DNA重组技术的基本工具上课.ppt

专题1基因工程,一、基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的生物类型和生物产品,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。,记一记,1.1DNA重组技术的基本工具,3,DNA重组技术的基本工具,工欲善其事,必先利其器.,想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?,1.限制性核酸内切酶“分子手术刀”(1)来源:(2)化学本质：(3)作用(4)作用特点：(5)切割方式,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,错位切：产生两个相同的黏性末端,平切：形成平末端,特异性，即识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。,主要从原核生物,蛋白质,T,磷酸二酯键,A,7,限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。图1-1限制酶识别序列的中心轴线,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,黏性末端,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,EcoRI限制酶的切割：,中轴线,黏性末端,黏性末端,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,平末端,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,SmaI限制酶的切割：,只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切点，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考题：,2、连接酶“分子缝合针”,种类：作用部位：,是磷酸二酯键，,将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,这样一个重组的DNA分子就形成了。,不是氢键。,EcoliDNA连接酶与T4DNA连接酶比较：,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？,双链,单链,在两DNA片段之间形成磷酸二酯键,将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键,都能形成磷酸二酯键二者都由蛋白质构成,记一记,DNA连接酶与DNA聚合酶,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,限制性内切酶与解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（）A.限制性内切酶可以切断a处，DNA连接酶可以连接a处B.DNA连接酶可以连接a处C.解旋酶可以使b处解开D.连接b处的酶可以为DNA连接酶,D,3、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,（1）载体的作用,将外源基因转移到受体细胞中去。运载体对外源基因进行大量复制。,（2）作为载体必须具备的条件,能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。必需是安全的，不会对受体细胞有害。大小应适合，便于提取和操作,记一记,（3）常用的载体,质粒噬菌体衍生物动植物病毒,常用的载体：质粒,复制起始的一段序列,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物细胞中。是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA或细胞核之外自我复制的很小的双链环状DNA分子,不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA,D,议一议,2、能否用SARS病毒作为基因载体？,3、作为载体，若没有切割位点将怎样？,4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？,5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？,1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？,双链DNA,不能,不能进行DNA的重组,载体上应有标记基因,可能造成基因丢失,思考与探究,1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)CTGCA(2)AC(3)GCGTGCG（4）G(5)G(6)GCCTTAAACGTCCG(7)GT(8)AATTCCAG你能用DNA连接酶将它们连接起来？,2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。,27,2、为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？,1、DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列；2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能切开。,4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,29,真核生物的基因由编码区和非编码区组成，两边是非编码区（非编码序列）、中间是编码区（编码序列）。而中间的编码区也由编码序列和非编码序列相间排列组成，其中的编码序列称外显子、而非编码序列称内含子。原核生物的基因也有编码区、非编码区，但是编码区内是连续的编码区列。（注意在原核生物基因中，没有外显子和内含子的概念，即你不能说原核生物的编码区全是外显子）这样的基因转录是，先以编码区其中一条链为模板合成mRNA，这就是前体mRNA，然后有些酶将那些内含子对应的序列切去，把外显子对应的mRNA的序列链接在一起，这就是成熟的mRNA，这就是翻译蛋白质的直接模板了。核糖体结合在上面，并沿其滑动。当遇到AUG（真核生物的起始密码子）或者GUG（原核生物的起始密码子）时，肽链的合成开始，当遇到UAA、UAG、UGA（终止密码子）的时候，肽链合成终止。一句话：编码区（外显子、内含子）和非编码区是基因的结构。起始、终止密码子是mRNA的三个为一组的碱基。,无论真核细胞还是原核细胞其基