重组DNA技术.ppt

1,RecombinantDNATechnology,重组DNA技术,首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系,2,重组DNA医药产品,3,4,重组DNA技术是对DNA或基因进行操作，又是在分子水平上操作，因此又称为：DNA克隆DNAcloning基因克隆genecloning分子克隆molecularcloning,5,克隆（clone）在细胞学中，指通过无性繁殖过程产生成千上万个与亲代完全相同的子代群体。这一群体中的所有细胞具有完全相同的基因型和表型。（或指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞群体的过程）,细胞学中克隆的概念,6,重组DNA技术的概念（RecombinantDNAtechnology）,应用酶学方法，按照人的意愿，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作组装成新的DNA分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子、以获得该DNA分子的大量拷贝的过程。,7,重组DNA技术（DNA克隆）的主要目的是获得某一基因或DNA的大量拷贝。,不同来源的DNA共价连接形成的新的DNA分子称为重组DNA（RecombinantDNA）。,8,DNA克隆的策略与技术路线,1、获得目的基因/目的DNA2、目的基因与载体的酶切3、目的基因与载体的连接4、重组DNA分子导入受体细胞5、筛选和鉴定含重组DNA分子的受体细胞克隆,9,DNA克隆的基本过程,1、分：分离目的基因2、切：对目的基因和载体适当切割3、接：目的基因与载体连接4、转：重组DNA转入受体菌5、筛：筛选出含有重组体的受菌体,10,HumanInsulinProductionbyBacteria,11,HumanInsulinProductionbyBacteria,6)jointheplasmidandhumanfragment,andcutwitharestrictionenzyme,12,HumanInsulinProductionbyBacteria,Mixtherecombinantplasmidwithbacteria.,Screeningbacterialcellstolearnwhichcontainthehumaninsulingeneisthehardpart.,13,RoutetotheProductionbyBacteriaofHumanInsulin,Afermentorusedtogrowrecombinantbacteria.,Thesinglecellwithmanyrecombinantplasmidsproducestrillionsoflikecellswithrecombinantplasmidandthehumaninsulingene.,14,RoutetotheProductionbyBacteriaofHumanInsulin,Thefinalstepsaretocollectthebacteria,breakopenthecells,andpurifytheinsulinproteinexpressedfromtherecombinanthumaninsulingene.,美国礼来(Lilly)公司优泌林(Humulin),15,第一节基因克隆重要的工具酶,16,限制性核酸内切酶DNA聚合酶Klenow片段逆转录酶TaqDNA聚合酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶,工具酶在重组DNA技术中有特殊的用途,17,一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease，RE，限制酶）,定义:一类能识别双链DNA分子中特定DNA碱基序列，并水解该序列内部或附近的磷酸二酯键的核酸内切酶。,特点:识别特定碱基顺序（限制位点）切割双链DNA（磷酸二酯键）核酸内切酶（内部切割）,18,根据限制性酶的识别切割特性、催化条件以及是否具有修饰酶活性，分为、型。通常所指的限制酶为型限制性内切酶。,（一）限制酶的分类,19,1.I型限制酶:具有限制和修饰活性辅助因子:Mg2+、ATP和SAM识别和切割位点不一致:在DNA链上没有固定的切割位点，一般在识别位点外1Kb至7Kb处随机切割，不产生特异片断。有甲基化作用,20,2.II型限制酶：,即通常所用的限制性内切酶；分子量小。辅助因子:Mg2+切割位点在识别位点内：能识别和切割双链DNA的特异序列，产生特异的DNA片断。无甲基化作用,21,3.III型限制酶：具有限制和修饰活性分子量大切割位点在识别位点3末端外依赖ATP有甲基化作用,22,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序；前三个字母用斜体。,（二）限制酶的命名,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,23,(1)以核酸内切方式水解磷酸二酯键，产生的DNA片段，5端为P基，3端为OH基。(2)识别序列一般为48bp，通常具有回文结构(Palindrome),24,粘性末端（stickyendsorcohesiveends）沿识别序列的对称轴，对DNA的双链同时交错切割，产生具有互补碱基顺序的游离的单链末端。,25,26,识别顺序大小切割几率4bp44=2566bp46=40968bp48=65536,平均相距4n个核苷酸长度出现一个识别顺序,按限制酶识别顺序的大小估算限制酶的切割几率,27,异源同裂酶（isoschizomer）,1、定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2、特点：1）识别相同顺序2）切割位点相同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGGBamHIGGATCCBstIGGATCC,28,同尾酶（isocaudarner）,2、特点：1）识别不同顺序2）切割后的配伍末端相同,1、定义：酶的来源不同，识别序列不同，但切割DNA后可产生相同的粘性末端（称为:配伍末端compatibleend）,29,（四）影响限制酶切割效率的因素,1、底物纯度2、底物甲基化程度3、底物结构4、反应温度5、反应体系组成,30,内切酶的缓冲液：10Tris-HCl、NaCl、MgCI2pH为7.2-7.6离子强度分为三个级别低盐（10mmol/LNaCl）中盐（50mmol/LNaCl）高盐（100mmol/LNaCl）,31,二、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)指以dNTP为底物，催化dNTP聚合生成DNA的一类酶。,32,1、大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolymeraseI，全酶）,分子量为109kD，具有三种活性的多功能酶53聚合酶活性35外切酶活性53外切酶活性用途：(1)用切口平移方法标记DNA探针(2)合成第二条cDNA(3)DNA测序,33,2、Klenow片段（大肠杆菌DNA聚合酶I大片段）,作用：53聚合酶活性35外切酶活性用途：（1）补平或标记5粘端（2）在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成（3）DNA序列测定,34,3、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase),特点：耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度75-80C。具有53聚合酶和53外切酶活性，缺乏35外切酶活性，因而无校正阅读功能。,用途：（1）PCR（2）DNA序列测定,35,4、逆转录酶(ReverseTranscriptase,RTase),特点：以mRNA作为模板,以dNTP为底物，RNA指导的DNA聚合酶(RDDP，RNA-dependentDNApolymerase)种类：禽成髓细胞瘤病毒（AMV）Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV),用途：（1）逆转录合成cDNA（2）补平或标记5粘端（3）DNA测序（4）制备探针,36,37,38,三、DNA连接酶(DNAligase),作用：催化两个相邻DNA片段的3-OH与5磷酸基之间形成3，5磷酸二酯键。种类：T4DNA连接酶(辅助因子ATP)大肠杆菌DNA连接酶(辅助因子NAD+),39,四、修饰酶,T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase)碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）末端转移酶(terminaltransferase),40,T4多核苷酸激酶(T4polynucleotidekinase),催化将ATP的-磷酸转移到DNA链的5-末端。用途：（1）放射性标记DNA链的5-末端，用于DNA测序或探针制备。（2）将人工接头和其它没有5-末端磷酸的DNA片段磷酸化，用于连接反应。,41,碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）,作用：催化切除DNA、RNA的5磷酸基团种类：BAP（bacterialalkalinephosphatase）CIP（calfintestinealkalinephosphatase）用途：1.从RNA或DNA上除去5磷酸，防止酶切后DNA的自身环化2.与T4多核苷酸激酶联合，用于放射性标记DNA链的5末端。,42,不依赖于模板的DNA聚合酶末端转移酶(terminaltransferase),作用：催化dNTP掺入到DNA的3-OH端用途：1.给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴2.DNA片段的3末端标记,43,（一）RNase用于除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。1.RNaseA除去DNA样品中的RNA分子2.核酸酶S7除去蛋白质合成系统中的内源mRNA,五、核酸酶（nuclease）DNaseRNase,（二）RNaseH作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。,44,（三）DNaseI,1.特点：内切酶，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型（随机切割），产生5-磷酸脱氧寡核苷酸。2.用途：1)切口平移法，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子,45,重组DNA技术中常用的工具酶,46,第二节基因克隆的载体,47,载体的定义：携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具（一类DNA分子）。载体的本质：DNA,48,载体的特征：,1.能自主复制2.具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定3.在细胞中拷贝数高4.有适当的限制性内切酶酶切位点（称多克隆位点，即MCS-multiplecloningsites）,49,载体的分类功能克隆型载体（扩增）表达型载体宿主细胞真核细胞载体(表达/穿梭)原核细胞载体(克隆/表达)载体来源质粒载体、病毒载体、噬菌体载体、昆虫载体等,50,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,51,一、质粒载体,（一）质粒的概念、种类质粒是游离于细菌染色体外的小型双链环状DNA，能自主复制，是赋予细菌的某些特性的辅助性遗传单位。功能并非细菌生长所必需，但对细菌的某些代谢活动和抗药性的表型具有一定的作用。,52,特性：自主复制：能在宿主细胞内独立自主复制转移：可在同种或不同种细菌间转移选择标记遗传特性不相容性：在同一细胞中，同类质粒不能并存的现象。分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，质粒分配到子细胞中。（亲代子代）,53,分类(按复制机理):严密型质粒复制与宿主染色体同步;在细菌中拷贝数低（1-3/cell）松弛型质粒（常用于基因工程克隆）可在无蛋白质合成和染色体复制停止的情况下继续复制;在细菌中拷贝数高(10-200/cell)分子生物学中常用的质粒：松弛型质粒（须经人工改造）,54,质粒载体是在天然质粒基础上经人工改造而成的、携带目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。,（二）常用的质粒载体,1、pBR322,2、pUC18/pUC19,3、pcDNA3.1,55,1、pBR322长度：4.36kb筛选标记：AmprTetr筛选方法：双抗生素对照筛选,56,优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可作为转化子的选择标记。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积10003000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,57,2、pUC18/pUC19,长度:2.69kb筛选标记:AmprLacZ筛选方法:抗生素蓝白筛选,pUC18和pUC19的差别：,多克隆位点方向相反,59,3、pcDNA3.1,真核表达载体筛选标记：Ampr(原核)Neomycin(真核),60,（三）质粒载体的应用,61,克隆载体的用途:,1.保存和扩增小于2kb的DNA片段2.构建cDNA文库3.用于目的DNA的测序4.核酸杂交时的探针来源,表达载体的用途:,表达目的基因（基因治疗，目的基因的研究、重组蛋白质的制备等）,质粒载体的缺陷：插入的外源DNA片段较小(2kb)拷贝数相对较少,62,噬菌体(bacteriophage)是可以感染细菌的病毒,核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴,尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,二、噬菌体载体,63,双链噬菌体（噬菌体：改造噬菌体DNA）gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（替换型，适用基因组克隆）单链噬菌体（M13：改造M13噬菌体DNA，含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,64,（一）噬菌体,1、噬菌体的生物学特性基因组特点：有长12bp的互补粘性末端（cos位点，粘端）,Cos位点（Cohesive-endsite）：DNA为线状双链分子，两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。,cos,DNA合成,头部合成,尾部合成,66,（二）粘粒载体（cosmid）,粘粒：由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建而成（含噬菌体cos区域的质粒）。特点：质粒复制起点限制性内切酶位点抗药性基因噬菌体两端的cos位点优点：相对分子质量小，4-6kb插入能力大，达35-45kb,67,（三）M13噬菌体,M13噬菌体是单链环状DNA分子，感染细菌后，其基因组DNA经复制转变为双链，称为复制型(RF)M13DNA。复制型M13作为模板，产生大量单链DNA，包装到成熟的噬菌体颗粒中被释放。,68,优点：产生单链DNA生物学特性：1.闭环单股正链DNA2.在细菌内形成过渡的双链环状DNA3.以成熟的单链形式分泌到培养基中,69,酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他载体:,70,载体容量:细菌质粒载体2kbM13mp载体4kb噬菌体载体23kb粘粒载体48kbpYAC载体1000kb,71,第三节目的DNA的制备,72,一、目的DNA和目的基因：,目的DNA:要克隆或研究的一个DNA片段,为结构概念目的基因（targetgene）:是DNA分子所包含的遗传信息,为功能概念在重组DNA技术中多使用目的DNA这一概念,73,二、获得目的DNA的常用方法：,直接从基因组DNA获得目的DNA基因文库的构建和筛选PCR方法制备目的DNA化学合成目的DNA,74,（一）直接从基因组DNA获得目的DNA适用于制备原核生物基因，可用内切酶直接酶切后获得。由于真核生物基因组复杂，不能用此法获得目的DNA。,（二）基因文库的构建和筛选目的DNA基因组文库GenomicLibrarycDNA文库cDNALibrary,75,76,（三）PCR方法制备目的DNA直接从染色体DNA进行PCRRT-PCR（mRNA-cDNA-PCR）,（四）化学合成目的DNA要求：已知目的DNA的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。特点：准确性高，合成速度快，长度受限（100nt）,77,第四节目的DNA与载体的体外重组,78,目的DNA与载体在体外连接的过程称为DNA的体外重组。,体外重组的产物称为重组DNA。,79,一、DNA的连接方法,粘端连接平端连接加同聚物尾连接加人工接头连接,80,1.连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,（一）粘性末端的连接,81,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,目录,82,不同限制酶切位点的连接,EcoR切割位点,Bgl切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目录,83,2.定向克隆,定义：使外源DNA片段定向插入到载体分子中的克隆方案叫定向克隆。方案：将外源DNA片段用两种不同的限制性内切酶切割，载体也用相同的两个内切酶切割（双酶切）连接方式：（1）粘-粘（2）粘-平,84,（二）平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端,85,86,（三）同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,87,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,88,（四）人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,89,人工接头及其应用,目录,90,二、连接反应的建立,反应体系：目的DNA载体DNAT4DNA连接酶连接缓冲液（10X）反应条件：温度DNA量酶量,91,连接体系的建立：温度粘末端连接：12-18平末端连接：室温（低于30)DNA量载体分子数:目的基因分子数=1:1-3酶量平端连接时需加大酶量连接时间,92,第五节重组DNA导入宿主细胞,93,重组DNA（重组子或重组体）：携带有目的DNA的载体,宿主细胞真核细胞原核细胞,导入方法转化(transformation)转染(transfection)转导(transduction),94,转导(transduction)通过噬菌体或病毒完成的转化称为转导或感染。,转化(transformation)将外源DNA导入宿主细胞,使其获得新的遗传表型,称为转化。,转染(transfection)外源DNA转化培养的真核细胞称为转染。,95,一、氯化钙法：,原理：细菌在00C，低渗CaCl2溶液中处理后，细胞膜通透性增加，此时可以吸收各种来源的DNA（该状态细胞称为感受态细胞competentcell）。DNA与CaCl2形成羟基-磷酸钙复合物，可粘附于细胞表面，且可抗DNase，经短暂的热休克后DNA易进入细菌细胞内。,96,二、电穿孔法,原理：把悬浮的受体细胞和外源DNA共同置于特定的小杯中，施以高压电脉冲，使受体细胞膜出现瞬间可逆性的孔隙，促使外源DNA分子经过孔隙进入细胞。特点：转化效率高（109-1010/gDNA）,97,三、DEAE-葡聚糖转染技术,DEAE-葡聚糖：(二乙胺基葡聚糖，diehylaminothyl-dextran，DEAE-dextran)一种阳离子高分子多聚物，可与带负电荷的DNA形成复合物，粘附于细胞表面，促进细胞的内吞作用。,98,四、脂质体转染法,由脂质双分子层组成的封闭囊泡，可将DNA包裹在脂质体小囊中,由胞吞介导进入细胞,从而转染细胞。多聚阳离子脂质体：LipofectinTMReagent（Invitrogen）原理聚阳离子脂质体与DNA迅速形成脂质体/DNA阳离子复合物，与带负电荷的细胞膜融合，使DNA进入细胞。效率高于磷酸钙法和DEAE-葡聚糖法,99,五、显微注射法,是指通过显微镜注射法把DNA注入细胞，使外源DNA转入宿主细胞的方法。,100,外源DNA导入真核细胞,101,瞬时状态（transient）：转入细胞内的大部分外源基因，在染色体DNA外存在，12小时之内即可表达，持续80小时后逐渐降解，并从宿主细胞中丢失。,稳定状态（stable）：少数外源DNA进入宿主细胞后，以非特异重组形式重组到宿主染色体上，形成稳定的转化细胞株。,表达方式：,102,第六节重组体的筛选与鉴定,103,一、阳性重组子的遗传学筛选方法,平板筛选抗药性标志筛选法插入失活-互补筛选法,104,（一）抗药性筛选,Ampr（ampicillinresistanse）：氨苄青霉素抗性基因，编码-内酰胺酶，可使氨苄青霉素水解，故具氨苄青霉素抗性。Tetr（tetracyclineresistanse）:四环素抗性基因，编码的蛋白产物(399AAs)可与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。当培养基内含抗菌素时，只有含阳性重组子的细菌可存活，故可进行初步的筛选。,105,106,（三）蓝白斑筛选互补,X-gal：5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷IPTG：异丙基硫代-D-半乳糖苷,107,原理：有些克隆载体，含LacZ的N端1