张树嘉 丁颖杯复赛

“丁颖杯”大学生课外学术科技作品竞赛参赛作品鸡-防御素AvBD-5真核载体构建及免疫活性的研究张树嘉 林欣欣 王 柳摘 要：AvBD是禽类先天内源免疫防御系统重要组成部分。本文构建了3个重组真核表达载体： pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9和共表达载体pVAX1-SEp9-AvBD5。将3个重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠。用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平，实时荧光定量PCR法检测肠组织中MCP-1基因表达量差异；分离小鼠淋巴细胞，用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群含量变化。在首免后第42天用肠炎沙门氏菌对小鼠攻毒，检测免疫保护效率。结果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠体内刺激免疫应答，产生抗SEp9的特异性抗体，pVAX1-SEp9-AvBD5组的IgG抗体OD450nm与对照组相比最高，达到0.33，同时能诱导肠组织产生MCP-1，引起T淋巴细胞亚群增殖，与对照相比，最高分别为63.17%、43.11%、20.57%。攻毒后pVAX1-SEp9组和pVAX1-SEp9-AvBD5组中小鼠新鲜粪便中SE菌落数与对照组相比明显下降，pVAX1-SEp9-AvBD5组在攻毒后的第4天，粪便中仅含SE 22.90CFU/g。本研究证明了鸡AvBD-5能有效刺激鸡免疫防御系统，增加机体特异性免疫应答能力，提高小鼠对SE感染的保护效率。关键词：鸡-防御素；免疫活性；DNA疫苗；真核载体；双顺反子 1.前言抗微生物多肽（Antibacterial peptide, ABP)是生物机体受到外界微生物侵染时内在防御系统产生的一类防御性肽类活性物质，以对抗外源性病原体感染。抗菌肽富含阳离子氨基酸残基，具有广谱、高效的杀菌活性，被称为“第二防御体系”。Harwig S等在1994年首次从鸡的嗜中性粒细胞中分离提取到3种相似抗菌肽，鸡-防御素（Gallinacin），分别命名为Gal-1、Gal-1和Gal-2。鸡基因组公布后，Xiao等通过基因组扫描的方法对鸡-防御素基因组鉴定得出鸡全基因组共编码13种-防御素，被命名为Gallinacin-1Gallinacin-13。随后Lynn等（2007）又发现了鸡防御素14。随着对禽-防御素研究的进展，鸡-防御素被重新整理命名为AvBD-1 AvBD-14。14 种鸡-防御素基因结构紧凑，大小只有86kb，位于第三号染色体的q3.5q3.7上。鸡-防御素基因含有4个外显子，但是AvBD12最后两个外显子融合在一起，只有3个外显子，编码信号肽，前片段和成熟肽三部分（van Dijk et al, 2008）。鸡-防御素成熟肽富含精氨酸，带正电，分子内有6个半胱氨酸残基，分别在分子内形成1-5、2-4、3-6三对二硫键，构成稳定的反相平行的3股-片层结构CX4-8CX3-5CX9-13CX4-7CC。鸡-防御素的成熟肽都具有两亲性，有疏水的内部空间和带有正电荷的侧链，分子内的高度保守二硫键控制肽的构象变化。二硫键对防御素的抗菌活性无直接作用，但对防御素的功能，如抗蛋白水解和抗趋化作用有重要意义（Wu et al, 2003; Klver et al, 2005; Selsted et al, 2005）。可通过复杂的机制抑制微生物生长或杀死微生物，如防御素抑菌的 “膜孔模型” （Lehrer et al, 1989; Hancock, 1997; Hancock et al, 1999; Oren et al, 1998; Tang et al, 1999; Ganz, 2003; Wang et al, 2003）。鸡-防御素是禽类先天具有的内源性免疫防御系统的重要组成部分，具有免疫调节作用，且有广谱抗菌活性，可抑制或者杀死多种革兰氏阳性和阴性菌、真菌。人工合成的鸡AvBD-9在浓度为3.7 mol/L时对革兰氏阴性菌空肠弯曲菌显现出极强的抗菌活性，在浓度为1.93.7mol/L和1.9 mol/L时分别对革兰氏阳性菌产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和酵母白色念珠菌、啤酒酵母有抑菌能力。但是AvBD-9对于鼠伤沙门氏菌没有杀菌作用（30 mol/L）（van Dijk et al, 2007）。人工合成的鸡AvBD-13有在高浓度（114mol/L）时，才对李斯特菌有杀菌活性。当AvBD-13浓度达到14mol/L和57mol/L时分别对野生型和PhoP（pho P基因，转录激活因子，调控鼠伤寒沙门氏菌毒力岛的表达 ）突变型鼠伤寒沙门氏菌有杀菌作用（Higgs et al, 2005）。体外实验发现，AvBD-5对肠炎沙门氏菌有杀菌活性，且作用活性强于AvBD-4和AvBD-6（Milona et al, 2007）。肠炎沙门氏菌（SE）是引起家禽发病死亡最严重的病原之一。由于对感染动物无宿主特异性，所以常以污染的家禽产品为载体成为人类发生食物中毒的主要病原之一（Hardy, 2004）。商品化SE疫苗由于菌体的内毒素能对鸡产生潜在的危害。SE鞭毛抗原可以作为疫苗（Li et al, 2004）。SE鞭毛抗原由很多组分，最主要成分是FliC抗原，他的主要抗原位点是g.m.位点，又称SEp9（SE FliC-specific 9KDa polypeptid）（Toyota-Hanatani et al, 2009）。Toyota-Hanatani等（2009）研究证明SEp9抗原是一个有效的亚单位抗原，能有效抑制SE在鸡肠道定殖。本文设计构建带有AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，将重组质粒导入小鼠体内，使小鼠获得对SE的抗性，并研究DNA疫苗的保护效应和AvBD-5的免疫活性。由于小鼠-防御素和鸡-防御素在分子结构和生理及免疫功能上都十分相似（宋斯伟, 2005）。因此选用小鼠作为试验动物，为研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作为内源免疫物质的免疫作用免疫活性在家禽养殖业中的应用，将其作为一种高效无毒、无残留的免疫促进剂替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽产品的安全性。2 材料与方法2.1 材料原核基因及真核基因克隆的菌株E.coli DH5、真核基因表达载体pIRES-EGFP为本实验室保存，pCR2.1购于Invitrogen公司，载体真核表达载体pVAX1购于Invitrogen公司。PrimeScriptTM RT 2000 Kit、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒、RT-PCR一步法试剂盒均购自TaKaRa，脂质体LipofectamineTM 2000购于Invitrogen公司。流式细胞术染料标记小鼠单克隆抗体试剂盒PE-Cy5 Hamster Anti-Mouse CD3e、PE Rat Anti-Mouse CD4、FITC Rat Anti-Mouse CD8a均购于美国Becton-Dickinson公司。肠炎沙门氏菌购于中国兽医药品监察所（编号：cvcc 3374）。肠炎沙门氏菌疫苗购自德国罗曼动物保健有限公司。2.2 引物设计和合成根据NCBI数据库中鸡AvBD-5基因序列（登录号：AY621307）和SEfliC鞭毛基因（登录号：M84974）中SEp9基因序列，设计PCR引物。根据真核表达载体pIRES-EGFP载体图谱，设计特异性引物，PCR扩增IRES片段。如表1，引物对AvBD5-P1和AvBD5-P2用于扩增AvBD-5全基因后，再用引物对AvBD5-P3和AvBD5- P4扩增AvBD-5成熟肽基因。SEp1和SEp2引物对用来扩增SEp9基因。本文中扩增的IRES序列来自载体pIRES-EGFP中6661250位，共585bp。根据载体图谱，IRES起始序列中GC重复序列多，且起始部分是BamH I酶切位点，所以5，端引物IRES1选择pIRES-EGFP载体上IRES序列前620644位的片段，再对PCR产物5，端进行BamH1酶切，3，端引物IRES2加上EcoR I 限制性酶切位点。表1用于扩增AvBD-5、SEp9、IRES基因的引物引物名称引物序列酶切位点AvBD5-P1ATGCAGATCCTGACTCTCCTCTTTGCAvBD5-P2TCAGGAATACCATCGGCTCCGGCAGCAGAAAvBD5-P3AGAATTCGCCACCATGCGAGGATTACCCCAGEcoR IAvBD5-P4CCCTCGAGTCAGGAATACCATCGGCTCXh0 ISEp1CCCAAGCTTGCCACCATGGTTGATCTCTTTAAGACCAC3Hind SEp2CCGGGATCCTACTACGTTCACTACAGATGTATAAACATTT3BamHIRES1CTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACBamH1IRES2CG GAATTC TGTGGCCATATTATCATCGTGEcoR I2.3 载体构建从3周龄粤黄鸡舌组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增AvBD-5全序列。用引物对AvBD5-P3和AvBD5- P4，扩增得到AvBD-5成熟肽基因，插入pVAX1，构建重组载体pVAX1-AvBD5。从pGH-SEp9中扩增得到SEp9基因，插入pVAX1，构建重组真核表达载体pVAX1-SEp9。PCR扩增载体pIRES-EGFP得到产物IRES序列，插入已构建的重组真核表达载体pVAX1-SEp9后，AvBD-5成熟肽基因插入IRES序列下游，最终构建得到双顺反子真核载体pVAX1-SEp9-AvBD5。2.4 DNA免疫用去内毒素质粒抽提法获得高纯度无内毒素重组真核表达质粒，作为DNA疫苗免疫动物。随机挑选健康BALB/C小鼠，3周龄（购自广州白云实验动物中心），随机分为6个试验组，如表2。采取后腿股四头肌注射，每次各质粒接种前24h，接种部位注射50L0.5mg/mL盐酸布比卡因稀释液。将各重组质粒分别用灭菌0.01mol/L的PBS稀释至1g/L，每次注射100L/只（王杨, 2005）。对照组同步注射PBS 100L。所有实验组免疫3次，初免后第14天和第28天各加强免疫一次。表2 动物免疫试验分组组别各组名称小鼠数量（只）剂量免疫方式第1组PBS30100L/只选择3周龄小鼠进行免疫。首次免疫后的第14天和第28天，分别加强免疫。第2组pVAX1质粒30100g/只第3组pVAX1-SEp9质粒30100g/只第4组pVAX1-AvBD530100g/只第5组pVAX1-SEp9-AvBD530100g/只第6组SE疫苗30100g/只2.5 ELISA分别于第7，14，21，28，35，42天，取眼眶取血法收集免疫后小鼠外周血，将血液放置2h后常温8 000r/min离心10min，将上层血清移至另一Ep管中，ELISA检测特异性抗体IgG含量。取96孔酶标板，用50ng/mL抗原SEp9蛋白每孔100L包被，4过夜。次日除去孔内液体，洗板3次，每次35min。每孔加入封闭液100L，4封闭过夜，次日弃去孔内液体，洗板同上。每孔加入100L 1:20稀释的待测血清样品，37温育40min后，洗板同上。每孔加入100L1:3500稀释的酶标抗体羊抗鼠IgG，37温育30min，洗板同上。每孔加入100L的TMB，37遮光温育20min后每孔加入50L的2moL/L的硫酸溶液，终止反应。在酶标仪上测定450nm光密度。2.6 荧光定量PCR根据Genebank数据库公布的小鼠-actin-1和MCP-1基因，设计PCR引物，见表3。收集第7，14，21，28，35，42天小鼠盲肠，提取肠组织中RNA，逆转录成cDNA，再根据Premix Ex TaqTM试剂盒，在荧光定量PCR 仪上，完成扩增。表3 实时荧光定量PCR检测引物列表序号引物名称序列（53）1-actin1-1GGCCAGGTCATCACTATTG2-actin1-2GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG3MCP-1-1ATACATTAAAAACCTGGATCGG4MCP-1-2CTTCAGATTTACGGGTCAACTT2.7 CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞的测定采集第7，14，21，28，35，42天小鼠外周血，放入EDTA-K2抗凝管中，室温放置备用。采用三色标记法，用带染料PE-CY5、PE和FITC的抗体分别标记小鼠外周血T淋巴细胞表面的CD3+、CD4+、CD8+，设置通过流式细胞仪检测10 000个T淋巴细胞的亚群的水平。2.8 攻毒保护效率于末次免疫的后2周，进行Se攻毒处理，从各试验组随机捉取5只小鼠，以107CFU/只进行口服攻毒。攻毒后第2天到14天，每隔一天收集约2g新鲜粪便样品，置于4存放备用。将不同时间留取的各样品各称取1g，悬浮于100L的无菌PBS中，震荡混匀，再用PBS稀释10倍，取100L接种到MLCB培养基上37培养24h。计算SE菌落数。3.结果3.1小鼠血清中特异性IgG抗体含量的检测表3.1 不同时间的小鼠血清中IgG抗体的OD450nm吸光值时间/组别PBSpVAX1pVAX1-AvBD5pVAX1-SEp9pVAX1-SEp9-AvBD5SE疫苗7d0.1540.0370.1350.0380.1470.0340.1540.0480.1590.0210.1640.03414d0.1420.0170.1540.0290.1650.0280.1770.0310.1790.0320.2000.03521d0.1570.0340.1590.0160.1770.0340.2040.029 0.2170.049E0.4130.06028d0.1590.0100.1620.0150.1560.0210.2310.048 0.2620.063abcE0.710.064 35d0.1430.0180.1490.0320.1570.0250.2650.016 0.3310.027 ABCdE0.6430.07242d0.1510.0110.1440.0110.1640.0040.2510.018 0.3020.020 ABCdE0.621 0.052注：以上数值均为3个重复样本的平均值（mean SD, n=3）。各数值右上角的小写字母“a、b、c、d”表示差异显著（p0.05），大写字母“A、B、C、D”表示差异极显著（p0.01）。a.表示与PBS组比较差异显著（p0.05）；b.表示与pVAX1组比较差异显著（p0.05）；c.表示与pVAX1-AvBD5组比较差异显著（p0.05）；d.表示与pVAX1-SEp9组比较差异显著（p0.05）；e.表示与SE疫苗组比较差异显著（p0.05）；A.表示与PBS组比较差异极显著（p0.01）；B.表示与pVAX1组比较差异极显著（p0.01）；C.表示与pVAX1-AvBD5组比较差异极显著（p0.01）；D.表示与pVAX1-SEp9组比较差异极显著（p0.01）；E.表示与SE疫苗组比较差异极显著（p0.01）。免疫后，pVAX1- AvBD5组没有明显变化，与阴性对照组无太大差异。pVAX1-SEp9和pVAX1-SEp9-AvBD5试验组血清中抗SEp9特异性IgG抗体的OD450nm吸光值呈上升趋势，在第35天达到最高值，并与阴性对照组相比，差异性显著（p0.01）。但是pVAX1-SEp9-AvBD5试验组OD450nm吸光值在试验的任一时间点都高于pVAX1-SEp9组，并且在第35天、42天，与pVAX1-SEp9组相比差异呈显著性（p0.05）。表明pVAX1-SEp9-AvBD5刺激机体产生小鼠血清产生特异性IgG抗体的能力明显强于pVAX1- SEp9试验组。3.2实时荧光定量PCR检测肠组织中MCP-1的表达量图3.1不同试验组小鼠肠组织中MCP-1相对表达量注：*表示与对照PBS组相比差异显著（p0.05）；*表示对照PBS组相比差异极显著（p0.01）pVAX1-SEp9组的小鼠肠组织中MCP-1相对表达量从第21天开始持续增加，并在第42天达到最高值2.49，与对照组相比表达差异极显著（p0.01）。pVAX1-SEp9-AvBD5组在免疫第21天时小鼠肠组织中MCP-1相对表达量略有增加，在第28天明显增长2.91，与对照组相比表达差异显著（p0.05）。在第35天时pVAX1-SEp9-AvBD5组中小鼠肠组织MCP-1相对表达量达到最高值3.97，与对照组相比差异极显著（p0.01），但明显低于SE疫苗组pVAX1-SEp9-AvBD5试验组MCP-1相对表达量在第42天又有所下降，但仍高于第28天。3.3 免疫后小鼠外周血液中CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞的测定表3.2 各样品免疫后外周血液CD3+T淋巴细胞亚群数量（%）时间/组别PBSpVAX1pVAX1-AvBD5pVAX1-SEp9pVAX1-SEp9-AvBD5SE疫苗7d43.3674.22941.80012.12541.9038.95841.9937.29742.1309.66546.2536.25214d40.9705.65739.5108.11342.6707.06246.0606.85350.4934.76653.0234.30821d43.7205.10244.2338.74242.9004.56748.5205.67760.6107.364abc71.37311.00428d41.6906.02142.4604.29945.3675.60054.66310.54757.4405.429Abce70.7602.39735d42.8376.47641.0905.03943.0835.39450.5334.78961.2808.238ABC68.0077.20742d40.7208.73439.4205.88743.6475.26656.8107.34663.1675.069ABC66.1637.019表3.3 各样品免疫后外周血液CD4+T淋巴细胞亚群数量（%）时间/组别PBSpVAX1pVAX1-AvBD5pVAX1-SEp9pVAX1-SEp9-AvBD5SE疫苗7d21.1021.48420.2431.44120.3691.09721.1711.89220.8691.77420.6501.13514d20.8610.67920.1601.98520.6981.61423.0712.26523.0722.267e28.8504.29321d21.2990.88720.4821.16322.4042.18826.0253.19931.0193.929ABCdE41.2413.18728d22.4051.79921.4211.50324.2851.44337.8726.39636.4381.371ABCE56.1405.43535d21.1793.25120.8160.73124.2551.18633.4573.76443.1062.274ABCDE53.0713.93642d21.7831.34721.5102.24427.2262.18538.3122.44939.6601.16646.4170.591表3.4 各样品免疫后外周血CD8+ T淋巴细胞亚群数量（%）时间/组别PBSpVAX1pVAX1-AvBD5pVAX1-SEp9pVAX1-SEp9-AvBD5SE疫苗7d12.4980.58011.8970.22312.1410.72212.4181.85212.2142.11912.1540.25014d12.4331.16612.0271.50812.2832.96912.8531.10912.5802.92913.5410.88021d12.7681.27412.3631.04113.2921.56713.4760.70116.0101.714aBcdE19.4981.46928d13.3271.46712.9192.22513.8682.75116.4031.38716.3520.869E22.4453.73235d12.6150.86512.7441.31714.3421.59416.6731.23117.8601.532Ab21.2474.09942d12.8131.08212.8591.38015.8341.42818.6571.91920.5691.593ABC21.2882.339表3.5 各样品免疫后外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数量（%）时间/组别PBSpVAX1pVAX1-AvBD5pVAX1-SEp9pVAX1-SEp9-AvBD5SE疫苗7d1.6870.0461.7030.1511.6780.0401.7160.1311.7270.1651.7000.10814d1.6910.2101.6800.0461.7280.2641.7950.0831.8820.3162.1240.19221d1.6780.1551.6600.0851.6900.0981.9280.1741.9560.3482.1270.27428d1.6850.0661.6970.3491.7890.2922.3130.3802.2350.200ab2.5220.18835d1.6950.3711.6430.1431.7040.1952.0080.2012.4330.339abc2.5770.65142d1.7100.2011.6960.3381.7280.2072.0660.2321.9330.0912.1970.228注：以上数值均为3个重复样本的平均值（mean SD, n=3）。各数值右上角的小写字母“a、b、c、d”表示差异显著（p0.05），大写字母“A、B、C、D”表示差异极显著（p0.01）。a.表示与PBS组比较差异显著（p0.05）；b.表示与pVAX1组比较差异显著（p0.05）；c.表示与pVAX1-AvBD5组比较差异显著（p0.05）；d.表示与pVAX1-SEp9组比较差异显著（p0.05）；e.表示与SE疫苗组比较差异显著（p0.05）；A.表示与PBS组比较差异极显著（p0.01）；B.表示与pVAX1组比较差异极显著（p0.01）；C.表示与pVAX1-AvBD5组比较差异极显著（p0.01）；D.表示与pVAX1-SEp9组比较差异极显著（p0.01）；E.表示与SE疫苗组比较差异极显著（p0.01）。免疫后，pVAX1-AvBD5组中小鼠外周血T淋巴细胞亚群无明显变化，与阴性对照组无太大差异。而pVAX1-SEp9和pVAX1-SEp9-AvBD5组与阴性对照组相比，小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞都呈上升趋势，CD4+/CD8+也呈上升趋势，且与阴性对照组相比，在第35天或者第42天有显著差异。说明这两个组都能诱导小鼠产生较强的抗体水平，激发Th1和Th2途径两种免疫应答方式。pVAX1-SEp9-AvBD5组中小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+的最高值均高于pVAX1-SEp9组，表明pVAX1-SEp9-AvBD5组更能刺激机体改变小鼠血清产生CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的改变，加强细胞免疫。3.4 攻毒实验检测各组的免疫保护能力图3.16 攻毒后不同实验组小鼠新鲜粪便中SE的菌落数注：*表示与对照PBS组相比差异显著（p0.05）；*表示对照PBS组相比差异极显著（p0.01）由图3.16可见， pVAX1-AvBD5组与PBS组相比，在不同时间粪便中带有的SE菌落数变化不大，无明显差异。pVAX1-SEp9组小鼠的新鲜粪便中所含SE的菌落数比PBS对照组小鼠少，在第8天SE为567.33CFU/g与PBS组相比的菌落数差异显著（p0.05）。pVAX1-SEp9-AvBD5组与PBS组相比，小鼠新鲜粪便中SE的菌落数明显要少。尤其在第2天和第4天，粪便中的SE菌落最少，分别为27.03CFU/g和22.9CFU/g，表明DNA疫苗在攻毒后的前4天保护效力最高，之后开始下降。在第4、6、10天，pVAX1-SEp9-AvBD5试验组，与PBS组相比差异显著（p0.05）；而在第2天和12天时，与PBS组相比差异极显著（p0.01）。但SE疫苗组的SE菌落数远低于pVAX1-SEp9-AvBD5试验组，表明pVAX1-SEp9-AvBD5试验组对小鼠的保护效力低于SE疫苗组。4 讨论本实验将IRES序列插入真核表达载体pVAX1的多克隆位点，可得到双顺反子真核表达载体。该载体可同时表达在IRES的上下游的SEp9和AvBD-5这两个相对独立的基因开放读码框，产生具有自己独立的空间结构和生理活性的两个产物。表达产物在时间和空间上接近，有利于发挥协同作用，也避免了构建多个载体烦琐费力和效率低的不足。但是双顺反子共表达载体pVAX1-IRES，也可能存在IRES后面的读码框的表达效率要低于IRES前面的读码框的问题，使得两个独立的读码框的表达能力并不能完全一致。在动物免疫试验中，pVAX1- AvBD5组的免疫状况无明显变化，与阴性对照差异不大，这可能是因为AvBD-5成熟肽只有42个氨基酸，蛋白分子为4KD左右，难以引起免疫应答反应。而重组质粒pVAX1- AvBD5在体内表达的AvBD-5浓度较低，达不到SE的最小抑菌浓度，并没表现出对SE强的杀菌能力。pVAX1-SEp9组和pVAX1-SEp9-AvBD5组都能刺激小鼠外周血液产生特异性IgG抗体；诱导机体肠道组织产生的MCP-1；诱导的CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群百分含量的升高，CD4+/CD8+比值也最高；对肠炎沙门氏菌的攻毒试验产生保护效果。说明pVAX1-SEp9组和pVAX1-SEp9-AvBD5组都能诱导小鼠产生较强的抗体水平，激发多种免疫应答方式。但是pVAX1-SEp9-AvBD5试验组的免疫效果和保护效力都明显优于pVAX1-SEp9组，提示免疫效果的增强与AvBD-5有关，表明AvBD-5在小鼠体内能诱导免疫应答。由此判断AvBD5能协助抗原SEp9刺激小鼠机体产生免疫作用，增强DNA疫苗的免疫效果，可作为一种有效的新型免疫增强剂应用于DNA疫苗。Zhang等（2010）将鸡-防御素AvBD1与鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因联合构建成多基因联合疫苗，经免疫鸡后发现AvBD1能显著提高特异性抗体产生，刺激CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞增值，表明鸡-防御素AvBD1可作为一种免疫佐剂应用于DNA疫苗中。参考文献：1 宋斯伟. 鼠防御素crptdin 4在小鼠内脏分布及其肠炎模型中表达规律D. 吉林大学, 2005, 2-52Hardy J.Salmonella:a continuing problem. 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