rnai用于基因功能的鉴定和确证.ppt

,RNAi(shRNA/miRNA)用于基因功能的鉴定和确证,广州复能基因有限公司李华平博士研发部主任,FulenGen,FulenGen,GeneFunctionScreening,MechanismofRNAi(shRNA/miRNA),ComparisonofshRNAandmiRNAproperties,ArchitectureshorthairpinSingle-strandOriginalExogenousEndogenousNo.ofintendedtarget1ManyDegreeofgenesilenceHighLowComplementarytomRNAtargetPerfectImperfectEffectonmRNAEndonucleolyticcleavageRepressedtranslation,shRNAmiRNA,FulenGen,FulenGen,shRNA的设计与构建shRNA的验证miRNA的克隆与检测miRNA靶标的确证基因沉默后的功能拯救,FulenGen,FulenGen,shRNA表达克隆的构建,载体选择筛选标记和报告基因目的细胞,shRNA序列设计高准确性的预测方法茎和环序列,有效性检测3-5个shRNA/基因目的基因是否表达,克隆和测序合成引物的长度茎环结构难以有效测序,保证高表达抑制效率和最低的脱靶效应；慢病毒载体和以哺乳动物细胞表达载体；序列已经过测序；每个基因提供4个克隆，至少有1抑制水平达到70%以上提供包含不规则序列的阴性对照克隆来比较研究。,OmicsLinkshRNA表达克隆,FulenGen,经过验证的人类激酶组shRNA表达克隆350个人类激酶基因的确证shRNA表达克隆表达抑制效应都经过验证，达70以上低的脱靶效应。,FulenGen,shRNA克隆用于信号通路研究,qPCRPrimerarray即将上市,采用先进的算法，精心设计的qPCR引物扩展长度100250bp；PCR扩展效率90%；每对引物的都经过扩展曲线、溶解曲线和电泳检测，包括扩展的特异性,ExonicNon-coding,MicroRNAs由RNAPolymeraseII转录,IntronicNon-codingandcoding,Lee,etal.,EMBOJ.23:4051-602019,/-OH,matureandprimarymicroRNA的结构,Pri-miRNA,DroshaCleavagesite,Mature,Vector-BasedmicroRNAExpressionClones,FulenGen,III型启动子,II型启动子,Vector-BasedmicroRNAExpressionClones,FulenGen,OmicsLinkHumanPrecursormiRNAExpressionClones,pEZ-MR02,650种前体miRNA表达克隆涵盖了miRBase（11.0版本）中已知的678种miRNA的95%miRNA表达框已完全测序确证基于慢病毒载体系统的表达克隆可转染未分化细胞和难转化的细胞，获得与普通分化细胞类似的转染效率提供被转染细胞的存活性的筛选基因，可用于稳定或瞬时表达调控通过应用eGFP可以监测病毒和质粒载体的转染效率,FulenGen,miRNA与肿瘤,miRNA的检测和定量,检测方法NothernblotMicroarrayQuantitativeReal-timePCR,检测对象Primary-miRNAPre-miRNAMaturemiRNA,FulenGen,QuantitativeReal-timePCRdetectmiRNA,polyA加尾法,Loop反转录法,通用性高；适用于同一样本检测多种miRNA经济、方便,特异性高；适用于多个样本中检测同一miRNA价格较高,FulenGen,qPCR检测miRNA的特异性,qPCR检测miRNA的特异性,qPCR检测miRNA困难,采用LNA探针,miRNATarget的分析,研究发现，在哺乳动物中，miRNAs的基因抑制作用是通过其5一段长为68nt的核苷酸与mRNAs3端非翻译区域相结合实现的。一般这段核苷酸位于miRNA序列5的28个nt，被称为seed区。2019年，美国约翰霍普金斯大学发现miR-29b5的6个核苷酸与该miRNA的细胞定位有关。,FulenGen,miRNA5的seed区域在miRNA家族中具有很高的保守性，对脊椎动物的miRNAtarget的识别具有重要的作用，尤其是第2-8个碱基。,FulenGen,针对HDAC5的三个不同版本的算法的microRNA的预测结果,红色表示第三和第四版重叠的microRNA，黄色表示第四和第五版重叠的microRNA,microRNA,Translation,DegradeationOrTranslationinhibition,Light,NoLight,RenillaLuciferasedata,FireflyLuciferasedata,miRNA的编辑及其靶标的变化,miR376a-5p经过编辑后，其靶标的变化,FulenGen,OmicsLinkHumanmiRNATargetSequence(3UTR)ExpressionClones,pEZX-MT01,pEZX-MT02,FulenGen,GaussialuciferaseexpressioninCHOcells,F