢提供一个最优化画的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出最大量、最优质的所需产物。按规模大小可分为：实验规模：100L,理想的动物细胞生物反应器必须具备的基本条件：,1.材料无毒性；2.良好的传质、传热和混合性能；3.密封性能良好；4.能自动检测和调控5.可长期运转6.内面光滑，无死角7.拆转、连接和清洁方便8.成本尽可能低,一、动物细胞生物反应器的类型（掌握各自的特点）1.搅拌式生物