L05072梁日深-结题论文

光温敏核不育水稻育性稳定性的细胞学研究梁日深 叶瀚蔚 吴斌 彭海峰*（华南农业大学生命科学学院 广州 510642）摘要 本研究在对几种不同类型的水稻光温敏核不育系进行育性稳定性人工气候箱鉴定的基础上，进一步对这些不育系的花粉败育过程进行系统的细胞学观察，结果表明诱导无花粉型不育系从不育转为可育的低温持续时间比典败型不育系长，而且无花粉型不育系的花粉败育时期比典败型不育系早。因此，光温敏核不育水稻的育性稳定性除与不育临界温度有关外，还可能与花粉败育时期及类型有关，这可为水稻光温敏核不育系的选育及生产应用提供形态学依据。关键词 光温敏核不育水稻；育性稳定性；细胞学Cytological studies on the stability of sterility of PTGMS rice Liang Ri-Shen Ye Han-Wei Wu Bin Peng Hai-Feng(College of Life Science the South Argriculture University of China Guangzhou 510642)Abstract: Basing on the identification to sterility stability of different PTGMS rices by using artificial climatec chambers, further cytological studies were conducted on pollen abortion of these male sterile lines. The results showed : to fertility alteration from sterility to fertility under low temperature, non-pollen sterile lines needed longer duration than typical abortion sterile lines. And pollen abortion stage of non-pollen sterile lines is earlier than typical abortion sterile lines. Therefore, the stability of sterility of PTGMS rices maybe related to their pollen abortion stage and types ，which provides the cytomorphological basis for breeding selection and applications in production of PTGMS rices.key word: PTGMS; stability of fertility; cytology光温敏核不育水稻的发现，使两系法利用水稻杂种优势成为可能1。但两用核不育系的育性转换受光、温调控，不育性不够稳定，有可能因温度的异常变化而发生波动，使得制种和繁种都存在一定的风险2，异常低温对光温敏核不育水稻育性的影响已成为两系杂交稻研究和应用中必须加以克服的核心问题。前人为此进行了大量研究，指出提高不育性的稳定性,除了加强不育系的育性提纯防止发生“基因漂移”，进一步降低育性转换的临界温度35外，还应注重育性对低温持续时间的敏感性研究68，筛选出对短期低温反应钝感的不育系，从而降低两系杂交水稻制种风险。本研究以几种不同类型的水稻光温敏核不育系为材料，在利用人工气候箱对这些不育系进行育性稳定性鉴定的基础上，进一步对这些不育系的花粉败育过程进行系统的细胞学观察，研究水稻光温敏核不育的育性稳定性与花粉败育时期及类型的关系，以期为水稻光温敏核不育系的选育及生产应用提供依据。1 材料与方法1.1 试验材料2005年3月中旬至7月中旬，将培矮64S、N2S、N9S、籼S与N28S等光温敏核不育系与常规稻籼黄占分批播种于华南农业大学试验农场。1.2 试验方法1.2.1 诱导不同光温敏核不育系育性转换的低温持续时间长短比较在几种光温敏核不育系同时进入幼穗分化第4期（雌雄蕊形成期）时移入盆中，每个材料6盆，每盆6株。在自然条件下放置3天后移入人工气候箱中，分别进行3天、7天、10天的21低温处理。然后搬出人工气候箱，在室外自然条件下抽穗。各处理材料从始穗起每天随机取当天开花的穗子3穗，放入FAA固定液中，一般持续取样30天。每株5朵颖花经1%I2-KI溶液染色后在显微镜下检测花粉育性，将花粉圆形，大小正常，染色深而均匀的计为正常可育，其它各类均计为败育，包括典败、圆败、染败和无花粉。各处理所得的花粉可育率进行反正弦代换，然后用SPSS10.0统计软件进行分析。人工气候箱内的具体条件为日均温21（变温19-25）,人控光长13.5h（4:30-18:00）和11.5h（6:30-18:00），相对湿度75%，光强10000Lux。1.2.2不同光温敏核不育系花粉败育的细胞学观察以常规稻籼黄占为对照，籼黄占与所有不育系分别选取不同发育时期的小穗剪去稃端，放入卡诺固定液固定后，经95%酒精、85%酒精过渡再转入70%酒精冰箱保存。采用常规压片法，醋酸洋红染色观察。部分成熟花药采用I2-IK整体压片观察。2 结果与分析2.1 不同光温敏核不育系的花粉败育类型观察对常规稻籼黄占与几种光温敏核不育系的成熟花药进行I2-IK的整体压片结果表明，对照籼黄占的成熟花药室内充满深染成蓝色的圆形花粉，其花粉育性正常（图1-1）；培矮64S、N2S与N9S的成熟花药室内充满形态不规则的空瘪花粉，属典败型不育系（图1-24）；籼S与N28S的成熟花药室内没有花粉形成，属无花粉型不育系（图1-5，6）。2.2 不同光温敏核不育系对低温持续时间敏感性的差异对不同光温敏核不育系进行3天、7天、10天的21人控低温处理结果表明：典败型不育系培矮64S（表1）、N2S（表2）与N9S（表3）经过3天的持续低温处理开始出现可育花粉，花粉可育率最高可分别达到18.33%、12.33%、16.33%。随着低温处理时间的延长，花粉可育率越来越高，这说明低温对育性转换的影响是伴随着处理时间的增长而加强的，即处理持续时间对育性转换的影响具有一定的累加效应，这与前人的结论一致6；而无花粉型不育系籼S（表4）与N28S（表5）经过7天的持续低温处理花粉可育率仍为0，但花粉败育类型从无花粉型转变为典败型和圆败型；在长达10天的持续低温条件下籼S与N28S才由不育转为可育，最高花粉可育率分别达到89.0%。和89.33%。由以上结果可以看出，无花粉型不育系籼S与N28S比典败型不育系培矮64S、N2S与N9S由不育转为可育需要较长的低温持续时间。因此，无花粉型不育系的不育性可能比典败型不育系稳定。2.3 不同光温敏核不育系花粉败育过程的细胞学观察2.3.1 常规稻籼黄占正常可育花粉的形成和发育过程进入减数分裂时期后，籼黄占小孢子母细胞细线期的染色体呈细线状在核仁一侧凝集成团（图2-1），进入粗线期染色体缩短变粗成条状（图2-2），到终变期极端缩短成颗粒状（图2-3）。染色体到达两极以后，形成二个子核，胞质一分为二，形成二分体（图2-4），并进一步分裂形成四分体（图2-5）。随后，小孢子从四分体中释放出来，单核早期的小孢子较小，呈圆型，壁很薄，核位于中央，细胞质均匀（图2-6）。进一步发育，小孢子体积增大，细胞壁和萌发孔形成（图2-7），接着产生中央大液泡，细胞核被挤向周边（图2-8）。进入单核晚期的小孢子核进行一次有丝分裂，形成生殖核和营养核，成为二核花粉（图2-9），接着生殖核又进行一次有丝分裂，产生二个精子，发育为成熟的三核花粉，成熟花粉呈圆形且染色较深（图2-10）。表1 不同低温持续时间对培矮64S育性转换的影响Table 1 Effect of low temperature of different duration on fertility alteration of Peiai64S抽穗日期(m-d)低温后天数(d)花粉可育率(%) CK花粉可育3天 7天 10天 率(%)7.167.177.187.197.207.217.227.237.247.257.267.277.287.291415161718192021222324252627-0a4.330.33ab11.331.86b-18.331.20b9.001.58a5.670.67ab1.330.33a0a0a0a0a0a-0a12.331.45b14.002.00b35.672.33b-45.002.87b10.330.88b8.001.00a3.670.67a0a0a0a0a-56.674.41c72.671.45c-85.671.76c56.674.41c44.672.91b30.002.87b8.330.88a2.670.33a0a0a00a0a0a0a00a0a0a0a0a0a0a0a注：字母相同表示花粉可育率的平均数在5%水平上差异不显著。表2 不同低温持续时间对N2S育性转换的影响Table 2 Effect of low temperature of different duration on fertility alteration of N2S抽穗日期(m-d)低温后天数(d)花粉可育率(%) CK花粉可育3天 7天 10天 率(%)7.167.177.187.197.207.217.227.237.247.257.267.277.2814151617181920212223242526-0a2.670.33a-10.001.15b12.331.45b8.330.88bc5.000.57ab1.330.58a0a0a0a-0a6.000.58a8.001.16b37.002.64c27.332.33c14.331.20c10.330.33b9.01.00b0a0a0a-23.671.86c86.335.50d75.672.96d65.332.90d50.001.15c27.01.52c6.330.88b0a0a000a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a注：字母相同表示花粉可育率的平均数在5%水平上差异不显著。表3 不同低温持续时间对N9S育性转换的影响Table 3 Effect of low temperature of different duration on fertility alteration of N9S抽穗日期(m-d)低温后天数(d)花粉可育率(%) CK花粉可育3天 7天 10天 率(%)7.167.177.187.197.207.217.227.237.247.257.267.277.2814151617181920212223242526-00a0a5.330.33ab16.331.88b8.330.67ab-0a0a0a-0a4.670.88a12.331.45b35.005.44c15.001.73b5.000.57ab0a0a0a-0a44.333.28b43.333.48c80.002.87d363.06c11.331.86b4.330.67a0a0a00000a0a0a0a0a0a0a0a0a注：字母相同表示花粉可育率的平均数在5%水平上差异不显著。表4 不同低温持续时间对籼S育性转换的影响Table 4 Effect of low temperature of different duration on fertility alteration of XianS抽穗日期(m-d)低温后天数(d)花粉可育率(%) CK花粉可育3天 7天 10天 率(%)7.167.177.187.197.207.217.227.237.247.257.267.277.2814151617181920212223242627-0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a-0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a-42.003.05b45.672.33b89.000.57b79.002.08b15.330.33a5.330.33a0a0a0a0a0a0a00a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a注：字母相同表示花粉可育率的平均数在5%水平上差异不显著。表5 不同低温持续时间对N28S育性转换的影响Table 5 Effect of low temperature of different duration on fertility alteration of N28S抽穗日期(m-d)低温后天数(d)花粉可育率(%) CK花粉可育3天 7天 10天 率(%)7.167.177.187.197.207.217.227.237.247.257.267.277.2814151617181920212223242526-0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a-0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a-51.671.67b82.001.52b89.330.67b55.672.96b35.002.89b13.331.67b0a0a0a0a0a00a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a0a注：字母相同表示花粉可育率的平均数在5%水平上差异不显著。2.3 不同光温敏核不育系花粉败育过程的细胞学观察2.3.1 常规稻籼黄占正常可育花粉的形成和发育过程进入减数分裂时期后，籼黄占小孢子母细胞细线期的染色体呈细线状在核仁一侧凝集成团（图2-1），进入粗线期染色体缩短变粗成条状（图2-2），到终变期极端缩短成颗粒状（图2-3）。染色体到达两极以后，形成二个子核，胞质一分为二，形成二分体（图2-4），并进一步分裂形成四分体（图2-5）。随后，小孢子从四分体中释放出来，单核早期的小孢子较小，呈圆型，壁很薄，核位于中央，细胞质均匀（图2-6）。进一步发育，小孢子体积增大，细胞壁和萌发孔形成（图2-7），接着产生中央大液泡，细胞核被挤向周边（图2-8）。进入单核晚期的小孢子核进行一次有丝分裂，形成生殖核和营养核，成为二核花粉（图2-9），接着生殖核又进行一次有丝分裂，产生二个精子，发育为成熟的三核花粉，成熟花粉呈圆形且染色较深（图2-10）。2.3.2 典败型光温敏核不育系的花粉败育过程对培矮64S花粉败育过程的细胞学观察表明，培矮64S的减数分裂是正常的，四分体（图2-11）形成后胼胝质溶解释放出单核早期小孢子（图2-12），进一步发育为单核晚期小孢子（图2-13），小孢子核进行一次有丝分裂形成二核早期花粉（图2-14），不久核降解、胞质解体（图2-15），形成空瘪的败育花粉，其花粉败育的主要时期在二核早期。对N2S花粉败育过程的细胞学观察表明，N2S的小孢子母细胞经过正常的减数分裂形成四分体（图2-16），随后释放出单核早期小孢子（图2-17），进一步发育至单核中期（图2-18），小孢子出现异常，胞质降解、核解体，到单核晚期已变空看不到核与胞质（图2-19），最后形成不规则的空瘪花粉（图2-20），其花粉败育的主要时期在单核中晚期。对N9S花粉败育过程的细胞学观察表明，N9S的花粉败育过程与N2S基本一样（图2-2125）。所不同的是发育至单核中期后的异常表现为核膜先崩解，核物质与胞质随后解体消失。2.3.2无花粉型光温敏核不育系的花粉败育过程对籼S花粉败育过程的细胞学观察表明，其小孢子母细胞表现异常，没有进行正常的减数分裂。具体表现为：一部分小孢子母细胞粘连与液泡化（图版3-1），小孢子母细胞进行无丝分裂（图3-26）；另一部分小孢子母细胞进入减数分裂，但多数由于染色体的异常凝聚阻滞在细线期（图3-17），少数虽可发育至二分体，却往往由于胞质分裂异常而不能形成正常的二分体、四分体（图3-711）。小孢子母细胞进行无丝分裂与异常胞质分裂的结果是产生大小不同、核数不等的异常细胞（图3-1214），其中包括核分裂多次而胞质不分裂形成的巨大多核细胞（图3-13）。这些异常的细胞或由于液泡化而降解（图3-14），或由于核膜崩解，原生质解体而降解（图3-15，16）。最终所有的细胞解体消失，成熟的花药室内是空的。对N28S花粉败育过程的细胞学观察表明，少数小孢子母细胞能够进行减数分裂，形成正常的四分体并释放出小孢子。但大多数小孢子母细胞不能进行正常的减数分裂：一部分小孢子母细胞液泡化降解消失（图4-1）；一部分小孢子母细胞粘连成环状或形成多核原生质团（图4-24）；一部分小孢子母细胞产生的子细胞粘连在一起不分开，其中包括四分孢子和异常胞质分裂产生的大小不同、核数不等的异常细胞（图4-511），部分异常细胞也可能是无丝分裂（图4-1216）的结果。发育至花药成熟时，所有的细胞消失，形成空的花药室。由以上结果可知，无花粉型不育系籼S与N28S花粉败育的主要时期在减数分裂期。3 讨论对光温敏核不育水稻，尤其是温敏性较强的不育系而言，如何协调制种和繁殖的矛盾始终是困扰广大育种者的难题。如果将不育临界温度提高，虽可解决繁殖的问题，但自然条件下偶发的低温天气很可能使育性波动而导致制种失败；而如果为了确保制种安全将不育临界温度降低，则很可能在自然条件下有限的水稻生长时期内使繁殖变得非常困难。为解决这一矛盾，袁隆平提出了选育低温敏核不育系的育种策略，即将不育临界温度定为24以下，以连续3d低温才能诱导育性发生转换做为选育指标9。在这一育种思路的指导下，选育的一批实用型的不育系正逐步应用于生产。但不同的光温敏核不育系对低温持续时间的敏感性不同6，如果选育的低温敏不育系，其不育临界温度适当提高，但低温处理影响其育性恢复的持续时间仍较长的话，在自然条件下利用不育期制种时同样可以保证安全，毕竟在高于不育临界温度的自然条件下制种时，虽可能会出现低温天气，但出现较长持续时间的低温天气则频率较低。而随着不育临界温度的提高，不育系繁殖就会相对比较容易。因此，选育不育系时除了将不育临界温度作为选育指标外，结合考虑耐受低温持续时间的长短有助于实用光温敏核不育系的选育。本研究结果表明无花粉型不育系籼S与N28S能够耐受10天的低温处理，典败型不育系培矮64S、N2S与N9S只能耐受3天的低温处理。另据前人报道，不育临界温度较高的无花粉型不育系安农S-1能耐受7天的低温处理，也比不育临界温度低的典败型不育系长10。推测不育系耐受