基因重组与基因工程1030和112.ppt

,第十四章基因重组与基因工程,姚真真生物化学与分子生物学教研室,Generecombination环状DNA高于线状DNA1000倍电穿孔法：电穿孔仪,（六）重组子的筛选与鉴定,1、阳性菌落筛选：抗药性标志：ampr、tetr、neor插入抗性失活互补筛选：蓝白斑筛选（-互补）、营养缺陷互补分子杂交：原位杂交、southern杂交,2、插入外源性DNA的鉴定：酶切（目的片段长度）PCR测序3、表达蛋白的鉴定：免疫学、生物学活性,抗药性筛选,多克隆位点,启动子,裂开的N端,裂开的N端,外源DNA,半乳糖苷酶N端编码序列,pUC182686bp,pUC182686bp,染色体,重组体pUC18,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养,pUC18,含重组体pUC18的白色菌落,蓝色菌落,含载体pUC18的蓝色菌落,半乳糖苷酶C端编码序列,转化,转化,利用互补原理筛选（兰白斑筛选）重组子pUC18,蓝白斑筛选重组质粒,原位杂交,RadioactiveprobewillhybridizewithitscomplementaryDNA,Washfilter,prepareautoradiographandcomparewithmasterplate,PlacenitrocellulosefilterinsealableplasticbagwithsolutionoflabeledDNAprobe,Southernblot,免疫学方法筛选重组子,DNA重组技术实例：基因文库构建与筛选,人基因组文库构建ConstructionofagenomiclibraryofhumanDNAinabacteriophagelvector.,人基因组DNA用限制性内切酶（Sau3A）部分消化产生约20-kb带粘性末端的部分重叠的随机片段；载体消化：噬菌体DNA用BamH1消化，去掉中间的可置换片段，并产生左右两个带粘性末端的片段基因组片段与噬菌体DNA拼接成重组DNA体外装配有活性的噬菌体，并感染大肠杆菌菌种培养、筛选、扩增保存,InfectE.coli,Individualclones,ProductionofoverlappingrestrictionfragmentsbypartialdigestionofhumangenomicDNAwithSau3A.Thisrestrictionendonucleaserecognizesthe4-bpsequenceGATCandproducesfragmentswithsingle-strandedstickyendswiththissequenceonthe5endofeachstrand.AhypotheticalregionofhumangenomicDNAshowingtheSau3Arecognitionsites(red)isshownatthetop.PartialdigestionofthisregionofDNAwouldyieldavarietyofoverlappingfragments(blue)20kblong.UseofsuchoverlappingfragmentsincreasestheprobabilitythatallsequencesinthegenomicDNAwillberepresentedinallibrary.,Sau3Asites,HumanDNA,20-kbpartialSau3Afragments,cDNA文库构建PreparationofabacteriophagelcDNAlibrary,从文库中筛选目的基因,外源基因在载体上表达必须具备：强的启动子核糖体结合位点翻译起始和终止位点,（七）克隆基因的表达,1、原核表达体系,大肠杆菌、枯草杆菌表达系统优点：方法简单、迅速、经济，适合大规模生产。缺点：但该系统缺乏转录后加工机制，不宜表达真核基因组DNA；缺乏翻译后加工机制，如不能进行糖基化修饰等；表达的蛋白质通常形成包涵体。,酵母、昆虫、哺乳动物细胞表达系统优点：能转录后加工，即能剪接内含子；能翻译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包涵体，能正确折叠。缺点：但技术难度较大，成本较高，表达量较低。,2、真核表达体系,第三节重组DNA与医学的关系,（一）疾病基因的发现（二）生物制药（三）DNA诊断（四）基因治疗（五）遗传病的预防,重组DNA医药产品,重组DNA技术实例:,转基因小鼠（transgenicmouse）,Photographshowingatransgenicmousewithanactiveratgrowthhormonegene(left).Thistransgenicmouseistwicethesizeofanormalmouse(right).,1997年2月23日英国Roslin研究所Wilmut小组在英国自然杂志上发布用成年绵羊的乳腺上皮细胞（体细胞）核移植，获得了一头多莉克隆羊,姓名：Dolly性别：雌种族：哺乳纲，牛科，绵羊生日：1996年7月5日出生地：苏格兰基因父亲：无基因母亲：一只FinnDorset种白绵羊线粒体母亲：一只苏格兰黑脸羊生育母亲：另一只苏格兰黑脸羊进入社交圈时间：1997年2月23日子女：生育6名，存活5名死亡：2003年2月14日,动物克隆,动物克隆技术路线,复习题,概念：重组DNA技术（基因工程）、限制性核酸内切酶、粘性末