普通固态芯片的原理与临床应用.ppt

,普通芯片的原理与临床应用,武汉大学人民医院临床分子诊断中心孙思2018.01,生物芯片概述,基因的结构或种类决定物种,基因的功能或表达则决定生命，即生物的生、老、病、死。基因是通过什么方式导致疾病的呢？基因是通过生物信息传递“DNAmRNA蛋白质”途径决定健康与疾病的。因此又可以说任何疾病都是“信息病”，都与生物信号过强或过弱有关。从生物信息角度看传统医学是在下游信息即机体表型（症状、病理、生理）上获得诊断信息的，而未来医学是从DNA、RNA、蛋白质这些上游信息中获得诊断结果的，更具有确定性和预见性。未来的医学是以生物信息为核心的系统医学，DNA、RNA、蛋白质称为生物信息大分子，其质和量的异常变化与疾病直接相关，是一切疾病的根本原因。,生物芯片概述,低密度基因、蛋白芯片的出现就是针对这种需求而来的。,由于原有的测定方法已不能满足快速处理如此大量的疾病相关信息的需要，产生了生物芯片技术,由于人们需要简便、快速、小型、经济的生物检测技术。,基因芯片是信息时代的产物,分子生物学的发展推动了基因的研究,生物芯片概述,生物芯片是指通过微加工和微电子技术在固相基质表面构建微型生物化学分析系统，以实现对核酸、蛋白质、细胞、组织等进行准确、快速、高通量检测。,根据生物分子之间特异性相互作用的原理，如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生的复性与特异性结合，设计一方为探针，并固定在微小的载体表面，通过分子之间的特异性反应，检测另外一方有无、多少或者结构改变等,生物芯片的特点,高通量、微型化和自动化,高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。微型化：减少试剂用量和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。自动化：降低成本，保证质量。,生物芯片的分类,根据芯片上固定探针不同：基因芯片：寡核苷酸芯片、cDNA芯片蛋白质芯片芯片实验室,按生物芯片材料和支持物类型可分为：固态生物芯片液态生物芯片（悬浮式生物芯片）,生物芯片分类,蛋白质芯片：利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，形成蛋白质微阵列，即蛋白质芯片。如：幽门螺旋杆菌HP抗体谱检测芯片、孕期感染TORCH抗体检测芯片、孕期唐氏综合征筛查芯片、呼吸道六联检测生物芯片等,芯片实验室：高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。,基因芯片：将高密度DNA片段以一定的顺序或排列方式使其固定在如玻璃片等固相表面，用进行过标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及检测等方面研究。,生物芯片的分类,固态生物芯片生物芯片的高密度，样品量很少，杂交信号弱，必须用灵敏度高的光电倍增管或CCD相机来探测信息。固态生物芯片技术的优点是高通量，可并行检测、快速解读；缺点是它的制作工艺复杂、成本昂贵，不宜根据每个不同检测对象制作不同的生物芯片，且点阵不易制作均匀、杂交反应亲和力较弱并需小心冲洗。液态生物芯片（悬浮式生物芯片）以许多不同的微球为主要基质，每种微球上固定不同的探测分子，将这些微球探针悬浮于待测液体中，就构成了一个悬浮式生物芯片系统。悬浮式生物芯片的技术优点是可根据每个检测对象的需要随时进行有目的配置（微球、生物探针），而不是固定的平面微阵列，这将大大降低成本；悬浮式生物芯片也不存在冲洗问题，易于信号检测，而且液相环境有利于保持蛋白分子的天然构像，也更有利于探针和被检测物的反应。缺点在于，不能连续在线监测待测样品中靶标物的浓度。,基因芯片的分类,据不同分类标准,基因芯片的分类如下:(1)根据固相支持物的不同,DNA芯片分为无机(玻璃、硅片、陶瓷等)和有机(聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)芯片。(2)根据芯片上所用探针不同分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。(3)根据芯片点样方式不同,可分为原位合成芯片、微矩阵芯片(分喷点和针点)和电定位芯片3类。(4)根据用途的不同分类为基因表达芯片和基因测序芯片。,基因芯片的原理,核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。,任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列分解成5个8nt亚序列：这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种,假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的nt寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA的互补寡核苷酸序列。,基因芯片的原理,基因芯片技术主要步骤,芯片的制备基片（载体材料）：玻璃片、硅片、瓷片、膜等探针：cDNA、寡核苷酸序列、基因组DNA序列,样品的制备分离纯化DNA/mRNA扩增PCR/逆转录得cDNA标记荧光标记、生物素标记、同位素标记等,杂交标记后的样品双链DNA一般先要经过高温变性为单链DNA再与芯片上的单链寡核苷酸探针杂交。,杂交信号的检测样品与探针杂交反应结束并经洗涤后,完全杂交发生强的荧光信号或特殊波长的信号,不完全杂交则信号较弱,若不能杂交仅能测到芯片原有的荧光信号或检测不到荧光信号。,基因芯片设计,基因芯片设计主要包括两个方面:探针的设计：指如何选择芯片上的探针探针在芯片上的布局：指如何将探针排布在芯片上。,确定芯片所要检测的目标对象：1.查询生物分子数据库：取得相应的DNA序列数据2.序列对比分析：找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。3.数据库搜索：得到关于序列突变的信息及其它信息。,基因芯片设计,例如：DNA变异检测型芯片的设计,对于DNA序列变异分析，最基本的要求是能够检测出发生变异的位置，进一步的要求是能够发现发生了什么样的变化。从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错配出现在探针中心时，辨别能力强，而当错配出现在探针两端时，辨别能力非常弱。所以，在设计检测DNA序列变异的探针时，检测变化点应该对应于探针的中心，以得到最大的分辨率。,固态芯片的实例,人体内代谢药物的主要酶是细胞色素P450超家族（CYP)。CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，在肝脏中有很多表达。P450酶负责代谢的药物中，12%由CYP2C19代谢。,单核苷酸多态(SNP)：基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是决定个体差异的最主要的遗传基础。SNP的存在导致生物个体之间大量功能蛋白不同，这就导致了对药物反应的千差万别。,固态芯片的实例,固态芯片的实例,氯吡格雷本身是一种无活性的前体药物，只有在肝脏中转化为有活性的代谢产物后，才可选择性、不可逆地与血小板膜表面ADP受体（P2Y12）结合，广泛应用于急性冠状动脉综合征（ACS）和经皮冠状动脉支架植入术（PCI）后患者的抗血小板治疗，值得注意的是氯吡格雷抗血小板治疗存在个体化差异。,固态芯片的实例,固态芯片的实例-消化内科,质子泵抑制剂（protonpumpinhibitors,PPIs，H+/K+-ATP酶抑制剂）是目前治疗消化性溃疡最先进的一类药物，它通过高效快速抑制胃酸分泌和清除幽门螺旋杆菌达到快速治疗的效果。,固态芯片的实例,2011年8月24日，美国食品药品管理局(FDA)发布了一则关于抗抑郁药Celexa(西酞普兰，中国商品名喜普妙)的安全通告，称出于对心脏电活动方面不良反应的担忧，禁止继续以高于40mg/d的剂量使用该药。2012年FDA修订西酞普兰安全用药剂量，CYP2C19慢代谢者最大剂量超过20mg/d，则增加血液西酞普兰的水平，增加QT间期延长和尖端扭转的风险。,固态芯片的实例,固态芯片的实例,固态芯片的实例,非对称PCR，35个循环后产物以单链为主；且末端标记有生物素。,第1步预杂交液：清洗芯片表面，为PCR产物杂交提供清洁的环境。（1次5min）,第2步杂交反应液：10uLPCR产物和反应液B与芯片上的探针杂交。（1次30min）,前3列为标志列，10uL反应液B与之完全配对，用于指示杂交仪和杂交显色试剂是否受控。,636G探针，*3位点野生型，对应扩增液2,681G探针，*2位点野生型，对应扩增液1,636A探针，*3位点突变型，对应扩增液2,681A探针，*2位点突变型，对应扩增液1,第2步杂交的结果：由于野生型探针和突变型探针只有1个碱基的差别，所以所有的探针都会被结合上。,第3步洗液1（2次6min）：洗去非特异性结合的PCR产物（以*1/*1为例，与突变探针结合的比较松散，经过洗液1的洗涤，636A和681A上面的PCR产物就会被洗掉，而636G和681G上面的PCR产物，由于完全配对，结合紧密就会被保留）。,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,第4步洗液2（2次5min）：洗去洗液1，以及被洗液1洗涤下来的非特异性结合的PCR产物，为后面的抗体提供结合的环境。,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,第5步抗体（1次20min）：抗体与PCR产物探针复合物结合。,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,生物素,链亲和素,碱性磷酸酶,抗体,第6步洗液2（2次5min）：洗去多余的抗体。,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,生物素,链亲和素,碱性磷酸酶,抗体,第7步洗液3（1次3min）：洗去多余的洗液2，为显色液提供碱性环境。,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,生物素,链亲和素,碱性磷酸酶,抗体,第8步显色液（1次30min）：碱性磷酸酶催化显色液中的底物（BCIP/NBT），发生颜色反应，结果为蓝紫色。,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,生物素,链亲和素,碱性磷酸酶,抗体,BCIP/NBT,首先，扩增产物上的生物素（Biotin）先与链亲和素碱性磷酸酶复合物（Stripavitin-AP）反应，生成新的复合物：Biotin-Stripavitin-AP，后者发生如下的显色反应：Biotin-Stripavitin-AP+BCI-PBCI-OH+Pi（pH7.5）BCI-OH+NBT蓝紫色沉淀其中，BCIP为5溴-4氯-3吲哚磷酸；NBT为硝基四氮唑蓝。,第9步预杂交液（2次2min）：洗去多余的洗液3及显色产物，为扫描提供清洁的背景。识读仪扫描时，识别蓝紫色的位点，并用黄色的点在电脑显示屏上展现。,636G探针,681G探针,636A探针,681A探针,固态芯片的实例,本岗位包含的项目,基因芯片技术的应用,药物合成,太空探索,基因芯片技术在医学中的应用,基因功能表达分析研究基因型、基因突变和多态性分析疾病诊断：遗传性、感染性、肿瘤药物筛选指导用药及治疗方案预防医学,基因芯片的应用-基因功能分析研究,将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。,基因芯片的应用-药物筛选,在基因功能研