人白蛋白重组表达的最新研究进展-ppt.ppt

2011-04-01,1,人血清白蛋白的酵母重组表达研究进展,2011.04.01,2011-04-01,2,人血清白蛋白供需不平衡,监管严格采血站数量下降血液传染病病毒泛滥不再审批新的生产企业进口受到严格限制需求量巨大2011年02月12日有文章称血液制品“告荒”国内血液制品的严重短缺。这类产品，除了人血白蛋白，其他的血液制品如乙肝免疫球蛋白、静脉丙种球蛋白等都处于严重短缺的状态。来源网址：凤凰网财经频道,2011-04-01,3,主要内容,国内外进展酵母表达体系的建立rHSA在毕赤酵母的表达影响酵母表达外源蛋白的因素提高rHSA表达的一些策略rHSA在汉逊酵母中的表达与纯化新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化rHSA结构分析rHSA的应用展望,2011-04-01,4,国内外研究进展,LawnR.M.等在1981年首次报道了重组人血白蛋白(RecombinantHumanSerumAlbumin,rHSA)cDNA序列和首次采用色氨酸(Trp)启动子，色氨酸引导肽及来自质粒pBR322的Tcr和Ampr基因构建了第一个表达重组人血白蛋自的表达载体pHSAI并在大肠杆菌(E.coli)中得到了成功表达。HSA在大肠杆菌中表达量为细胞总蛋白的7%，但由于HSA含有大量的二硫键使得其在体外极难完成正确折叠，未能得到有生物功能的蛋白;同时细菌细胞壁脂多糖造成热反应也带来很多麻烦。,2011-04-01,5,国外研究进展,国外许多实验室和公司在重组白蛋白方面进行了大量研究，如英国的DELTA公司，美国的GENETECH公司以及日本的三菱公司等。日本在重组人血白蛋白方面的研究走在了最前面。1994年日本的绿十字GREENCROSS（三菱公司的前身)公司被批准进人二期临床，现在日本三菱公司已完成三期临床。该公司已经建厂进行大规模生产，一期工程完毕可达12.5吨/年的生产能力，并计划逐步提高到40吨/年，已预定商品名“Albrec”,所生产的产品纯度可达99.999999%,英DELTA公司已经完成一期临床试验，美国等正处于临床前研究阶段。,2011-04-01,6,国内研究进展,近几年来，我国也掀起了重组HSA的研究热潮，华北制药集团、中科院上海生化所、华东理工大学、中山医科大学、中科院微生物所、过程工程研究所，以及安徽中科大亚杰科技股份有限公司等单位己经开始利用基因重组技术生产白蛋白的研究;目前我国在这方面的研究工作已经取得一定进展。华东理工大学郭美锦，储炬等于2000年发表文章称该校生物反应器工程国家重点实验室已经采用Pichiapastoris进行了高密度高表达发酵研究,表达水平已达到5克/升左右。,2011-04-01,7,来源网址：,华北制药：药用基因工程重组人血白蛋白研发及产业化项目华北制药集团新药研究开发有限责任公司从1997年开始采用毕赤酵母作为宿主菌分泌表达重组人血白蛋（rHSA）。经过多年的努力，通过与国内外有关单位协作，已建立了从菌种构建至发酵、纯化的完整工艺。已得到稳定高效表达人血白蛋白的基因工程生产菌株完成了中试研究，开发了具有自主知识产权的纯化工艺路线。制定了重组人血白蛋白的质量标准草案，中试规模制备的样品各项指标检定合格。本项目内容为按照现行CMP要求开发规模生产艺建设药用重组白蛋白生产基地，年生产规模达到吨级。市场分析，白蛋白总销售量为120-150吨左右。,2011-04-01,8,来源网址：,外界传闻：华北制药：马上要公告获得人造白蛋白。事实上有消息源确认重组人血白蛋白马上投产就等批文可以理解为一旦批文下发，马上投产市场价人造白蛋白10克500块公司设计产能15吨15吨产能，预计2010年底建成，2011年初投产新闻：2011中国人血白蛋白制品360产业论坛时间：2011-3-18至2011-3-19地点：上海和颐酒店主办单位：世易传媒,2011-04-01,9,来源网址：,基因重组人血白蛋白与华北制药王平华北制药股份有限公司董事长关于产品简介：重组人血白蛋白未来将成为重磅产品同人血白蛋白相比，重组人血白蛋白不仅纯度更高，而且可以有效地避免人血白蛋白携带病毒的风险，另外还可以解决血源供应的周期性等问题。因此，重组人血白蛋白实现大规模量产在血液制品行业将具有革命意义。受益于国内血制品行业的高景气度，该产品的市场潜力巨大。人血白蛋白市场供应缺口较大，并且这种局面不会在短时间改善。基因重组人血白蛋白是人血白蛋白的替代产品。至今，在国际上掌握重组白蛋白的厂商也只有三家，日本绿十字、英国Delta公司和美国的默克。国内除华北制药外尚无单位能规模化生产重组白蛋白项目。华北制药除培养基级白蛋白外还掌握了更高级别的白蛋白技术，白蛋白产品纯化技术已经达到国际上先进水平。,2011-04-01,10,rHSA表达体系的建立,随着基因重组技术所表达蛋白的复杂性越来越高，酵母作为真核生物具有能对所表达的蛋白进行翻译后修饰，易于大规模培养等优点逐渐取代大肠杆菌生产外源蛋白。在HSA的重组研究过程中，人们分别采用了酿酒酵母、汉逊醉母、裂殖酵母、克鲁维氏酵母、毕赤酵母等作为宿主细胞，以及转基因动物、转基因植物来分泌表达重组人血白蛋白。,2011-04-01,11,人重组白蛋白不同表达体系的对比,2011-04-01,12,酵母表达体系的建立,毕赤酵母由于分泌蛋白量高、表达稳定，且70年代人们曾广泛使用毕赤酵母生产单细胞蛋白，已基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术，采用甲醇诱导强启动子AOX，起始转录人血白蛋白，将表达质粒整合到Pichiapastoris的基因组染色体上，表达质粒不会因酵母传代而丢失，可稳定表达目的产物，且表达量高，用甲醇诱导时，表达率可占分泌总蛋白的80%以上。这非常有利于产物的提取。,2011-04-01,13,酵母细胞表达系统中常用载体,2011-04-01,14,不同酵母表达体系比较,酿酒酵母毕赤酵母汉逊酵母,2011-04-01,15,rHSA常用表达系统中的比较-1,2011-04-01,16,rHSA在不同表达系统中的比较-2,2011-04-01,17,目前除英国DETLA公司采用酿酒酵母作为宿主表达rHSA以外，其他公司和单位普遍采用毕赤酵母作为rHSA的表达宿主。,2011-04-01,18,毕赤酵母表达重组人血清白蛋白,表达系统构建信号序列选择很多异源蛋白分泌表达时已具有成熟蛋白正确的N端氨基酸序列,且大部分分泌表达的异源蛋白是以它们自己同源信号序列引导的,分泌表达rHSA亦可以采用其自身的信号肽序列,即HSA引导肽序列。rHSA的分泌也可用酵母宿主菌本身的同源信号序列，如来自Pichiapastoris的PHO5引导序列和来自S.cerevisiae的-杂交因子(AMF)引导序列。基因剂量表达载体单元插入到宿主菌表达系统时，可采用质粒直接转化到宿主菌细胞中呈附加体型载体(Episomalvector)存在,也可通过线型特异位点整合到酵母菌的染色体上。当外源基因表达单元呈整合型(Integrativetype)存在于染色体上时,因随染色体的复制而复制,遗传极其稳定。,2011-04-01,19,毕赤酵母表达重组人血清白蛋白,rHSA的发酵过程包括二个阶段,以甘油为碳源积累生物量的生长期和以甲醇为碳源的rHSA诱导表达期。甲醇的流加速率控制在培养基中的浓度小于1%,一般诱导表达150300h左右。整个过程的pH控制在610左右,溶氧控制在10%以上。在两段法的发酵条件优化方面,发现将甘油和甲醇混合流加可提高rHSA产量,也就是诱导开始时首先流加甲醇,在确保醇氧化酶被诱导后,开始混合流加。混合流加时严格控制甘油和甲醇的度比例和流加速率,使发酵液中甘油不积累,同时甲醇浓度不超过0.5%。,2011-04-01,20,影响酵母表达外源蛋白的因素,外源基因特性主要涉及外源基因mRNA5端非翻译区、A+T组成和密码子的使用频率外源基因拷贝数和稳定性酿酒酵母和一些其他的酵母有多拷贝的内源质粒是建成高拷贝表达载体基础。克隆位点影响外源基因表达的高效稳定。一般情况下,毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈高,则蛋白表达量愈大。,2011-04-01,21,影响酵母表达外源蛋白的因素,表达条件的优化表达条件的优化主要包括通气量、培养基、摇菌密度、蛋白酶、诱导剂的含量等。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达是极其重要的。有报道认为,如果用发酵罐进行培养,外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶发酵高出10100倍。通过调整培养基的pH值,在培养基中添加1%酪氨酸蛋白水解物等措施来抑制蛋白酶活性,使降解程度减至最低。此外选用蛋白酶缺陷的受体菌是减弱蛋白酶作用的有效方法诱导期间培养基中定期补充诱导剂,对于诱导表达外源蛋白十分重要。如对于毕赤甲醇酵母诱导期间培养基中每天应补加甲醇,以弥补甲醇的消耗和蒸发。诱导时间也是影响外源蛋白表达量的重要因素,诱导时间过短表达量低,诱导时间过长则外源蛋白降解增加,2011-04-01,22,提高表达的一些策略,启动子：最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PGAG,在它的控制下-LabZ基因表达率比甲醇诱导下PAOX1驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1最有潜力的启动子。整合位点：酵母核糖体RNA的基因rDNA在染色体中具有100200个重复,是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一。宿主菌选择：根据利用甲醇的能力不同,巴斯德毕赤酵母菌分为Mut+、Muts和Mut-3种表型。蛋白酶缺失的宿主菌可减少表达蛋白的酶解消化,有利于外源蛋白的稳定。信号肽修饰：信号肽结构的改变(如突变、修饰、融合等)可能会提高分泌效率。有研究发现，改造了的信号肽大大提高了外源蛋白表达量。,2011-04-01,23,降解控制,改造P.pastoris表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定。在培养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,或在培养基中加入YP(酵母提取物+蛋白胨),提供给酵母细胞蛋白酶过量的底物,以减少目的蛋白的降解加入蛋白酶抑制剂毕赤酵母在非缓冲培养基中生长表达,将pH降到3或更低,使得许多中性pH蛋白酶失活共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性,减少目的蛋白降解将目的蛋白连上一个过氧化物酶体靶向信号使其被分拣转运入过氧化物酶体贮存起来,免受蛋白酶降解,还可减少对宿主细胞的毒害作用,2011-04-01,24,重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化,汉逊酵母同巴斯德毕赤酵母一样均是甲基营养型酵母，有相似的特性二者启动子类型、外源基因整合方式、甲醇代谢途径关键酶基因的调控机制、筛选标记等方面存在差异汉逊酵母重组菌遗传性质稳定、表达量和分泌效率高、适合于大规模发酵，是当前国际上公认的最为理想的外源基因表达系统之一国内大连汉信生物制药生产的汉逊酵母重组乙肝疫苗自2004年投放市场由于其更高的抗体水平、更高的阳转率、更高的母婴阻断率而备受市场青睐,2011-04-01,25,重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化,2006年，大连汉信生物制药有限公司与大连理工大学合作开发研究试验方法：优化HSA编码基因密码子选用毕赤酵母最偏爱或次偏爱的密码子对HAS基因密码序列进行优化构建rHSA表达质粒，转化感受态毕赤酵母细胞筛选重组表达株液培，诱导表达，表达产物经SDS-PAGE、Westernblotting分析得到相对高表达的菌株,2011-04-01,26,重组人血清白蛋白在汉逊酵母中的表达与纯化,发酵分离纯化StreamlineSP离子交换层析、PhenylSepharoseHP疏水层析、DEAESepharoseCL-6B阴离子交换层析抗原性分析ELISA、免疫双扩散测定,2011-04-01,27,实验结果,证实rHSA在汉逊酵母中可得到高效表达，在摇瓶培养条件下表达量可占外泌蛋白的80%以上。重组菌经高密度发酵，其表达量可达到1.033g/L，由发酵时间与rHSA浓度关系曲线分析：影响产量和产率的主要因素为蛋白酶的降解作用，降低蛋白酶的降解作用进行发酵条件优化后rHSA表达量会有大幅度提升，可以进行工艺放大研究。分离纯化手段有待提高,2011-04-01,28,人血清白蛋白融合技术研制长效蛋白药物,蛋白融合技术，是通过基因重组手段将蛋白质药物基因与特定的载体蛋白基因融合，由同一调控元件控制基因表达产物，目前使用最多的蛋白载体是和抗体片段。干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有抵抗病毒感染，抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。但是干扰素分子量大约19kDa，易被肾小球滤过，血浆半衰期短而治疗周期长，需要频繁注射给药，患者依从性较低。中国药科大学田硕、姚文兵等报道利用白蛋白融合技术构建了能够分泌表达与高活性新型干扰素（）的融合蛋白的巴斯德毕赤酵母工程菌株，获得了高纯度的长效新型干扰素分子。新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化2010-中国生物工程杂志,2011-04-01,29,新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化,基本步骤：全基因合成质粒：pBluscriptKS（+）-NFIN-HSA合成质粒与毕赤酵母表达载体体pPIC3.5构建重组质粒重组质粒电击转化毕赤酵母、阳性克隆筛选重组毕赤酵母的PCR鉴定重组子的诱导表达HSA-NIFN的纯化Westernblot鉴定重组蛋白质谱和氨基酸序列分析融合蛋白体HAS-NIFN外抗病毒活性测定,2011-04-01,30,“新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化”应用的一部分策略,根据已报道的基因序列及巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因的偏爱密码子，设计了编码HSA-NIFN的全新基因。HSA融合会显著降低IFN的体外生物学活性。将其165位精氨酸突